BÖLÜM 1 Acteoside, C-Fos İndüksiyonunu ve NF-KB Yolunu Engelleyerek ve ROS Üretimini Azaltarak RANKL Aracılı Osteoklastogenezi Bastırır

Seung-Youp Lee^1,2., Keun Soo Lee^3.¤, Deniz Hyun Yi^2., Sung Ho Kook², Jeong-Chae Lee^2,3*

1 Chonbuk Ulusal Üniversitesi Klinik Tıp Araştırma Enstitüsü, Chonbuk Ulusal Üniversite Hastanesi Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jeonju, Chonbuk, Güney Kore, 2 Ortodonti Bölümü, Oral Biyolojik Bilimler Enstitüsü ve Diş Hekimliği Okulu, Chonbuk Ulusal Üniversitesi, Jeonju, Chonbuk, Güney Kore, 3 Biyoaktif Malzeme Bilimleri Bölümü, Biyoaktif Malzemeler Araştırma Merkezi, Chonbuk Ulusal Üniversitesi, Jeonju, Chonbuk, Güney Kore

Soyut

Çok sayıda çalışma, inflamatuar sitokinlerin osteoklastogenez için önemli aracılar olduğunu ve dolayısıyla aşırı kemik rezorpsiyonuna ve osteoporoza neden olduğunu bildirmiştir.Acteoside, ana aktif bileşiğiRehmannia glutinozaGeleneksel Doğu tıbbında yaygın olarak kullanılan , antienflamatuar ve antioksidan potansiyellere sahiptir. Bu çalışmada bulduk kiasteositnükleer faktör-kappaB (NF-kB) ligandının (RANKL) reseptör aktivatörü tarafından uyarılan kemik iliği makrofajlarından (BMM'ler) ve RAW264.7 makrofajlarından osteoklast farklılaşmasını ve oluşumunu belirgin şekilde inhibe etti. Acteoside ön tedavisi ayrıca doza bağlı bir şekilde olgun osteoklastlar tarafından kemik rezorpsiyonunu önledi.Acteoside(10 mM) p38 kinazın, hücre dışı sinyalle düzenlenen kinazların ve c-Jun N-terminal kinazın RANKL ile uyarılan aktivasyonunu zayıflattı ve ayrıca p65 alt biriminin ve inhibitör kBa'nın fosforilasyonunu inhibe ederek NF-kB aktivasyonunu bastırdı. Ek olarak, c-Fos ekspresyonunda ve aktive edilmiş T hücrelerinin nükleer faktörü, sitoplazmik 1 (NFATc1) ve tümör nekroz faktörü-a, interlökin (IL)-1b üretiminde RANKL aracılı artışlar , ve IL-6, görünüşe göre asteosit ön muamelesi ile inhibe edildi. Ayrıca, sözlüasteositovariektominin neden olduğu kemik kaybını ve inflamatuar sitokin üretimini kontrol seviyelerine indirdi. Verilerimiz şunu gösteriyorasteositmitojenle aktive olan protein kinazların ve NF-kB, c-Fos ve NFATc1 gibi transkripsiyon faktörlerinin RANKL ile indüklenen aktivasyonunu baskılayarak osteoklast farklılaşmasını ve osteoklastik öncülerden olgunlaşmayı inhibe eder. Toplu olarak, bu sonuçlar şunu gösteriyor:asteositosteoklast aktivasyonunu bloke ederek kemik kaybını azaltmak için bir anti-emici ajan olarak hareket edebilir.

Daha fazla bilgi için lütfen iletişime geçin:emily.li@wecistanche.com

giriiş

Kemik, dengeli osteoklast ve osteoblast aktivitesi ile sürekli olarak yeniden şekillenir [1]. Osteoklastlar, monosit/makrofaj soyunun hematopoietik öncü hücrelerinden kaynaklanırken, osteoblastlar mezenkimal soydandır [2]. Anormal osteoklast aktivasyonu veya azalmış osteoblastogenez, kemik homeostazını bozabilir ve sonunda osteoporoz, artrit ve kemik kanseri gibi hastalıklara neden olabilir [3,4]. Osteoporoz, kırık riskinde artışa yol açan yaygın bir kemik hastalığıdır. Osteoporozun en yaygın şekli, menopozdaki kadınlarda östrojen eksikliğinden kaynaklanır. Kortikosteroidler ve anti-epileptikler gibi ilaçlar da kemik rezorpsiyonu ve oluşumu arasında bir dengesizliğe neden olabilir ve bu da osteoporoz ile sonuçlanabilir [5]. Bifosfonatlar, kalsitonin, östrojen ve seçici östrojen reseptör modülatörleri dahil olmak üzere birçok anti-emici inhibitör, osteoporozu tedavi etmek için kullanılmıştır. Bu inhibitörler, osteoklast fonksiyonunu inhibe ederek kemik kütlesini korurlar [6]. Östrojen replasman tedavisi, postmenopozal osteoporozu önlemek ve tedavi etmek için en popüler tedavidir. Bununla birlikte, uzun süreli östrojen replasman tedavisi, endometriyal ve meme kanseri riskini artırabilir. Bu nedenle, birçok araştırmacı çabalarını yan etkileri olmayan yeni bir anti-emici ajan geliştirmeye odaklamıştır [7-10]. Osteoklastlar kemik rezorpsiyonunda görev yaptıkları için, çok sayıda çalışmada özellikle osteoklastları inhibe etmek ana hedef olarak kabul edilmiştir. Osteoklastlar, hematopoietik öncü hücrelerin ardışık proliferasyonu, farklılaşması ve füzyonu yoluyla monosit/makrofaj ailesinin mononükleer progenitörleri tarafından oluşturulan çok çekirdekli dev hücrelerdir [11]. Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve nükleer faktör (NF)-kB (RANK)ligand (RANKL) reseptör aktivatörü osteoklast farklılaşması için temel faktörlerdir[12]. Ek olarak, tümör nekroz faktörü (TNF) ve interlökin (IL)-1b gibi birkaç inflamatuar sitokin, RANKL, osteoprotegerin ve M-CSF'nin indüksiyonunu modüle ederek osteoklastogeneze katkıda bulunur [7,13]. RANKL'ın hücre yüzeyi RANK reseptörüne bağlanması, RANKL/RANK/TNFR ile sonuçlanır

cJun N-terminal kinaz (JNK), p38 kinaz ve hücre dışı sinyalle ilişkili kinaz (ERK) dahil olmak üzere NFkB ve mitojenle aktive olan protein kinazları (MAPK'ler) sırayla aktive eden ilişkili faktörler (TRAF) kompleksleri [14]. Bu aktivasyon osteoklast farklılaşması, aktivasyonu ve hayatta kalmasına aracılık etmede anahtar bir rol oynar. RANKL ayrıca osteoklast gelişimi için gerekli olan aktive edilmiş T hücrelerinin nükleer faktörü, sitoplazmik 1 (NFATc1) ve -Fos gibi transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu da aktive eder [ 7,9]. Bu nedenle, RANKL sinyali, osteoklast aktivasyonunu baskılayan ve kemiksiz olan anti-rezorptif ajanların ana hedefi olarak kabul edilir.Acteosidegeleneksel Doğu tıbbında yaygın olarak kullanılan Rehmannia glutinosa'nın ana aktif bileşiğidir [15,16].Acteosidegüçlü bir antioksidandır ve anti-hepatotoksik, anti-inflamatuar ve anti-nosiseptif aktivitelere sahiptir [17-20]. Bunu daha önce buldukasteositERK sinyalini düzenleyerek tirozinaz aktivitesini ve melanin biyosentezini azaltır [21], reaktif oksijen türleri (ROS) aracılı dişeti hasarına[22] karşı korur ve mikotoksin aracılı hücre hasarını bastırır [23]. Bu etkiler yakından ilişkilidirasteositROS'u kaldırma ve MAPK aracılı sinyallemeyi düzenleme yeteneği. Özellikle, ROS'un osteoklastlarda RANKL ile indüklenen sinyal yollarına ve hücresel olaylara aracılık etmesi önerilir. Antioksidanlarla ön tedavi, NF-kB, ERK ve IkBa'nın RANKL ile indüklenen aktivasyonunu inhibe ederek osteoklastogenezi baskıladı [24]. Bu bulgular, anti-enflamatuvar aktiviteye ek olarak ve antioksidan aktivitenin, bir anti-emici ajan için çok önemli olduğunu kuvvetle önermiştir.asteositRANKL ile indüklenen osteoklastogenezi baskılayabilir. Bu çalışmada, olup olmadığını araştırdık.asteositKemik kaybı üzerinde terapötik bir etkiye sahiptir. etkilerini inceledik.asteositin vitro ve in vivo deneysel sistemler kullanılarak osteoklast farklılaşması ve kemik rezorpsiyonu ve ilgili hücresel mekanizmalar üzerine.

asteosit

Malzemeler ve yöntemler

Etik Beyanı

Hayvan bakım ve kullanım uygulamaları, Chonbuk Ulusal Üniversitesi Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımında Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (İzin No. CBU 2010-0007). Bu çalışmadaki tüm deneyler, Üniversitenin Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu'nun yönergelerine göre yapıldı.

Fareler, Kimyasallar ve Laboratuvar Gereçleri

Dört haftalık dişi ICR fareleri OrientBio Inc.'den (Seul, Kore) satın alındı ​​ve yiyecek ve suya serbest erişimi olan 12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde 2261 uC ve yüzde 5565 nemde barındırıldı. Acteoside (3,4-dihidroksi-b-fenetil-Oa-rhamnopyranose syl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (Şekil S1) Rehmannia'nın yapraklarından izole edildi. glutinoza. Acteoside, kullanımdan önce fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözüldü. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 ve M-CSF, Ar-Ge sistemlerinden (Minneapolis, MN, ABD) satın alınmıştır. c-Fos,p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa ve b-aktine özgü antikorlar Santa Cruz Biotechnology'den (Santa Cruz, CA, ABD) elde edildi. ). p-p38 ve p38 antikorları, Cell Signaling Technology'den (Danvers, MA, ABD) satın alındı. Kalsiyum Testi ve Osteokalsin (OC) EIA Kitleri, serum biyokimyasal parametrelerini belirlemek için sırasıyla BioAssay Systems (Hayward, CA, ABD) ve Biomedical Technologies'den (Stoughton, MA, ABD) satın alındı. Serum TRAP5b seviyesini ölçmek için fare tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) Test kiti (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, ABD) de kullanıldı. Aksi belirtilmedikçe, ek kimyasallar Sigma Chemical Co.'dan (St. Louis, MO, ABD) ve laboratuvar malzemeleri SPL Life Sciences'dan (Pochun, Güney Kore) elde edildi.

Hücre Kültürleri

Kemik iliği hücreleri, daha önce tarif edilen yöntemlere göre 6 haftalık dişi ICR farelerinin kaval kemiği ve femurundan elde edildi [25]. Kemik iliği süspansiyonu, 50 ng/ml M-CSF varlığında 100-mm'lik bir kültür tabağında inkübe edildi. 3 gün sonra, osteoklastik farklılaşmayı indüklemek için kemik iliği makrofajları (BMM'ler) olarak yapışık hücreler kullanıldı. Bazı kemik iliği hücreleri de 48 saat M-CSF olmadan inkübe edildi ve yapışık hücreler, başka bir yerde tarif edildiği gibi bir osteoblast farklılaştırıcı ortamda kültürlendi [25]. RAW264.7 makrofaj hücreleri, yüzde 10 fetal bovin serumu (FBS), 2 mM L glutamin ve antibiyotiklerle takviye edilmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamında (DMEM) kültürlendi. Bu hücreler, akteositin osteoklastogenez üzerindeki etkisini araştırmak için BMM'ler için bir karşılık hücre dizisi olarak kullanıldı.

Osteoklastik Farklılaşma ve TRAP Boyama

BMM'ler, 100 ng/ml RANKL ile uyarılmadan önce 2 saat boyunca çeşitli konsantrasyonlarda (0–50 mM) asteosit ile ön işleme tabi tutuldu. Kültür ortamı 2. ve 5. günlerde taze ortam ile değiştirildi. 7 günlük inkübasyondan sonra, kültürler yüzde 4 PBS-tamponlu paraformaldehit içinde sabitlendi ve üreticinin talimatlarına göre bir sigma Aldrich kiti kullanılarak TRAP ile boyandı. TRAP-pozitif hücreler optik mikroskopi kullanılarak sayıldı ve 3 veya daha fazla çekirdek içeren hücreler osteoklast olarak kabul edildi. RAW 264.7 hücreleri ayrıca 2 saat boyunca asteozid ile ön işleme tabi tutulduktan ve 7 günlük inkübasyondan sonra 100 ng/ml RANKL'a maruz bırakıldı, hücreler TRAP boyaması için işlendi.

Hücre Canlılığının Ölçülmesi

Hücre canlılığı, suda çözünür bir tetrazolyum tuzu (WST)-8 reaktifi kullanılarak belirlendi. Kısaca, yüzde 10 FBS ve antibiyotik içeren bir büyüme ortamında kültürlenen BMM'ler veya RAW264.7 hücreleri, 10 mM akteozid veya kersetin, luteolin, apigenin veya epigallocatechin-3-gallat (EGCG) gibi fenolik bileşiklerle işlendi. 48 saatlik inkübasyondan sonra kültürlere WST-8 reaktifi eklendi. 4 saat daha inkübe edildikten sonra, WST-8-spesifik absorbans, bir mikroplaka okuyucu (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, ABD) kullanılarak 450 nm'de ölçüldü.

Kemik Rezorpsiyon Testi

BMM'ler (16105 hücre/ml), 50 ng/ml M-CSF ve 100 ng/ml RANKL içeren a-MEM içinde süspanse edildi, daha sonra kalsiyum fosfat nanokristalleri (OAAS{{6}) ile kaplanmış bir 24-yuvalı plakaya bölündü. }; Osteoklast Aktivite Deneyi Substratı, Oscotec Inc., Choongnam, Güney Kore) 26104 hücre/cm2 yoğunlukta acteoside içeren ve içermeyen. 7 gün inkübe edildikten sonra hücreler yüzde 5 sodyum hipoklorit ile plakalardan çıkarıldı ve optik mikroskop altında çukur oluşumu gözlemlendi. Emilen alan ayrıca bir görüntü analizörü tarafından ölçüldü ve kontrol değerinin yüzdesi olarak ifade edildi.

Western Blot Analizi

Bütün protein lizatları, başka bir yerde tarif edildiği gibi bir lizis tamponunda hazırlandı [26]. Sitosolik ve nükleer proteinler daha önce tarif edildiği gibi hazırlandı [25]. Eşit miktarlarda protein özü, yüzde 12-15 SDS-PAGE ile ayrıldı ve polivinil diflorür membranlar üzerine lekelendi. Lekeler, 1 saat süreyle bloke edici tamponda ikincil antikor ile inkübasyondan önce 4°C'de gece boyunca birincil antikorlarla problanmıştır. Lekeler, geliştirilmiş kemilüminesans (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) ile geliştirildi ve X-ışını filmine (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, ABD) maruz bırakıldı.

MAPK Aktivite Testi

Hücreler, 2 saat boyunca asteozid ile ön işleme tabi tutuldu ve ardından -30 dakika daha RANKL ile uyarıldı. MAPK aktiviteleri, p-p38kinaz test kiti (Assay Designs, Inc., MI, ABD), p-ERK enzim test kiti (Assay Designs) ve p-SAPK/JNK sandviç ELISA kiti gibi immünometrik test kitleri kullanılarak belirlendi( Hücre Sinyal Teknolojisi, MA, ABD). Tüm prosedürler üreticinin talimatlarını takip etti ve absorbans bir mikroplaka okuyucu ile ölçüldü.

Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi (EMSA)

DNA-protein bağlanma reaksiyonları, 1 mg/ml BSA, 0.5 mg/ml poli (dI-dC), yüzde 5 gliserol içeren 20 ml tampon içinde 10-15 mg protein ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gerçekleştirildi. ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mm NaCl, 30,000 [a-32P] dCTP etiketli oligonükleotitlerin ve Klenow fragmanının CPM'si DNA polimerazdan oluşur. Numuneler, kurutulan ve 12-24 saat 270°C'de X-ışını filmine (Eastman Kodak Co.) maruz bırakılan yüzde 6'lık poliakrilamid jeller üzerinde ayrıldı. NF-'ye özgü oligonükleotid primer dizileri 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 ve 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 idi. }}.

NF-kB Lusiferaz Testi

24-kuyulu plakalardaki RAW264.7 makrofajlar, üreticinin talimatlarına göre 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak0.8 mg kB-lusiferaz raportör vektörü ile transfekte edildi. Transfeksiyondan 24 saat sonra hücreler, RANKL ile uyarıldı.asteosit24 saat Hücreler, 100 ml raportör lizis tamponu (Promega, Madison, WI, ABD) içinde yeniden süspanse edildi. Eşit miktarlarda protein numuneleri, kuyucuklu mikroplakalara yerleştirildi ve lusiferaz substratı ile karıştırıldı. Lüminesans, bir mikroplaka lüminometresi (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Almanya) kullanılarak ölçüldü. Bu deneyde, pozitif bir kB inhibitörü olarak geçirgen bir NF-B inhibitör peptidi (BIOMOL, Butler Pike, PA, ABD) kullanıldı.

Sitokinlerin Ölçümü

BMM'ler veya RAW264.7 hücreleri, kuyu kültür plakalarında akteosit varlığında RANKL ile uyarıldı. 48 saatlik inkübasyondan sonra kültür süpernatanları toplandı ve üreticinin talimatlarına göre TNF-a-, IL-1b- ve IL-6-spesifik OptEIATM kitleri kullanılarak ELISA ile değerlendirildi.

Gerçek Zamanlı Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR)

c-Fos, NFATc1 ve TNF-a gibi osteoklastik belirteçlerin mRNA ifadesi, gerçek zamanlı RT-PCR ile belirlendi. Kısaca, toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre (Invitrogen) Trizolreagent ile makrofajlardan ekstre edildi. cDNA, SuperScriptReverse Transkriptaz II ve primerler (Invitrogen) kullanılarak 1 mg toplam RNA ile sentezlendi. Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD), ABI 7500 dizi algılama sistemi (AppliedBiosystems) ile döngü sırasında PCR ürünü birikimini saptamak için kullanıldı. 95uC'de 10 dakika denatürasyondan sonra PCR

Hücre İçi ROS Ölçümü

29,79-diklorodihidrofloresin-diasetat(DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Almanya) stok solüsyonu DMSO içinde hazırlandı ve karanlıkta 220uC'de saklandı. Kısaca, BMM'ler (6-kuyulu plakalarda 106 hücre/ml), 24 saat boyunca 50 ng/MLM-CSF ile kültürlendi ve ardından 100 ile stimülasyondan 2 saat önce çeşitli konsantrasyonlarda (0-10 mM) asteosit ile işlendi. ng/mlRANKL. 1 saatlik ortak kuluçkadan sonra, bu hücreler daha sonra 30 dakika boyunca 25 mM DCFH-DA ile kuluçkalandı. 29,79-diklorofloreseinin (DCF) yeşil flüoresansı, bir FACS VantageH sistemi (Becton-Dickinson, San Jose, CA, ABD) ve 10,000 olay kullanılarak 515 nm'de (FL 1) kaydedildi numune başına sayılmıştır.

Ovariektomiye Bağlı Osteoporozun İndüksiyonu

Bu çalışma için dişi ICR fareleri (6 haftalık) kullanıldı. Farelere anestezi altında sahte bir operasyon (Sham, n=10) veya cerrahi olarak yumurtalıkları alındı ​​(OVX, n=20). Ameliyattan bir hafta sonra, OVX fareleri rastgele her biri 10 fareden oluşan 2 gruba ayrıldı: bilateral OVX ve oral olarak 1 mM asteosit içeren 200 ml PBS ile takviye edilmiş bilateral OVX (AC grubu). Oralasteositameliyattan sonra 8 hafta boyunca 3 günde bir uygulandı ve Sham ve OVX gruplarına aynı miktarda PBS uygulandı. Son uygulamadan 1 gün sonra fareler öldürüldü ve ardından serumdaki biyokimyasal parametreler ve 3-boyutlu kemik yapısı analiz edildi.

Serum Biyokimyasal Parametrelerinin Belirlenmesi

Kardiyak ponksiyon yoluyla kan örnekleri toplandı ve santrifüjleme yoluyla serum toplandı. Serum örnekleri, biyokimyasal parametrelerin analizleri için 280uC'de saklandı. IL-1b ve IL-6'nin serum seviyeleri, yukarıda tarif edildiği gibi ELISA kiti kullanılarak tahmin edilirken, alkalin fosfataz (ALP) aktivitesi, p miktarını ölçen bir biyokimyasal kolorimetrik tahlil kullanılarak belirlendi. -nitrofenol, başka bir yerde açıklandığı gibi bir p-nitrofenol fosfat substratından üretilir [27]. Kemik oluşumu ve emilmesinin biyobelirteçlerini tahmin etmek için serum OC, kalsiyum ve TRAP5b seviyeleri de üreticilerin talimatlarına göre belirlendi.

Kemik Yapısı ve Morfometrik Parametrelerin Analizleri

Farelerin femurları (Sham, OVX ve AC grupları) parçalara ayrıldı ve mekanik test için fizyolojik tuzlu su ile dolduruldu. Femurun mekanik gücü başka bir yerde tarif edildiği gibi ölçülmüştür [28]. Kırık yükü, sağ femur kırığının orta şaftının olduğu noktada Newton cinsinden tepe kuvveti olarak kaydedildi. Ek olarak, her bir hayvanın hafif uyluk kemiği, bir mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) sistemi (SkyScan 1076 mikro odaklı X-ray sistemi, Kontich, Belçika) kullanılarak histomorfometrik olarak analiz edildi. Özetle, yüzde 4 formaldehit deposundaki kemikler, tarama sırasında kurumasını önlemek için plastik streç filme veya parafilme sarılmadan önce kağıt mendil üzerinde yüzeysel olarak kurutuldu. Her plastik sarılı kemik, mikro-CT görüntüleme için 1076 tarayıcı numune odasına dikey olarak yatay olarak monte edilen plastik/polistiren köpük tüplere yerleştirildi. 35 mm çözünürlükte 100 kV kaynak gerilimi ve 140 mA kaynak akımı kullanılarak tarama yapılmıştır. Femurun trabeküler kemiklerinin üç boyutlu modelleri SkyScan CT Analyzer sürüm 1.11 kullanılarak yeniden oluşturuldu. Trabeküler kemik mineral yoğunluğu (BMD, g/cm3), yüzde kemik hacmi (kemik hacmi (BV)/doku hacmi (TV), yüzde ), kalınlık (Tb.Th, mm), ayrılma (Tb.Sp) gibi yapısal parametreler , mm) ve sayı (Tb.N, 1/mm) daha sonra ölçülmüştür.

Osteojenik Farklılaşma ve Mineralizasyon Testi

{{{{10}}}kuyu kültür plakalarında kültürlenen kemik iliği hücreleri, 10 mM ateosit varlığında DAG (10 nM deksametazon, 50 mM askorbik asit ve 20 mM b-gliserofosfat) ile işlendi. 2 haftalık farklılaşmanın ardından hücreler, 1 saat süreyle buz gibi soğuk yüzde 70 (hacim/hacim) etanol ile sabitlendi ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüzde 0,2 alizarin kırmızı Sin distile su ile lekelendi. Hücreler boyandıktan ve havada kurutulduktan sonra hücre kültürü plakaları, ters bir mikroskop (Nikon TS100, Japonya) kullanılarak ışık mikroskobu ile değerlendirildi. Kırmızı boya miktarını ölçmek için leke, 20 dakika çalkalanarak yüzde 10 asetil piridinyum klorür ile yıkandı ve absorbans 560 nm'de ölçüldü. Hücre katmanlarında biriken kalsiyum miktarı da üreticinin talimatlarına göre bir Kalsiyum Kiti (Wako Chemical Inc. Osaka, Japonya) kullanılarak ölçüldü. Ek olarak, runt ile ilgili transkripsiyon faktörü-2(Runx2), osterix, kemik sialoproteini (BSP) ve OC gibi kemiğe özgü mRNA markörlerinin ekspresyonu, gerçek zamanlı RT-PCR ile belirlendi. Bu markörlerin oligonükleotid primerleri, başka bir yerde tarif edildiği gibi PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) kullanılarak 200 bp'den küçük ürün boyutlarıyla tasarlanmıştır[27].

İstatistiksel analiz

Aksi belirtilmedikçe, tüm veriler 3 veya daha fazla bağımsız deneyin ortalama6 standart sapması (SD) olarak ifade edilir. SPSS sürüm 12.0 yazılımı kullanılarak çoklu karşılaştırmalar için tek yönlü bir ANOVA kullanıldı. Bir p değeri ,0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar

Acteoside, Doza Bağlı Bir Şekilde Makrofajlar Tarafından Osteoklast Oluşumunu Engeller

Acteosidin osteoklastlara BMM farklılaşması üzerindeki etkisini doğrulamak için hücreler, 50 ng/ml M CSF ve 100 ng/ml RANKL varlığında 7 gün boyunca çeşitli konsantrasyonlarda (0-20 mM) asteosit ile kültürlendi. . Acteoside, doza bağlı bir şekilde osteoklastların sayısını azaltmıştır. Hücreler, 2 saat boyunca 10 mM asteozid ile ön işleme tabi tutulduğunda, osteoklast sayısı, M-CSF ve RANKL ile takviye edilmiş hücrelere kıyasla yüzde 43 azaldı (Şekil 1A). Şekil İB, RANKL-aracılı osteoklast farklılaşmasını ve bunun, asteosit ile kombine tedavi yoluyla inhibisyonunu göstermektedir. Bu sonuçla uyumlu olarak, asteosit ön tedavisi, RAW264.7 hücrelerinin RANKL ile uyarılan farklılaşmasını ve osteoklast oluşumunu azalttı (Şekil 1C ve D). Acteosidin BMM'ler üzerindeki anti osteoklastik potansiyeli, aynı konsantrasyonda (10 mM) birkaç fenolik bileşiğin anti-osteoklast potansiyelleri ile karşılaştırıldığında, luteolin en yüksek aktiviteyi gösterdi (Şekil 2A). Ancak luteolin, kersetin veya apigenin kendisi hücrelerin canlılığını azaltmıştır (Şekil 2B). Tüm bileşikler, RAW264.7 makrofajlar tarafından osteoklastik farklılaşmayı aşağıdaki nispi aktivitelerle inhibe etti: luteolin. quercetin=apigenin .EGCG=acteoside (Şekil 2C). Luteolin, kersetin veya apigenin kendisi de hücrelerin azalmış canlılığını gösterdi (Şekil 2D). Buna karşılık, kuersetin tedavisi, bu hücreler 2 gün boyunca 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, veya her ikisi (veriler gösterilmemiştir). Bu bileşiklerin konsantrasyonunun yüzde 50'sini inhibe etmesi gerektiğinde

BMM'lerde osteoklast oluşumu (IC50), konsantrasyon-aktivite eğrileri kullanılarak hesaplandı, asteosit, kuersetin, luteolin, apigenin ve EGCG'nin IC50'si sırasıyla 5.1, 2.3, 2.6, 4.8 ve 6.6 mM idi (Şekil 2E). Bu sonuç, RAW264.7 makrofajlarının incelendiği duruma benzerdi. Bu veriler, luteolin ve kersetin'in anti-klastojenik aktivitelerinin ateozidden daha yüksek olduğunu düşündürdü. Buna karşılık, IC50'deki kersetin de hücreler üzerinde hafif bir toksik etkiye sahipti (veriler gösterilmemiştir).

ActeosideMakrofajlar Tarafından Kemik Rezorpsiyonunu Önler Acteoside, bir in vitro model sistem tarafından ölçüldüğü üzere doza bağlı bir şekilde RANKL aracılı kemik rezorpsiyonunu da önlemiştir(Şekil 3A). BMM'ler 1 mM asteozid ile inkübe edildiğinde kemik rezorpsiyonunu önemli ölçüde inhibe etti (Şekil 3B). 10 mM'lik bir asteozit tedavisi, BMM'ler tarafından RANKL ile indüklenen çukur oluşumunu neredeyse tamamen zayıflattı. Benzer şekilde, asteosid, RANKL ile uyarılan RAW264.7 hücrelerinde kemik emilimini azalttı (Şekil S2A ve B). yeteneğiasteositRANKL stimülasyonuna göre tedavinin zamanlamasına bağlı olarak kemik rezorpsiyonunu inhibe etmek. RANKL stimülasyonundan 4 gün sonra eklenen Acteoside (10 mM), BMM'lerde çukur oluşumunu azaltmazken, oluşan osteoklast sayısını baskıladı (Şekil 3C). Bu farklı sonuç, kısmen, 4 günlük RANKL stimülasyon oluşumundan sonra oluşmuş olan çukur alanından kaynaklanmaktadır (Şekil 3D).

ActeosideErken RANKL Sinyalizasyon Yollarını Aşağı-Düzenler

RANKL, osteoklast öncülerinde iyi bilinen 3 MAPK ve NF-kB'nin aktivasyonunu indükler ve bu aktivasyon erken osteoklast farklılaşması için gereklidir. Acteoside'ın osteoklastogenezi inhibe ettiği olası mekanizmaları anlamak için, acteosidin makrofajlarda MAPK'ler ve NF-B aktivasyonu üzerindeki etkisini araştırdık. BMM'ler ve RAW264.7 hücreleri, 2 saat boyunca 10 mM asteozid ile ön işleme tabi tutuldu ve ardından 30 dakika boyunca 100 ng/ml RANKL ile uyarıldı. MAPK fosforilasyonu, Western blotlama ve immünometrik analiz ile incelenmiştir. BMM'lerde (Şekil 4A) ve RAW264.7 hücrelerinde (Şekil 4B) p38, ERK ve JNK'nin RANKL tarafından indüklenen fosforilasyonu. Acteoside, p-p38, p-ERK ve p-JNK'de RANKL ile indüklenen bu artışları önledi. Bu sonuç, 10 mM asteozid ile ön işlemin bu makrofajlarda fosforile edilmiş MAPK seviyelerini önemli ölçüde inhibe ettiği immünometrik analiz ile desteklenmiştir (Şekil 4C). RANKL tedavisi, NF-kB'nin DNA bağlanmasını arttırırken, asteozid, NF-kB-DNA bağlanmasının RANKL ile indüklenen aktivasyonunu inhibe etti (Şekil 5A). Bu inhibisyon, BMM'lerde RAW264.7 hücrelerinden daha belirgindi. Acteoside ayrıca BMM'lerde ve RAW264.7 hücrelerinde RANKL ile uyarılan p65 ve IkBa fosforilasyonunu da azalttı (Şekil 5B ve C). 10 mMacteoside eklenmesi, BMM'lerde IkBa'nın hem bozulmasını hem de aktivasyonunu neredeyse tamamen engelledi (Şekil 5B). NF kB aktivasyonunun ateozid eyleminde rol oynadığını daha da doğrulamak için, kB promotör-lusiferaz yapıları, RAW264.7 hücrelerine geçici olarak transfekte edildi. 100 ng/ml RANKL ile inkübe edilen hücreler, 3-kat daha yüksek kB promotör aktivitesine sahipti ve bu, 10 mM asteosit ile önemli ölçüde azaltıldı (Şekil 5D).

Acteoside, enflamatuar sitokinlerin Üretimini ve TNF-a, c-Fos ve NFATc1in RANKL ile Uyarılmış Makrofajların İfadesini Bastırır

TNF-a, IL-1b ve IL-6, RANKL ile uyarılan makrofajlarda NF-kB sinyalinin aracılık ettiği osteoklast oluşumu ve işlevinde önemlidir. RANKL, bu sitokinlerin üretimini uyardı ve bu üretim, BMM'lerde 10 mM asteozid ön işlemi ile belirgin şekilde azaldı (Şekil 6A). Benzer şekilde, asteozid, RAW264.7 makrofajlarında IL-6 hariç, RANKL ile indüklenen sitokin üretimini zayıflattı (Şekil S3). Osteoklastogenezde ateosit etkisinin moleküler mekanizmalarını anlamak için, ateozidin TNF-a, c-Fos ve NFATc1 ekspresyonu üzerindeki etkisini daha da inceledik. RANKL, BMM'lerde ve RAW264.7 hücrelerinde bu faktörlerin mRNA ekspresyonunu yukarı regüle etti (Şekil 6B ve C). 10 mM asteozid ile ön-muamele, her ikisinde de bu faktörlerin RANKL ile indüklenen ekspresyonunu önemli ölçüde inhibe etti.

BMM'ler ve RAW264.7 hücreleri. Acteoside ön muamelesi, RANKL ile uyarılan BMM'lerde c-Fos ve NFATc1'in protein seviyelerini de güçlü bir şekilde azalttı (Şekil 6D). Bu sonuçlar gösteriyor kiasteositgen ve protein seviyelerinde osteoklast oluşumunun aracılarını indükleyen RANKL'ı aşağı regüle eder.

Acteoside, BMM'lerde Doza Bağlı Bir Şekilde Hücre İçi ROS Üretimini Azaltır

Hücre içi ROS üretiminin RANKL ile uyarılan osteoklastogenez ile korele olduğu bilindiğinden, hücre geçirgen, oksidasyona duyarlı bir boya olan DCFH-DA kullanarak akteozidin RANKL aracılı osteoklast farklılaşması sırasında ROS üretimini inhibe edip etmediğini araştırdık. Akış sitometrisi analizi, BMM'lerde DCF'ye özgü ortalama floresan sinyalinin, tedavi edilmemiş kontrol hücreleriyle karşılaştırıldığında, RANKL ile stimülasyondan sonra görünüşte sağa kaydırıldığını gösterdi (Şekil 7A). Bu kayma, RANKL stimülasyonundan sonra RAW264.7 makrofajlarının gözlemlenmesi durumuna benzerdi (veriler gösterilmemiştir). BMM'lerin acteoside ile tedavi edilmesi, DCF'nin sinyal yoğunluğunu doza bağlı bir şekilde azalttı. 10 mM asteozid ile ön-muamele, osteoklast farklılaşması sırasında üretilen hücre içi ROS seviyelerini hemen hemen tamamen işlenmemiş kontrol seviyelerine indirdi (Şekil 7B).

Oral Acteoside Uygulaması Ovariektomili Farelerde Osteoporotik Biyokimyasal Belirteçlerin Değişimini ve Kemik Kaybını Engeller

Akteositin kemik kaybı üzerindeki etkisini araştırmak için ovariektomi ile osteoporotik bir hayvan modeli hazırladık. Deney periyodu sırasında OVX ve Shammice arasında vücut ağırlığında önemli bir fark yoktu (veriler gösterilmemiştir). Grup, Sham grubuna göre önemli ölçüde daha yüksek serum IL-1b ve IL-6 seviyelerine sahipti (Şekil 8). Bu inflamatuar sitokinlerde ovariektomi ile indüklenen artışlar, oral akteozid uygulamasıyla (AC grubu) hafifletildi. ALP, kalsiyum, TRAP5b ve OC gibi kemik döngüsü belirteçlerinin serum seviyeleri OVX grubunda önemli ölçüde arttı. Bu osteoporotik belirteçlerden, OVX farelerinde artan kalsiyum, TRAP5b ve OC seviyeleri, asteozid tedavisi ile görünüşte inhibe edildi, oysa ALP'nin serum seviyesi tedavi tarafından değişmedi. Sağ femur şaftının ortasına ortalama maksimum kırık yükü, OVX grubunda Sham grubuna göre anlamlı olarak daha düşüktü(Şekil 9A). Acteoside tedavisi maksimum kırık desteğini Sham grubununkine yükseltti. Femurun kortikal kemiği kesilip optik mikroskopi ile gözlemlendiğinde, OVX grubunda gösterilen osteoporotik özellikler AC farelerinde neredeyse tamamen kaybolmuştu (Şekil 9B). OVX ile indüklenen osteoporoz modeli üzerinde ateositin etkisini doğrulamak için hafif proksimal femurun trabeküler bölgesindeki BMD ve kemik morfolojik parametreleri mikro-CT ile analiz edildi. Şekil 9C'de gösterildiği gibi, OVX farelerinde femoral trabeküler yapıda bir değişiklik bulundu, oysa bu değişiklik ateozid ile tedavi ile azaldı. Mikro-CT analizinden elde edilen sonuçlar, kemik gücünün bir ölçüsü olan BMD'nin OVXmice'de önemli ölçüde azaldığını ortaya çıkardı (Şekil 9D). Sham grubuyla karşılaştırıldığında, OVX fareleri ayrıca BV/TV, Tb'de önemli değişiklikler gösterdi. Sp ve Tb. N, ancak Tb.Th değil. OVX farelerinin oral ateozid tedavisi, BMD'nin yanı sıra BV/TV ve Tb.N'deki değişikliği önemli ölçüde önledi.