Bölüm 1: Ekinakozit, ROS/ATF3/CHOP Yolu Düzenlemesi Yoluyla MPP artı İndüklenmiş Nöronal Apoptoza Karşı Korur

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com

Lütfen Bölüm 2 için buraya tıklayın

türler (ROS) de gelişimine katkıda bulunur [3]. PD'ye benzer özellikler, 1-metil-4-fenil- 1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP), siyanür, karbon disülfit, ve toluen. MPTP, PD'nin hayvan modellerini uyarmak için yaygın olarak kullanılır ve aktif metaboliti 1-metil-4- fenilpiridinyum iyonu (MPP?), PD hücre modellerinde kullanılır [4, 5]. MPP? elektron taşıma zincirini seçici olarak inhibe eder ve aşırı ROS üretimi ile sonuçlanır, böylece nöronal ölüme ve PD'ye benzeyen bir sendroma neden olur [6]. Son çalışmalar göstermiştir ki MPP? bir in vitro PD modelinde, artan GSK3B fosforilasyonu (pY206) ve a-sinüklein birikimi [5], heme oksijenaz-1/nikotinamid adenin dinükleotit fosfat oksidaz/ROS ekseninin yukarı regülasyonu dahil olmak üzere birçok yolu indükler [7, 8], aktif transkripsiyon faktörü 3'ün (ATF3) artan ekspresyonu ve DNA hasarı ile indüklenebilir 153 (GADD153)/C/EBP-homolog protein (CHOP) yoluyla büyümenin durdurulması [9]. Klinik tedavide, ROS ürünlerinin baskılanması, nöronların hayatta kalması ve PD tedavisi için en önemli stratejilerden biridir [1].

Ekinakozit(ECH, Şekil 1A), doğal birfeniletanoidBirçok şifalı bitkide bulunan,feniletanoidglikozitlergeleneksel Çin bitkisinden izole edilmiş,cistanchesalsa [10]. İlginçtir ki, son araştırmalar göstermiştir kiECHMPTP [10, 11] tarafından indüklenen bir PD fare modelinde koruyucu etkilere sahiptir.ECHayrıca in vitro tümör nekroz faktörü-a veya 6-hidroksidopamin tarafından indüklenen nöroblastom hücre apoptozunu da azaltır [12, 13]. Bununla birlikte, hangi mekanizmalarECHMPPa ile indüklenen PD hücre modelinde nöronların hayatta kalmasını teşvik ettiği belirsizliğini koruyor.

gösterdikECHMPP tarafından indüklenen ROS ürünlerini önemli ölçüde azalttı mı? SH-SY5Y hücrelerinde.ECHayrıca ATF3, CHOP ve a-sinükleinin MPPa ile indüklenen ekspresyonunu ve ayrıca pro-apoptozis proteinleri kaspaz-3 ve poli (ADP-riboz) polimerazın (PARP) aktivasyonunu baskıladı.

cistancheekinakozitsahip olmaksinir koruyucuEtkileri

Malzemeler ve yöntemler

reaktifler

Dulbecco'nun minimal temel ortamı (DMEM), fetal sığır serumu, 0.25 yüzde tripsin, yüzde 1 penisilin/streptomisin ve TRIzol reaktifi Life Technologies'den (Grand Island, NY) temin edildi. Kromatin boyası bisbenzimid (Hoechst 33342), poli-L-lisin, MPP? iyodür ve MPTP, Sigma'dandı (St. Louis, MO). Lipid peroksidasyon malondialdehit (MDA) tahlil kiti ve diklorofloresein diasetat (DCFH-DA) Beyotime Biotech'ten (Haimen, Çin) alındı. Yüzde C98 saflığındaki ECH, Push Biotechnology'den (Chengdu, Çin) elde edildi.

Hayvanlar ve Tedaviler

Hayvan bakımı ve tedavileri daha önce tarif edildiği gibiydi [14]. 10 haftalıkken 24-26 g ağırlığında erkek C57BL/6 fareleri (Shanghai Laboratory Animal Co., Şanghay, Çin) kullandık. Hayvanlar standart koşullar altında (12:12 saat ışık: karanlık döngü, 21 ± 2C ve yüzde 40 bağıl nem) tutuldu ve yiyeceğe ve suya ad libitum erişim sağlandı. Tüm prosedürler, Fudan Üniversitesi, Zhongshan Hastanesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Bakım ve Kullanım Kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirildi.

Laboratuvar Hayvanları.

Fareler rastgele dört gruba ayrıldı (10 fare/grup): grup A, araç kontrol grubu, eşit hacimde (500 ul) normal salin (NS) verildi; grup B, ECH kontrol grubu, verilen 20 mg/kg ECH; grup C, MPTP model grubu, eşit hacimde NS ile ön işleme tabi tutulmuştur; ve grup D, ECH ile tedavi edilen grup, 20 mg/kg ile önceden tedavi edilenECH. ECHNS içinde çözüldü ve art arda 15 gün boyunca her 24 saatte bir intragastrik uygulama ile verildi. C ve D grupları için fare PD modeli, 11. günden 15. güne kadar her 24 saatte bir 30 mg/kg MPTP'nin peş peşe beş intraperitoneal enjeksiyonu ile oluşturulmuştur. Fareler, yüzde 10 kloralhidrat (3.6 mg/ kg) son tedaviden 24 saat sonra intraperitoneal olarak.

Perfüzyon ve doku işleme daha önce tarif edildiği gibiydi [14]. İntrakardiyak perfüzyondan sonra, beyin örnekleri toplandı ve 4C'de 24 saat boyunca yüzde 4 paraformaldehit içinde, parafine gömüldü ve tüm SNc'yi kapsayan koronal kesitler (stereotaksik koordinatlar ön-arka -3.64 ila -2.92) içinde sabitlendi.92 bregmaya göre mm) 5 lm'de kesildi.

Her gruptan 5 hayvan daha servikal dislokasyon ile öldürüldü ve ventral orta beyin, buz üzerinde yüzde 1 SDS liziz tamponunda hızla parçalandı. Lizattaki CHOP ve ATF3 protein seviyeleri western blotlama ile analiz edildi.

cistancheekinakozitcanlandırıcı etkiye sahiptir.böbrek

Sıçan Ventral Orta Beyin (VM) Kültürü

Dopaminerjik Nöronlar

Hamile Wistar sıçanları, Shanghai Laboratory Animal Co.'dan (Shanghai, Çin) satın alındı. VM'deki DA nöronları embriyonik gün 14'te izole edildi. VM, daha önce tarif edildiği gibi birincil VM DA nöron kültürlerini oluşturmak için diseke edildi ve işlendi [15, 16]. Kısaca, doku parçaları buz gibi soğuk Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) toplandı ve 1000 rpm'de 4C'de 5 dakika santrifüjlendi. Doku peleti, yüzde 5 CO2 ile 37°C'de 15 dakika boyunca 750 ul yüzde 0.1 tripsin-HBSS içinde inkübe edildi. Tripsini inaktive etmek için fetal buzağı serumu (FCS; 750 lL) kullanıldı ve dokular nazikçe ezilerek ayrıştırıldı

sterilize edilmiş Pasteur pipeti kullanarak. Hücre süspansiyonları 1000 rpm'de 4 dakika 4°C'de santrifüjlendi ve farklılaşma ortamında yeniden süspanse edildi (Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı/F12, 33 mmol/L D-glukoz, yüzde 1 L-glutamin ve yüzde 1 FCS, yüzde 2 takviyeli B27). Hücreler, poli-D-lisin (Sigma) kaplı 24-yuvalı doku kültürü plakalarında 5 9 104 hücre/kuyuda 500 lL farklılaşma ortamında 37°C'de 10 gün boyunca yüzde 5 CO2 ile tohumlandı.

olgun DA nöronları. VM DA nöronları, anti-b-tubulin izotip III antikoru ve tirozin hidroksilaz (TH) antikoru ile immünofloresan ile karakterize edildi (Şekil S1). Hücreler 1 mmol/L MPP?, 40 LG/ mL ECH, MPP? ve ECH veya kontrol olarak tek başına PBS. Hücre canlılığı, 96 saatlik tedaviden sonra CCK-8 reaktifi ile analiz edildi.

ve ortalama ± SD (n {{0}}; **P \0) olarak sunulur.01'e karşı kontrol, #P \ 0.05, ##P \0.01'e karşı MPP ? tedavi). C MPP'nin neden olduğu morfolojik değişikliklerin ışık mikroskobik görüntüleri? veya MPP? ve ECH. a, PBS kontrolü; b, 40 lg/mL ECH; c, 1 mmol/L MPP?; d, 1 mmol/L MPP? ve 10 lg/mL ECH; e, 1 mmol/L MPP? ve 20 lg/mL ECH; f, 1 mmol/L MPP? ve 40 lg/mL ECH (ölçek çubuğu, 200 lm).

Cistanche echinacoside, apoptozu inhibe etme etkisine sahiptir.

SH-SY5Y Hücre Kültürü

SH-SY5Y hücreleri, Şanghay Hücre Biyolojisi Enstitüsü'nün (Çin Bilimler Akademisi, Şanghay, Çin) Hücre Bankasından alındı ​​ve yüzde 10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 U/mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de kültürlendi. Hücreler, yüzde 5 CO2 ile sağlanan nemlendirilmiş bir 37C inkübatörde tutuldu. MPP? steril suda çözüldü ve hemen kullanıldı. ECH, PBS içinde çözüldü. ROS ile ilgili gen ekspresyonunu ve protein seviyelerini araştırmak için hücreler 6-kuyu plakalarına ekildi ve 24 saat kültürlendi. Hücreler daha sonra MPPy, ECH, MPPy'nin bir kombinasyonunu içeren taze ortamla beslendi. ve ECH veya kontrol olarak tek başına PBS. 24 saatlik tedaviden sonra, hücreler western blot analizi için yüzde 1 SDS lizis tamponu (yüzde 1 SDS, 25 mmol/L EDTA, 45 mmol/L Tris-HCl, pH 6.5) ile parçalandı ve toplam RNA doğrudan ile izole edildi. TRIzol reaktifi.

Tedaviden sonra ATF3 ve CHOP dağılımını analiz etmek için, ilaçla tedavi edilen ve kontrol hücrelerinden sitoplazmik ve nükleer fraksiyonları çıkarmak için nükleer ve sitoplazmik ekstraksiyon reaktif kitleri (Thermo Fisher, Waltham, MA) kullanıldı.

Hücre Canlılığı Testi

SH-SY5Y hücreleri 96-kuyucuklu plakalara ekildi ve gece boyunca inkübe edildi. Hücreler, her 24 saatte bir, farklı ilaçlar içeren taze bir tam ortam ile beslendi ve 3 gün boyunca muhafaza edildi. Daha sonra canlılık CCK8 hücre sayacı kiti (Dojindo, Japonya) kullanılarak değerlendirildi. Veriler, PBS kontrolünden elde edilen sonuçlara göre normalleştirildi ve ortalama ± SD olarak sunuldu. ATF3-yıkım SH-SY5Y (ATF3 shRNA) ve kontrol (GFP shRNA) hücrelerinde canlılığı analiz etmek için hücreler 96-kuyu plakalarına eklendi ve 14-16 saat kültürlendi. ATF3 shRNA veya GFP shRNA plazmitleri, Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) kullanılarak SH-SY5Y hücrelerine transfekte edildi. Hücreler 1 mmol/L MPP? veya 24 saat transfeksiyondan sonra eşit hacimde PBS ve daha sonra 3 gün inkübe edildi. Hücre sayıları her gün sayıldı. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur.

shRNA Yapıları ve Oligo Primerleri

pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) ve GFP kontrol shRNA yapıları GeneChem Co.'dan (Şanghay, Çin) elde edilmiştir. ATF3 hedef dizisi, daha önce açıklanan yöntemlerden 50-GCAAAGT G!CCGAACAAGA-30 idi [17, 18]. MPPy tarafından indüklenen gen ekspresyonunu saptamak için, qRT-PCR için ROS stresi ile ilişkili ve PD ile ilişkili genler seçildi ve kontrol olarak GAPDH kullanıldı. Tüm primerler Sangon Biotech Co. (Shanghai, China) tarafından sentezlendi ve primer dizileri Tablo 1'de listelendi.

Gerçek Zamanlı PCR

Toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre TRIzol reaktifi ile ekstre edildi. Ters transkripsiyon ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) daha önce tarif edildiği gibi yapıldı. Ters transkripsiyon reaksiyonu, üreticinin talimatlarına göre RevertAid First Strand cDNA Synthesis kiti (Thermo Scientific, Waltham, MA) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. qRT-PCR için SYB Premix Ex Taq II kiti (TaKaRa, Dalian, Çin) kullanıldı: ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA) ile 20-lL reaksiyon sistemleri kullanıldı. PCR parametreleri aşağıdaki adımlardan oluşuyordu: 3 dakika için 95C, 1 döngü; 5 sn için 95C ve 40 sn için 60C, 40 döngü. Nihai veriler normal değildi.

GAPDH'ye göre ahlaklandırılır ve kontrole oran olarak sunulur. Amplifikasyon için kullanılan primerler Tablo 1'de listelenmiştir.

Western Blotlama

Western blot analizi daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [19]. Birincil antikorlar, anti-parçalanmış kaspaz 3 ve p53 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, Çin) ve anti- ATF3, anti-PARP, anti-PUMA ve anti-histon 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Horseradish peroksidaz etiketli ikincil antikorlar, Jackson Immune Research Laboratories'den (Western Grove, PA) elde edilmiştir. PVDF membranları EMD Millipore'dan (Billerica, MA) ve ECL substratı CWBio'dan (Suzhou, Çin) idi. Görüntüdeki gri seviyelere dayalı nispi protein seviyeleri, Tanon GIS yazılımı (Tanon Biotech, Şanghay, Çin) ile analiz edildi ve veriler, hedef proteinin GAPDH'ye oranı olarak sunuldu.

cistancheekinakozitkaraciğeri koruma etkisi vardır