Bölüm 1: Klonlanmış Bir Köpek Üretmek İçin Hücre Koruyucu Olarak Acteoside'ın Etkisi

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Hayvan ve Süt Bilimi Anabilim Dalı, Ziraat ve Yaşam Bilimleri Fakültesi, Chungnam Ulusal Üniversitesi, Daejeon, Kore Cumhuriyeti,

2 Biyoloji Eğitimi Bölümü, Eğitim Fakültesi,Chonnam Ulusal Üniversitesi, Gwangju, Kore Cumhuriyeti

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com

Lütfen Bölüm 2 için buraya tıklayın

Soyut

Somatik hücre nükleer transferi (SCNT) iyi bilinen bir laboratuvar tekniğidir. SCNT'nin prensibi, çekirdeği çıkarılmış bir alıcı oosit içine somatik bir hücre enjekte ederek somatik bir çekirdeğin yeniden programlanmasını içerir. Bu nedenle, çekirdek donör hücreleri, SCNT'de çok önemli bir faktör olarak kabul edilir. G0/G1 aşamasında çekirdek donör hücrelerinin hücre döngüsü senkronizasyonu, temas inhibisyonu veya serum açlığı ile indüklenebilir. Bu çalışmada,asteosit, bir fenilpropanoid glikozit bileşiği, köpek fetal fibroblastlarında hücre döngüsü senkronizasyonunu, sitoproteksiyonu indüklemek ve SCNT verimliliğini artırmak için uygulanabilir olup olmadığını belirlemek için araştırıldı. Birincil köpek fetal fibroblastları ile tedavi edildiasteosit(10, 30, 50 μM) çeşitli zaman periyotları için (24, 48 ve 72 saat). G0/G1 aşamasında hücre döngüsü senkronizasyonu, indüksiyon yöntemiyle önemli ölçüde farklılık göstermedi:asteosittedavi, temas inhibisyonu veya serum açlığı. Bununla birlikte, bu üç tedaviden serum açlığı, önemli ölçüde artan reaktif oksijen türleri (ROS) seviyesi (99,5 ± 00,3) ve apoptoz ile sonuçlandı. Sonuçlar da ortaya koydu kiasteositköpek fetal fibroblastlarında nekroz dahil olmak üzere azaltılmış ROS ve apoptoz süreçleri ve iyileştirilmiş hücre sağkalımı. ile tedavi edilen köpek fetal fibroblastlarıasteositG0/G1 aşamasında başarıyla tutuklandı. Ayrıca, acteoside ile tedavi edilen çekirdek donör hücreleri kullanılarak yeniden yapılandırılmış embriyolar, sağlıklı bir klonlanmış köpek üretti, ancak temas inhibisyonuna tabi tutulan çekirdek donör hücreleri kullanılarak üretilen embriyolar üretmedi. Sonuç olarak,asteositÇekirdek donör hücrelerinin uyarılmış hücre döngüsü senkronizasyonu, sitoprotektif etkileri nedeniyle köpek SCNT'nin etkinliğini artırmak için alternatif bir yöntem olacaktır.

Cistanche acteoside Bağışıklığı Artırabilir

giriiş

SCNT tekniği, tarımsal amaçlar ve biyomedikal kaynaklar olarak genetik olarak üstün veya manipüle edilmiş hayvanlar üretmek için kullanılmıştır. Hayvan hastalık modellerine, nesli tükenme tehlikesi altındaki hayvanların kurtarılmasına, rejeneratif tıp için kök hücrelere, organ nakline vb. artan ihtiyaçla birlikte, SCNT kullanarak hayvanların klonlanmasına ilgi son zamanlarda artmaktadır [1–5]. Klonlanmış hayvanların üretimi başarılı olmasına rağmen, SCNT'nin etkinliği hala çok düşüktür [6]. Düşük SCNT embriyo gelişimsel yeterliliğinin nedenleri, alıcı oositlerin kalitesi, çekirdek donör hücrelerinin kalitesi ve taşıyıcı annenin durumu ile ilgili birçok faktörü içerir [7-10].

Reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve apoptozun in vivo ve in vitro oosit gelişimi dahil dişi üreme süreçlerinde yer aldığı bilinmektedir [11-14]. ROS, embriyolarda sitoplazmik yoğunlaşmayı, DNA hasarını ve apoptozu indükleyerek embriyo gelişimini kesintiye uğratır. Destekleyici çalışmalar, ROS'un azaltılmasının in vitro kültür sırasında SCNT embriyo geliştirme yeterliliğini geliştirdiğini bildirmiştir [15-17]. Apoptoz, DNA hasarlı/arızalı hücreleri çıkararak hücresel homeostazı sürdürmek için normal preimplantasyon embriyo gelişimi sırasında kendiliğinden meydana gelen fizyolojik bir süreçtir. ROS, DNA parçalanmasına neden olur ve embriyo gelişimini bozan apoptotik blastomerleri arttırır. ROS ve apoptoz olayı, in vitro fertilizasyondan sonra SCNT'den sonra daha sık gözlenir [18, 19]. Birçok çalışma, selenyum [20], insülin-transferrin-selenyum [17, 21], melatonin [22] ve glutatyon [23] gibi antioksidanlar kullanılarak ROS ve apoptoz düzeylerinin azaltılmasıyla SCNT embriyo geliştirme yetkinliğinin kurtarıldığını bildirmiştir.

Önceki çalışmalar, G{{0}/G1 aşamasında tutuklanan donör hücrelerin kullanımının SCNT'nin verimliliğini iyileştirdiğini bildirmiştir [7, 9, 24-28]. G0/G1 aşamasında donör hücrelerdeki kromatin, SCNT embriyo geliştirme yeterliliği için en etkili olarak kabul edilmiştir. Verici hücre döngüsünü senkronize etmek için temas inhibisyonu, serum açlığı ve kimyasal tedaviler sıklıkla kullanılmıştır [7, 25, 29, 30]. Bununla birlikte, serum açlığı hücre sağkalımını azalttı ve apoptoza yol açan DNA fragmantasyonunu artırdı [31]. Kimyasal inhibisyon, roskovitin [29, 32], dimetil sülfoksit (DMSO) [33] ve sikloheksimid (CHX) [34] gibi inhibitörleri kullanarak G0/G1 aşamasında hücre döngüsünü durdurmak için başka bir stratejidir. Senkronizasyon için kullanılan yöntemin etkinliği, donör hücrelerin tip ve türlerinden etkilenir. Optimum donör hücre senkronizasyonu için, kullanılan yöntemlerin çeşitli yönlerinin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir.

Acteoside(verbascoside olarak da bilinir) [{{0}}(3, 4-dihidroksi fenil etil)-1-OaL-rhamnopyranosyl-(1 / 3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glucopyranoside], Syringa vulgaris'in menekşe çiçeklerinden izole edilir. Acteoside içeren bitkilerin anti-mikrobiyal ve anti-fungal aktivitelere sahip olduğu [35-37] ve iltihaplanmayı önlediği bilinmektedir. Aslında, ateozid, anti-oksidatif aktivite, anti-apoptotik aktivite, çeşitli tümör hücrelerine karşı sitotoksisite ve sikline bağımlı olarak G0/G1 aşamasında hücre döngüsü senkronizasyonu gibi in vitro ve in vivo çeşitli biyolojik aktiviteler sergiler. kinaz (CDK) inhibitörü [38]. Örneğin Lee ve diğerleri[38] Acteoside tedavisinin, G0/G1 aşamasında hücre döngüsü durmasını indükleyerek insan promyelositik HL-60 lösemi hücrelerinin çoğalmasını engelleyebileceğini bildirdi. Bununla birlikte, asteozid ile muamele edilmiş donör hücrelerin köpek SCNT'sinin etkinliği üzerindeki etkisi henüz araştırılmamıştır.

Bu çalışmada, etkileriasteosithücre döngüsü senkronizasyonu, ROS veapoptozköpek fetal fibroblastları araştırıldı. Hücre döngüsü senkronizasyonu, ROS ve apoptoz analizi, floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak yapıldı. Acteoside ile tedavi edilen donör hücrelerin etkinliğini göstermek için SCNT embriyoları kültürlendi ve alıcı bir köpeğe aktarıldı ve başarılı bir şekilde sağlıklı bir klonlanmış köpek üretildi.

cistanchetedavi edebilirböbrekhastalık iyileşirböbrekişlev

Malzemeler ve yöntemler

etik beyanı

Bu çalışmada, oosit donörleri ve embriyo transfer taşıyıcıları olarak 44 dişi melez köpek (1-6 yaş arası) kullanıldı ve fetal fibroblast hücre hatlarının oluşturulması için bir dişi beagle (2 yaşında) kullanıldı. Tüm hayvan deneyleri, Chungnam Ulusal Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı (Onay Numarası: CNU-00487) ve IACUC tarafından yayınlanan "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu"na göre yapıldı. Chungnam Ulusal Üniversitesi'nden. Köpekler, bir sıcaklık ve havalandırma kontrol sistemi ile ayrı kafeslerde iç mekanlarda büyütüldü. Köpekler günde bir kez ticari bir diyetle beslendi ve ad libitum su sağlandı. Tüm hayvan deneylerinde, köpeklere başlangıçta 6 mg/kg ketamin ve ksilazin ile anestezi uygulandı ve yüzde 2 izofluran ile anestezi altında tutuldu. Ameliyat bitiminde enfeksiyon oluşmaması için antibiyotikler (Prokain Penisilin G, Benzatin Penisilin G ve Dihidrostreptomisin sülfat) uygulandı. Ameliyattan sonra köpekler, tatlı su ile kendi bireysel kafeslerine nakledildi, izlendi ve sorumlu veteriner tarafından özel bakım sağlandı, böylece hayvanlara ihtiyaç duyulduğunda gerekli tedaviler uygulandı.

kimyasallar

Tüm kimyasallar, aksi belirtilmedikçe Sigma-Aldrich Chemical Co.'dan (St. Louis, MO, ABD) satın alınmıştır. Acteoside, Çin'deki Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.'den elde edildi.

Köpek fetal fibroblastlarının izolasyonu

Köpek fetal fibroblastları {{0}}günlük fetüslerden elde edildi. Kısaca, dişi bir beagle, bir erkek beagle'ın spermiyle suni olarak döllendi. 28 gün sonra dişi beagle'da gebelik doğrulandı ve celiohisterektomi ile 5 fetüs elde edildi. Fetüsler fosfat tamponlu salin (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, ABD) içinde üç kez yıkandı. Fetüslerin başı, iç organları ve uzuvları cerrahi bir bıçakla çıkarıldı ve kalan vücut parçaları PBS içinde kıyıldı. Fetüs parçaları, 5 dakika boyunca 400 x'de santrifüjleme ile iki kez yıkandı ve yüzde 1 penisilin-streptomisin (ürün No. P4458) ve yüzde 20 cenin sığır serumu (FBS; Gibco) ile takviye edilmiş Dulbecco's Modified Eagle's Medium'da (DMEM; Gibco) kültürlendi. yüzde 5 CO2 ve yüzde 95 havadan oluşan nemli bir atmosferde 39 derecede. Hücreler 5-7 gün sonra birleşme noktasına ulaştığında, 2 dakika boyunca yüzde 0.25 tripsin-EDTA (Gibco) ile işleme tabi tutuldu ve hasat edildi. İki ayrı fetüsten iki köpek fetal fibroblast hücre hattı oluşturuldu. Hücreler FBS içinde yüzde 10 DMSO içinde donduruldu ve kullanılıncaya kadar -196 derecede sıvı nitrojen içinde saklandı.

hücre tedavisi

Dondurulmuş köpek fibroblastları eritildi ve yüzde 80 birleşene kadar kültürlendi. Hücreler toplandı ve sonraki deneyler için 4 ila 7 kez pasajlandı. Hücreler, 60 mm kültür tabaklarında 106/mL konsantrasyonda ekildi. Hücreler (1) beş gün boyunca yüzde 10 FBS ve yüzde 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş DMEM (temas inhibisyonu), (2) beş gün boyunca yüzde 0.5 FBS ve yüzde 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş DMEM (serum açlığı) içinde kültürlendi. veya (3) 24 saat, 48 saat ve 72 saat boyunca 10 uM, 30 uM veya 50 uM'de ateosit içeren yüzde 10 FBS ve yüzde 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM (akteosit tedavisi).

Akış sitometrisi ile hücre döngüsü analizi

Hücre döngüsü aşamalarının analizi için, hücreler yüzde {{0}}.25 tripsin-EDTA kullanılarak toplandı ve santrifüjleme yoluyla 3 kez PBS ile yıkandı. Son yıkamadan sonra süpernatanlar atıldı ve hücreler 0.3 mL PBS içinde yeniden süspanse edildi. Fiksasyon için hücre süspansiyonuna damla damla {{10}}.7 mL soğuk mutlak etanol ilave edildi, hafif vorteksle karıştırıldı ve gece boyunca 4 derecede saklandı. Sabit hücreler santrifüjlendi ve iki kez soğuk PBS ile yıkandı. Hücreler, 5 μL 10 mg/mL RNase ile takviye edilmiş 0.25 mL PBS içinde yeniden süspanse edildi ve 1 saat süreyle 37 derecede inkübe edildi. Ardından 10 μL 1 mg/mL propidium iyodür (PI) eklendi. Hücre döngüsü, bir FACS Calibur akış sitometresi (Becton Dickinson, San Jose, CA) kullanılarak G0/G1 (2n), S (2n ve 4n arasında) ve G2/M (4n) fazlarında hücre popülasyonlarındaki DNA içeriğinin nicelendirilmesiyle analiz edildi. , AMERİKA BİRLEŞİK DEVLETLERİ).

Akış sitometrisi ile ROS tespiti

Canlı hücrelerdeki ROS, bir Image-iT™ Live Green Reaktif Oksijen Türleri Tespit Kiti (Molecular Probes, Eugene, OR, ABD) kullanılarak değerlendirildi. Kısaca hücreler, kültür ortamı çıkarıldıktan sonra PBS içinde yıkandı ve 2 mL 100 uM tert-bütil hidroperoksit (TBHP) çalışma solüsyonu eklendi. 37 derecede 1 saat inkübasyondan sonra, TBHP çalışma solüsyonu çıkarıldı ve hücreler, ılık Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS; Gibco) 3 kez nazikçe yıkandı. Hücreler daha sonra 25 μM 5-(ve-6)-karboksi-2,7-diklorodihidro-floresein diasetat (karboksi-H2DCFDA) çalışma solüsyonunda 37 derecede karanlıkta 30 dakika inkübe edildi. . Oksitlendiğinde, karboksi-H2DCFDA yeşil floresan yayar ve akış sitometrisi ile ROS'un değerlendirilmesini kolaylaştırır. Pozitif kontrol olarak ROS üretiminin indükleyicisi olan TBHP kullanıldı. Hücrelerin çekirdekleri Hoechst 33342 ile boyandı. 3 kez PBS ile yıkandıktan sonra hücreler tripsinizasyon yoluyla toplandı, PBS içinde süspanse edildi ve bir FACS Calibur akış sitometresi (Becton Dickinson, San Jose, CA, ABD) kullanılarak ROS'u saptamak için kullanıldı. ). ROS oluşum hızı, ROS pozitif hücre sayısının toplam hücre sayısına bölünmesi ve değerlerin yüzdelere dönüştürülmesiyle hesaplandı.

Akış sitometrisi ile apoptoz analizi

Apoptoz analizi, bir Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, ABD) kullanılarak yapıldı. Kısaca, hücreler tripsinizasyon yoluyla toplandı ve 2 kez soğuk PBS ile yıkandı. Daha sonra hücrelere 100 μL 1× anneksin bağlama tamponu, 5 μL Alexa Fluor 488 anneksin V ve 1 μL PI eklendi. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübasyondan sonra 400 µL 1x anneksin bağlama tamponu eklendi ve hücre süspansiyonu hafifçe karıştırıldı. Ca2 artı bağımlı bir fosfolipid bağlayıcı protein olan Anneksin V, fosfatidilserin (PS) için yüksek bir afiniteye sahiptir. Canlı hücrelerde PS, iç sitoplazmik zarda bulunur ve apoptotik hücrelerde dış sitoplazmik zara yer değiştirir. Apoptotik hücreler, dış zarda PS'ye bağlanan Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiş Annexin V ile ayırt edilir. Ayrıca nükleik asit bağlayıcı bir boya olan PI, nekrotik hücreleri kırmızı floresan ile boyar. Bu nedenle, yeşil flüoresanslı apoptotik hücreler, kırmızı flüoresanslı nekrotik hücreler ve hücrelerde çok az flüoresans olan veya hiç olmayan canlı hücreler, bir FACS Calibur akış sitometresi (Becton Dickinson, San Jose, CA, ABD) kullanılarak analiz edildi. Oranlar, canlı, nekrotik veya apoptotik hücrelerin hücre sayılarının toplam hücre sayısına bölünmesi ve hesaplanan değerlerin yüzdelere dönüştürülmesiyle hesaplandı.

İn vivo olgunlaşmış oositlerin toplanması

Her köpekte ovulasyonu saptamak için, serum progesteron (P4) konsantrasyonu, bir DSL-3900ACTIVE progesteron Coated-tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, ABD) kullanılarak ölçüldü. Daha önce açıklandığı gibi [39, 40], P4 konsantrasyonunun 4 ng/mL'yi aştığı gün yumurtlama günü olarak kabul edildi. Yumurtlamadan 72 saat sonra, aseptik cerrahi prosedürler kullanılarak laparotomi ile oositler alındı. Yumurta kanalının fimbriasına bursal yarıktan yaklaşıldı ve ters çevrilmiş flanşlı bir çelik iğne (18 gauge, 7.5 cm) kullanılarak kanüle edildi. 24 gauge intravenöz (IV) kateter (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seoul, Kore) uterotubal bileşkeye yakın yumurta kanalının kıstağına yerleştirildi ve yüzde 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş besiyeri 199 (Gibco) ve IV kateter yoluyla yumurta kanalına yüzde 5 FBS verildi. Oositler hemen laboratuvara nakledildi. 31 köpekten toplam 316 oosit toplandı.

Somatik hücre nükleer transferi ve embriyo transferi SCNT, daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [39]. Kısaca, kümülüs hücrelerini in vivo olgunlaşmış oositlerden çıkarmak için kümülüs-oosit kompleksleri (COC) tekrar tekrar yüzde 0.1 hiyalüronidaz içinde pipetlendi. İlk polar cisim ve metafaz-II kromozomları aspirasyonla çıkarıldı. Enükleasyon, Hoechst 33342 (bisbenzimid) ile boyanarak doğrulandı. Köpek fetal fibroblastları, 48 saat boyunca 30 μM akteosit ile tedavi edildi ve ardından yüzde 0.25 tripsin-EDTA ile toplandı. Pürüzsüz bir hücre zarına sahip olan tek bir hücre, çekirdeklenmiş her bir oositin perivitellin boşluğuna aktarıldı. Beyitler, 0.1 mM HEPES, 0.5 mM MgSO4 ve yüzde 0.05 BSA içeren 0.26 M mannitol ortamı olan dengelenmiş infüzyon ortamıydı ve iki darbe ile kaynaştırıldı. Elektro-Hücre Füzyon cihazından (NEPA gen Co., Chiba, Japonya) doğru akım (15 μs için 69-75 V) Bu beyitler, 1 saat 30 dakika boyunca yüzde 10 FBS ile takviye edilmiş ortam 199'da inkübe edildi. Kaynaşmış SCNT embriyoları kontrol edildi ve kimyasal aktivasyon, onları 10 uM kalsiyum iyonofor (ürün No. C7522, Sigma) içinde 4 dakika süreyle inkübe ederek indüklendi. SCNT embriyoları yıkandı ve daha sonra 3 saat 30 dakika boyunca 1.9 mM 6-dimetilaminopurin (6-DMAP) içeren modifiye edilmiş bir sentetik yumurta kanalı sıvısı ortamına (mSOF) [41] yerleştirildi. Tasarlanmış embriyolar, SCNT'den sonraki 4 saat içinde östrus ile senkronize edilmiş taşıyıcı annelerin yumurtalıklarına cerrahi olarak transfer edildi. Gebelik, embriyo transferinden 26 gün sonra (en erken) ultrasonografi ile doğrulandı.

Aktif maddeasteositiçindecistanche

Klonlanmış embriyoların in vitro kültürü

SCNT'den sonra klonlanmış embriyolar, yüzde 5 CO2 ve yüzde 95 havada, 38,5 derecede mineral yağ ile kaplanmış modifiye sentetik yumurta kanalı sıvı ortamının (mSOF) (mikrodam başına 10 klonlanmış embriyo) 40 uL mikro damlasında kültürlendi. SCNT embriyo gelişimi 2. günden 8. güne kadar gözlendi.

Klonlanmış bir köpeğin mikro uydu ve mitokondriyal DNA analizi

Üreticinin yönergelerine göre nükleer donör hücrelerden ve oosit donör köpeklerin, vekil köpeklerin ve klonlanmış köpeğin derisinden G-spin™ Genomik DNA Ekstraksiyon Kiti (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Kore) ile toplam DNA ekstrakte edildi, ve sonra 100 uL TE tamponu (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) içinde ayrıştırıldı. DNA miktarı BioSpec-nano Spektrofotometre (Shimadzu Corp., Japonya) ile ölçülmüştür.

Mikro uydu genotiplemesi için aşağıdaki 7 spesifik gen seçildi: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 ve FH2079. PCR, 95 derecede 10 dakika süreyle ilk denatürasyon, 95 derecede 30 saniye denatürasyon, 58 derecede (-0.1 derece/döngü) 30 saniye tavlama, 1 dakika uzatmadan oluşan 20 döngü ile gerçekleştirildi. 72 derecede ve 95 derecede 30 saniye denatürasyon, 56 derecede 30 saniye tavlama, 72 derecede 1 dakika uzatma ve 72 derecede 10 dakika son uzatmadan oluşan 15 döngü.

Mitokondriyal DNA dizilimi için, köpek mtDNA'sının (GenBank erişim no.: U96639) tam nükleotid dizileri kullanılarak, aşağıdaki oligonükleotid primerleri sentezlendi: Sitokrom b bölgesi (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCATTGACCTCCCAGCG,R:AGGGATGGATAGCTA Sitokrom c oksidaz alt birimi II (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTATCGTTGAAC; D-loop bölgesi (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Bu analiz için PCR döngüleri şunları içeriyordu: 5 dakika boyunca 95 derece başlangıç ​​denatürasyonu, 95 derecede 30 saniye için 5 döngü denatürasyon, 60 derecede (-1 derece/döngü) 40 saniye tavlama, 1 dakika uzatma 72 derecede ve sonraki 30 döngü 95 derecede 30 saniye denatürasyon, 55 derecede 40 saniye tavlama, 72 derecede 1 dakika uzatma ve 72 derecede 10 dakika son uzatma. Çeşitli deneylerden elde edilen PCR fragmanları, bir ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., ABD) kullanılarak analiz edildi. Kontrol bölgeleri için dizi montajı, çoklu hizalamalar ve hizalama kırpma, BioEdit yazılımı (v.7.0.5.3) ile gerçekleştirilmiştir.

asteositiçindecistanchebağışıklık sistemini artırabilir