Bölüm 1: Bağırsak Bozuklukları Olan Farelerin Bağırsak Mikrobiyotası Üzerine Cistanche Tubulosa Sulu Ekstraktının Etkileri

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Bağırsak mikrobiyotasının bozuklukları birçok hastalıkla ilişkilidir. *e sulu özüCistanche tübüloza (CT), geleneksel bir Çin bitkisel formülü, bir rol oynadığı bildirildiinsan bağırsağını korumak. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkileri hakkında çok az şey bilinmektedir. *Bu çalışma, CT sulu özütünün bağırsak bozuklukları olan farelerde bağırsak mikrobiyomunu modüle edip edemediğini belirlemek için yapılmıştır. hasarlı olduğunu gördükbağırsak morfolojisisefiksim ile muameleden kaynaklanan CT sulu ekstresi kullanılarak kurtarılabilir. * CT özütü ile tedavi edilen fareler ve kontrol fareleri arasındaki mikrobiyal çeşitliliğin karşılaştırılması, model gruplarının mikrobiyom topluluğundaki bozukluğun, sulu özütün yüksek ve orta konsantrasyonları ile tedavi edilerek düzeltilebileceğini de gösterdi. Sefiksim ile tedavi, laktik asit bakterilerinde önemli bir azalmaya yol açtı; bununla birlikte, CT sulu ekstraktının eklenmesi bu laktik asit bakterilerinin büyümesini geri kazandı. Ayrıca, CT sulu özütü, sefiksim tarafından indüklenen bağırsak mikrobiyomunun metabolik yollarındaki dramatik değişiklikleri hafifletebildi. *bu bulgular, CT sulu ekstraktının bağırsak mikrobiyotası üzerindeki yararlı etkileri hakkında bir fikir verdi ve ayrıca gelecekte ilgili ilaçların geliştirilmesi için önemli bir referans sağladı.

Bağırsakları rahatlatmak için Cistanche, lütfen tıklayınburadadaha fazlasını bilmek

giriiş

C olduğunu göstermiştir.çölikola polisakkaritlerimelanogenezi uyarmakmelanositler, oksidatif stresi azaltır[15], sıçanlarda antioksidan ve anti-inflamatuar süreçleri düzenleyerek bilişsel işlev bozukluğunu hafifletir [16], PC12 hücrelerini OGD/RP kaynaklı hasara karşı korur [17], in vivo ekinakozit emilimini arttırır ve bağırsak mikrobiyotasını etkiler [ 18]. Probiyotikler, sağlık açısından yararları olan ve yeterli miktarlarda uygulandığında gastrointestinal kanalda mikrobiyal denge sağlayan canlı, patojenik olmayan mikroorganizmalardır [19]. *ey, makrofajların, doğal öldürücü (NK) hücrelerin ve antijene özgü sitotoksik T lenfositlerin aktivasyonu ve suşa özgü ve doza bağlı bir şekilde çeşitli sitokinlerin salınması ile karakterize edilen spesifik olmayan hücresel bağışıklık tepkilerini artırabilir [20]. Probiyotik suşlar, TJ modülasyonu yoluyla bağırsak epitelinin özelliklerini iyileştirir ve spesifik probiyotik suşların müsin ekspresyonunu düzenlediği, böylece mukus tabakasının özelliklerini etkilediği ve dolaylı olarak bağırsak bağışıklık sistemini düzenlediği gösterilmiştir [21]. Laktik asit bakterileri (LAB) ve Bifidobacterium suşları birçok alanda kullanılan başlıca probiyotiklerdir [22-26]. * Sağlıkla ilgili işlevlerinde önemli bir faktör olan antioksidan kapasiteleriyle birlikte sağlık yararları çoktur[27]. Probiyotikler, oksidasyonu katalize etmelerini önlemek için metal iyonlarını şelatlayabilir [28, 29]; ayrıca antioksidan enzimlerin ekspresyonunu artırabilir [30, 31], antioksidan aktiviteye sahip çeşitli metabolitler üretebilir [32, 33], antioksidan sinyal yollarına aracılık edebilir [34-36] ve reaktif oksijen türleri (ROS) üreten enzimleri ve bağırsak tepkisini düzenleyebilirler. Mikroorganizmaları oksidatif strese karşı [37]. Yakın tarihli bir çalışma, CD'nin polisakkaritlerinin, insan sağlığına fayda sağlayabilecek bazı laktik asit bakterilerinin büyümesini uyarabildiğini göstermiştir [38]. Bununla birlikte, CD'deki polisakkaritlerin içeriği CT'dekinden farklıdır [7, 39] ve bu farklılık bağırsak mikroorganizmalarında farklı etkilere yol açabilir. Ayrıca, CD polisakkaritleri NRF2/HO-1 yolunu aktive ederek oksidatif stresi azaltabilse de [15], tek polisakkaritlerin etkileri CT'deki çoklu kompozisyonların genel etkisinden farklı olabilir. *biz, CT sulu ekstraktlarının bağırsak mikroorganizmaları üzerindeki etkilerini kesin olarak tanımlamak gerekir. Ek olarak, fanlar aynı zamanda oksidatif strese [40] direnebilir ve Keap1/Nrf2/HO-1 yolunu [41] aktive ederek lipolisakka sürüşü aracılı inflamatuar yanıtları baskılayabilir. *önceden, CT sulu ekstraktının etkisini belirlemek çok değerlidir. Ek olarak, sulu CD ekstraktının belirli bileşenlerinin oksidatif stres ve bağırsak florası üzerindeki etkileri, oksidatif strese karşı direncin bağırsak florası değişiklikleri ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Yukarıda bahsedilen konulardaki bilgi boşluklarını doldurmak için CTaqueous ekstraktının bağırsak florası bozukluğu olan farelerin bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkilerini araştırdık. *bu sonuçlar, bağırsak florasını değiştiren ve oksidatif strese karşı bağırsak direnci veren olası mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır.

2. Malzemeler ve Yöntemler

her gün 12:00 s'de uygulandı ve diğer maddeler günlük olarak 15:00 s'de uygulandı. Deneyler sırasında, C, D, E ve F grupları, bağırsak bozukluklarının model durumunda tutuldu. *dışkılar her yedi günde bir steril bir ameliyat masasında toplandı ve -20 derecede .2.4'te saklandı. Fare Kolonunun Histopatolojik Gözlemi. Deneyin sonunda fareler servikal dislokasyon ile öldürüldü ve kolon içerikleri steril bir ameliyat masasına toplandı ve -80 derecede saklandı; aynı zamanda, kolonik doku numuneleri yüzde 10 nötr formalin içinde sabitlendi.*en, numuneler gradyan etanol konsantrasyonu kullanılarak dehidre edildi, ksilen kullanılarak hyalinize edildi, parafine gömüldü, kesitler alındı ​​ve hematoksilen-eozin ile boyandı. Kolonik mukozadaki morfolojik değişiklikler gözlendi ve bir optik mikroskop kullanılarak karşılaştırıldı. Kolonda villus uzunluğu ve kript derinliği ölçüldü ve villus uzunluğunun kript derinliğine oranı (V/C değeri) hesaplandı (51).2.5. DNA Ekstraksiyonu ve Kütüphane İnşası. Üreticinin protokolüne göre EZNA ®Soil DNA Kiti (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, ABD) kullanılarak dışkılardan DNA ekstrakte edildi. DNA kalitesi bir florometre (QuantiFluor™–ST, Promega Corporation, ABD) kullanılarak belirlendi. 16s rDNA'nın V3-V4 bölgesindeki eşleştirilmiş primerler, bölgeyi büyütmek ve 466 bp DNA fragmanı üretmek için tasarlanmıştır. *e ileri primer 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-) ve ters primer 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-) idi. Her bir PCR hacmi 25 μL idi ve 2.5 μL 10 x PCR tamponu, 2 μL dNTP, her primerden 1 μL ve 20-30 ng şablon DNA içeriyordu. *tr, dizine alınmış bağdaştırıcılar, dizileme kitaplıkları oluşturmak için amplikonların sonuna eklenmiştir. *kütüphaneler bir QuantiFluor™ florometre kullanılarak doğrulandı ve 10 nmol.2.6'ya nicelleştirildi. 16s rRNA Gen Dizilemesi ve Mikrobiyal Topluluk Analizi. *e Illumina platformu (Illumina MiSeq) 2 × 250 bp eşleştirilmiş uç verileri elde etmek için kullanıldı. Operasyonel taksonomik birimler (OTU'lar), Uparse yazılımı kullanılarak yüzde 97 benzerlikle standart kümeleme yoluyla elde edildi. * OTU'ları Greengene veri tabanı Sürüm 13.5 ile hizalamak ve tür açıklamalarını gerçekleştirmek için RDP sınıflandırıcısının saf Bayes atama algoritması kullanıldı. *e bağırsak mikrobiyotasının alfa çeşitliliği Shannon ve Simpson endeksleri kullanılarak hesaplandı ve gruplar arasındaki farklar lineer diskriminant analizi Effffect Size (LEfSe) ile analiz edildi. *e beta çeşitliliği, Brady-Curtis farklılıklarının ana koordinat analizi (PCoA) ile analiz edildi. PICRUSt2, bağırsak mikrobiyomunun mikrobiyal metabolik kapasitesini tahmin etmek için kullanıldı [42].2.7. İstatistiksel Veri Analizi. Tek yönlü ANOVA için SPSS 20 kullanıldı ve deneysel veriler X ± S olarak ifade edildi; X, ortalama değeri, S ise standart sapmayı gösterir.

Bağışıklığı iyileştirmek için Cistanche

3. Sonuçlar

3.1. 8 CT Sulu Ekstraktının Kolon Morfolojisi Üzerindeki Etkisi.*e temsili bileşikler (ekinakozit ve asetonid) ve bunların CT ekstraktının konsantrasyonları HPLC ile doğrulanmıştır (Şekil S1). Sulu ekstraktın bağırsak üzerindeki etkisini belirlemek için, sulu ekstrakt ile muameleyi takiben kolon villuslarının uzunluğunu ve girintilerin derinliğini araştırdık. * Normal ve yüksek doz gruplarındaki (A, B ve D) kolon villusları daha uzun ve parmak şeklindeyken, model ve düşük doz gruplarındaki (C ve F) kolon villusları kısaydı ve uçların uçları kısaydı. kolon villusları kırıldı (Resim 1). Buna göre, yüksek doz CT sulu özütü, model grubundaki farelere kıyasla, bağırsak bozukluğu olan farelerde kolon villusunun uzunluğunu önemli ölçüde arttırdı ve girinti derinliğini azalttı (P < 0.01).="" buna="" karşılık,="" yüksek="" doz="" grubu="" ile="" normal="" grup="" arasında="" girinti="" derinliği="" anlamlı="" derecede="" farklı="" değildi="" (p=""> 0.05) (Tablo S1). *bu sonuçlar, CT sulu ekstresinin yüksek dozunun, bağırsak bozuklukları olan farelerin kolonu içindeki morfolojiyi iyileştirebileceğini göstermiştir.3.2. 8e CT Sulu Ekstraktının Bağırsak Mikrobiyotasının Çeşitliliği Üzerindeki Etkisi. Kolon içindeki morfolojik değişikliklerin potansiyel nedenini araştırmak ve CT sulu ekstresi ile muameleyi takiben bağırsak mikrobiyotasındaki değişiklikleri araştırmak için 16s rRNA gen dizilimi gerçekleştirdik. Ham verilerden 77.734 ila 125.144 arasında değişen ortalama 100.553 etkili etiket elde edildi (Tablo S2). *geyikler 4932 OTU'da kümelenmiştir (Tablo S3). Daha sonra Theseus'a dayalı olarak bağırsak mikrobiyotasının çeşitliliğini analiz ettik. *e Shannon ve Simpson indeksleri, A grubu (CT sulu özütüyle normal) ve B grubu (CT sulu özütü olmadan normal) arasında hiçbir fark göstermedi (Şekil 2(a)). *sefiksim tedavisi olmayan farelerde, CT sulu ekstraktının, bağırsak mikrobiyotasının çeşitliliği üzerinde hiçbir ek yararlı veya zararlı etkisi olmayabileceği belirtilmiştir. Ancak model grubundaki (C) -çeşitlilik normal gruplara göre azalan bir eğilim göstermiştir. *e yüksek ve orta doz CT sulu özütlerle tedavi edilen fareler, çeşitlilikte iyileşme belirtileri gösterirken, düşük doz CT sulu özü ile tedavi edilen farelerde böyle bir fenomen gözlenmedi (Şekil 2(a)). Bu arada, PCoA, yüksek doz (D) ve orta doz (E) CTaqueous ekstreleri uygulanan normal grupların (A ve B) ve bağırsak bozukluğu gruplarının, model grubundakilerden daha kısa örnekler arası mesafelere sahip olma eğiliminde olduğunu ortaya çıkardı. -doz CTaqueous özü ek grubu (F) (Şekil 2(b)). *sonuçlar, CT sulu özütünün, bağırsak bozuklukları olan farelerde bağırsak mikrobiyotasının çeşitliliğini iyileştirmeye yardımcı olabileceğini gösterdi.

3.3. CT Sulu Ekstrakt ile Tedavi Edilen Gut Mikrobiyotasının Bileşimindeki Değişiklikler. *e mikrobiyota kompozisyon profilleri farklı gruplar arasında karşılaştırılmıştır. Filum düzeyinde, model grubundaki Proteobakterilerin nispi bolluğu diğer gruplardakinden daha yüksekti.

Şekil 1: *e sulu Cistanche tubulosa (CT) ekstraktının kolon morfolojisi üzerindeki etkisi: A, orta doz sulu Cistanche tubulosa (CT) ekstraktı eklenmiş normal bir grup; B, normal grup; C, model grubu; D, yüksek dozlu CT sulu özüt eklenmiş model grubu;E, orta doz CT sulu özüt eklenmiş bir model grubu; F, düşük dozlu CT sulu özüt eklenmiş bir model grubu. (a) GrupA. (b) B Grubu. (c) C Grubu. (d) D Grubu. (e) E Grubu. (f) F Grubu.

(Şekil 3(a)). *Proteobacteria'daki artış, model farelerin mikrobiyomunun sefiksim tarafından değiştirildiğini ve Proteobacteria'nın artan prevalansının düzensiz bağırsak florasının bir merkez belirteci olduğu için CT sulu ekstraktının bağırsak mikrobiyotasına fayda sağlayabileceğini ileri sürdü [43–45]. Ek olarak, cins düzeyinde, model grubundaki Lactobacillus'un nispi bolluğu, normal ve yüksek doz gruplarına kıyasla azalmıştır; ancak orta ve düşük doz grubuna göre arttı(Şekil 3(b)). *bu sonuçlar, yüksek dozda CTaqueous özütünün Lactobacillus cinsinden bazı bakterilerin büyümesini destekleyebileceğini göstermiştir. Çalışılan gruplar arasındaki farklı mikrobiyota, LEfSe analizine göre ayrıca belirlendi. *analiz, sefiksim ile tedaviden sonra Turicibacter, Alphaproteobacteria, Acidobacteria, Betaproteobacteriales ve Chloroflflexi'nin nispi bolluklarının önemli ölçüde arttığını, buna karşın lactobacillus, Eubacterium_nodatum_group, Pseudono'nun nispi bolluklarının önemli ölçüde arttığını göstermiştir. cardiales ve Christensenellaceae_R-7_grubu normal gruba göre anlamlı olarak azaldı(Şekil 4(a)). Çarpıcı bir şekilde, model grubuna yüksek dozlu CT sulu özüt eklendiğinde, Muribaculaceae, Lactobacillus, Kin eosporiaceae, Eubacterium no datum grubu ve Pedobacter'in nispi bollukları model grubundakilere kıyasla önemli ölçüde arttı. Bu arada, Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostri dium_9 ve Candidatus Stoquefifichus'un nispi bollukları model grubundakilere kıyasla önemli ölçüde azaldı (Şekil 4(b))

Şekil 2: Fare dışkısının bağırsak mikrobiyota çeşitlilik analizi. (a) -Shannon indeksi (A) ve Simpson indeksi (B) ile ölçülen bakteri topluluklarının çeşitliliği; (b) Bray-Curtis farklılıklarına dayalı verileri görselleştiren temel koordinat analizi (PCoA) grafiği.A, orta doz sulu Cistanche tubulosa (CT) özü eklenmiş normal grup; B, normal grup; C, model grubu; D, yüksek doz CT sulu ekstrakt eklenmiş model grubu; E, orta doz CT sulu özüt eklenmiş model grubu; F, düşük dozlu CT sulu özü eklenmiş model grubu.