Bölüm 1 Cistanche Tubulosa'dan Feniletanol Glikozitlerin Sıçanlarda Bovine Serum Albumin ile İndüklenen Hepatik Fibrozis Üzerindeki Önleyici Etkileri

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Soyut

Arka fon:Cistanche tübüloza bağışıklığı düzenlemek için yaygın olarak kullanılan geleneksel bir Çin bitkisel ilacıdır.Cistanche kaynaklı fenil etanol glikozitler(CPhG'ler) bu bitkiden elde edilen başlıca etkili malzemelerdir. Bu çalışmanın amacı, CPhG'lerin sıçanlarda BSA ile indüklenen hepatik fibroz ve hepatik stellat hücreleri içeren ilgili moleküler mekanizmalar üzerindeki önleyici ve terapötik etkilerini değerlendirmektir. Bir başka geleneksel Çin bitkisel ilacı olan Biejiarangan (BJRG), pozitif kontrol olarak kullanıldı. Yöntemler: İn vivo deneylerde, 75 SD sıçan rastgele 6 gruba ayrıldı: normal (damıtılmış suyla işlenmiş), model (BSA ile muamele edilmiş), pozitif ilaç (BSA ile muamele edilmiş artı BJRG 60{{29} } mg/kg/gün) ve BSA ile tedavi edilen artı CPhG'ler (125, 250 ve 500 mg/kg/gün) grupları. Karaciğer ve dalak indeksleri, serum aspartat aminotransferaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT), heksadekenoik asit (HA), laminin (LN), tip III prokollajen (PCIII), tip IV kollajen (IV-C), hidroksiprolin ( Hyp) ve dönüştürücü büyüme faktörü 1 (TGF- 1) sıçan karaciğerlerinde ölçüldü. Karaciğer fibrozu için histopatolojik dereceler, H&E ve Masson'un trikrom boyaması kullanılarak her grup için değerlendirildi. TGF- 1, kollajen I (Col-I) ve kollajen III (Col-III) ekspresyonu, bir immünohistokimyasal boyama yöntemi ile belirlendi. Bu etkiler, kantitatif gerçek zamanlı PCR analizleri ile NF-KB p65 ve Col-I'in ekspresyon seviyeleri belirlenerek in vitro olarak ayrıca değerlendirildi. Col-I protein ekspresyonu da western blotlama ile incelendi. Sonuçlar: CPhG'lerin tüm doz grupları (125, 250 ve 500 mg/kg/gün) karaciğer ve dalak indeksini önemli ölçüde azalttı, ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C serum seviyelerini düşürdü, TGF- 1 içeriği (P < 0.01,="" p="">< 0.01="" ve="" p="">< 0.01)="" ve="" hyp="" içeriği.="" cphg'ler="" ayrıca="" karaciğer="" hücrelerinin="" şişmesini="" önemli="" ölçüde="" hafifletti="" ve="" hepatosit="" nekrozu="" ve="" inflamatuar="" hücre="" infiltrasyonunu="" etkili="" bir="" şekilde="" önledi.="" immünohistokimyasal="" sonuçlar,="" cphg'lerin="" tgf-="" 1="" (p="">< 0.01,="" p="">< 0.01="" ve="" p="">< 0.01),="" col-="" i="" ve="" col-iii'ün="" ekspresyonunu="" önemli="" ölçüde="" azalttığını="" gösterdi.="" cphg'lerin="" (100,="" 75,="" 50="" ve="" 25="" ug/ml)="" hsc-t6="" üzerindeki="" in="" vitro="" etkileri,="" cphg'lerin="" nf-κb="" p65="" ve="" col-i'in="" mrna="" ekspresyonunu="" önemli="" ölçüde="" azalttığını="" ve="" cphg'lerin="" ayrıca="" col-i="" protein="" ekspresyonunu="" aşağı="" regüle="" ettiğini="" gösterdi.="" sonuçlar:="" cphg'lerin="" önemli="" bir="" anti-hepatik="" fibroz="" etkisi="" vardır="" ve="" hepatik="" fibrozun="" tedavisi="" için="" hepatoprotektif="" ajanlar="" olarak="">

Anahtar Kelimeler: Hepatik fibroz, Cistanche tubulosa, Feniletanol glikozit, Kemokin BSA, Önleme ve tedavi.

Arka fon

Hepatik fibrozis, çeşitli faktörlerin neden olduğu kronik hepatitin patogenezinde ortaya çıkan ciddi karaciğer hasarına karşı bir yara iyileşmesi yanıtıdır. Bu faktörler viral enfeksiyon, alkol kötüye kullanımı, kolestaz ve metabolik ve otoimmün hastalıklardır [1-3]. Hücre dışı matrisin (ECM) ilerleyici birikimi ve yeniden şekillenmenin azalması, karaciğerin normal yapısını bozarak hepatik fibrozise neden olur [4]. Hepatik fibroz, kronik karaciğer hastalığında kritik öneme sahiptir ve sıklıkla geri dönüşü olmayan siroz ve karsinogenezde gelişir. Şu anda hepatik fibrozisin tedavisi için herhangi bir yöntem veya etkili ilaç bulunmamaktadır. Bu nedenle, karaciğer hasarının fibrozis ve kansere ilerlemesini azaltacak bir anti-hepatik fibroz ilacının bulunması acildir.Cistanche tübülozaW (Orobanchaceae familyasından), Çin'in Sincan'ın güney bölgesinde yaygın olarak yetiştirilen parazitik bir bitkidir [5]. İnsanlar genellikle böbrekleri canlandırmak, kanı beslemek, bağırsakları rahatlatmak ve yaşlanmayı geciktirmek için kullanırlar. Çin Farmakopesinde resmi olarak listelenmiştir [6]. C. tubulosa çeşitli aktif bileşenler içerir. Bunlar şunları içerir:Cistanche kaynaklı fenil etanol glikozitler(CPhG'ler), iridoidler ve polisakkaritler. Birçok aktif bileşenden biri olarakC. tübülozaCPhG'ler hem in vivo hem de in vitro çalışmalarda ikna edici antioksidan, yorgunluk önleyici, nöroprotektif ve antienflamatuar etkiler göstermiştir [7]. Son yıllarda, CPhG'lerin (Cistanche kaynaklı fenil etanol glikozitler) hepatoprotektif etkileri vardır. Bu etkilerin altında yatan potansiyel mekanizmalar, serbest radikallerin temizlenmesi, hepatik membranların korunması, immünoregülasyon, apoptozun inhibisyonu, HBsAg ve HBeAg ekspresyonunun inhibisyonu ve HBV DNA replikasyonunun inhibisyonu ve diğerleridir [8-11]. Bununla birlikte, literatürde grafiklerin anti-hepatik fibrozis etkisini ele alan az sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu nedenle, bu çalışma, sıçanlarda sığır serum albümini (BSA) ile indüklenen hepatik fibrozis modelini kullanarak GPhC'lerin anti-hepatik fibroz etkisini araştırmayı amaçladı. HSC-T6 hücrelerinde ilgili moleküler mekanizmalar araştırıldı.

yöntemler

kimyasallar ve tepkimeler

Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü'nden (Çin) bir Hidroksiprolin kiti (Alkalin hidroliz) (Lot: 20140616) satın alındı. Sıçan TGF- 1 sandviç ELISA kitleri (Lot: 238240615) Lianke Biotech Co., Ltd.'den (Çin) satın alındı. Tavşan Anti-Kollajen I antikoru (Lot: 140619), Tavşan Anti-Kollajen III antikoru (Lot: 980788 W) ve Tavşan Anti-TGF- 1 antikoru (Lot: 140619) Beijing Biosynthesis Biotechnology Co. tarafından sağlandı, LTD (Çin). Normal koyun serumu (çalışma sıvısı) (Lot: WP141214), PV-6000 (Lot: WK141225) ve DAB kiti (Lot: K136621D) ile birlikte Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd.'den (Çin) satın alındı. . Primer antikorların tespiti, Invitrogen Company'den (ABD) satın alınan 2. Antikor solüsyonu (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) ve 2. Antikor solüsyonu (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (lot: 272387) kullanılarak yapıldı. ). Sığır serum albümini (BSA) (Lot: SLBG8239V), Sigma'dan (ABD) satın alındı. Kullanımdan önce, normal salin içinde 18 g/L'de BSA hazırlandı, bakteriler süzülerek çıkarıldı ve BSA 4 derecede saklandı. Koyun kılından elde edilen 1 g lipid içeren Freund'un eksik adjuvanı (Lot: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Çin), 2 g sıvı parafin ile karıştırıldı (Lot: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Çin), buharlı otoklavda sterilize edildi ve 4 derecede saklandı.BJRG pozitif ilacı Biejiarangan tabletleri olarak Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd.'den (Çin) elde edildi.BJRG ilaç stokları çözündürülerek hazırlandı. 600 mg/kg konsantrasyonda damıtılmış su içinde BJRG tabletleri.

Bitki malzemeleri

C. tübüloza(Orobanchaceae familyası), Çin'in Sincan'ın Minfeng bölgesinden satın alındı. Materyal, Xinjiang Materia Medica Enstitüsü, Uygur Tıbbı için Kilit Laboratuvar'dan araştırmacı Jun Zhao tarafından doğrulandı. Kupon örnekleri, Xinjiang Materia Medica Enstitüsü'ne yatırıldı.

CPhG'lerin hazırlanması(Cistanche kaynaklı fenil etanol glikozitler)

Kurutulmuş ve dilimlenmiş rizomlarC. tübüloza(6.0 kg), arka arkaya üç kez yüzde 70 etanol ile geri akış altında özümlendi ve çözücü, etanol özütünü verecek şekilde çıkarıldı. Etanol özleri, fenil etanol glikozitleri (CPhG'ler) elde etmek için AB-8 reçinesi kullanılarak saflaştırıldı. Hayvan çalışmalarında (sırasıyla 500 mg/kg, 250 mg/kg ve 125 mg/kg) farklı doz grupları için kullanılan CPhG'lerin stok çözeltileri yüzde 0,5 (5 g/L) karboksimetil selüloz (sodyum tuzu) içinde çözülmüştür.

CPhG'lerin Kantifikasyonu(Cistanche kaynaklı fenil etanol glikozitler)

CPhG'lerdeki iki bileşenin (ekinakozit ve akteosit) içeriği, daha önce bildirilen bir yöntem kullanılarak HPLC ile belirlendi (Zhang ve diğerleri 2004) [12]. HPLC, bir UV detektörü ile donatılmış bir Shimadzu LC-10A HPLC kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HPLC kolonu bir Phenomenex Gemini ODS kolonuydu (250 x 4.6 mm, 5 um). İzokratik hareketli faz yüzde metanol-asetonitril-1 asetik asitten (15:10:75, v/v/v) oluşuyordu. Elüsyon 40 dakikaydı ve akış hızı 0.6 mL/dk'da tutuldu. Kolon sıcaklığı 30 derecede sabit tutulmuştur. UV tespiti 334 nm'deydi.

Hayvanlar ve HSC-T6 hücre hattı

[Sınıf SPF] sağlıklı yetişkin erkek Sprague–Dawley (SD) sıçanları (180–220 g), Xinjiang Tıp Üniversitesi Hayvan Merkezi'nden, Lisans No.: SCXK (Yeni) 2011–0004'ten satın alınmıştır. Sıçanlar spesifik patojen içermeyen (SPF) yemle beslendi. Hayvan deneyleriyle ilgili tüm prosedürler, Sincan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı. Sıçanlar, kontrollü çevre koşulları (25 derece ve 12 saat aydınlık/karanlık döngüsü) altında kafeslere yerleştirildi ve standart sıçan pelet yemi ve musluk suyuna serbest erişime sahipti. Sıçanlar tedaviden önce iklime alıştırıldı. Ölümsüzleştirilmiş bir sıçan hepatik yıldız hücre dizisi HSC-T6, Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD'den elde edildi. (Vuhan, Çin). HSC-T6 hücreleri, yüzde 10 fetal sığır serumu (Gibco, Güney Amerika), 100 IU/ml penisilin ve 100 ug/ml streptomisin (Pekin) ile takviye edilmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unda (Yüksek Glikoz) (DMEM, Beijing, Çin) kültürlendi. , Çin) yüzde 5 CO2 ile 37 derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde.

BSA kaynaklı karaciğer hasarı ve tedavileri

Yetmiş beş SD sıçanı rastgele altı gruba ayrıldı: Normal (damıtılmış suyla muamele edilmiş), model (BSA ile muamele edilmiş), pozitif ilaç (BSA ile muamele edilmiş artı BJRG 600 mg/kg/gün) ve BSA ile muamele edilmiş artı CPhG'ler(Cistanche kaynaklı fenil etanol glikozitler)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/gün) grupları. BSA ile tedavi edilen artı CPhG'ler (125, 250, 500 mg/kg/gün) grupların her birinde 13 sıçan ve diğer grupta her grupta 12 sıçan vardı. BSA'nın neden olduğu karaciğer hasarı modeli, birincil duyarlılaşmaya ve ardından immünolojik bir saldırıya bölünür) [13]. Normal grup dışında, diğer gruplara, birincil sensitizasyon için 1. gün, 15. gün, 22. gün, 29. gün ve 36. günde 0.5 ml (9 mg/ml) BSA Freund'un eksik adjuvanı ile çoklu subkutan enjeksiyonlar uygulandı. Beşinci enjeksiyondan yedi gün sonra, sıçan retinal ven pleksusundan kan alındı ​​ve serum albümin antikorları için test edildi. Sıçan serumundaki BSA antikoru, bir çift agar difüzyon yöntemiyle saptandı. Saldırı enjeksiyonu, BSA antikoru pozitif sıçanlarda kaudal venden normal salin içinde 0.4 ml BSA'nın haftada iki kez on kez uygulanmasıyla yapıldı. Enjeksiyonların konsantrasyonları ve süreleri 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 ve 10.00 idi. g/L sırasıyla 46. günde, 50. günde, 53. günde, 57. günde, 60. günde, 64. günde, 67. günde, 71. günde, 74. günde ve 78. günde. Normal grupta, immünolojik birincil (duyarlılık) ve ikincil (saldırı) enjeksiyonlar için BSA yerine normal salin kullanıldı ve diğer koşullar model grubundakilerle aynıydı. Normal gruba ağızdan 10 ml/kg/gün distile su verildi. Model grubuna ağızdan 10 ml/kg/gün yüzde 0,5 CMC-Na solüsyonu uygulandı. Pozitif ilaç grubuna oral yoldan 600 mg/kg/gün BJRG verildi. BSA ile tedavi edilen artı CPhG'ler (125,

250 ve 500 mg/kg/gün) gruplarına oral yoldan 125, 250 ve 500 mg/kg/gün CPhG'ler uygulandı.(Cistanche kaynaklı fenil etanol glikozitler), sırasıyla. Günlük dozlama sıçanları, son enjeksiyondan sonra iki hafta boyunca devam etti. Deney periyodundan sonra, sıçanlar yüzde 10 kloral hidrattan önce 12 saat aç bırakıldı ve ardından hemen ötenazi yapıldı. Her sıçandan serum örnekleri toplandı ve hemen kullanıldı. Karaciğerler iki amaç için toplandı: (1) Hyp kitleri için sıvı nitrojen içinde koruma ve (2) histolojik ve immünohistokimyasal incelemeler için yüzde 10 formaldehit içinde sabitleme. Hayvan çalışmalarının tüm süresi 93 gündü.

Karaciğer ve dalak indeksleri

Karaciğer ve dalak laparotomi ile diseke edildi ve 4 derece normal salinlerle yıkandı. Fazla suyu filtre kağıdı ile emdikten sonra, karaciğer ve dalak karşılık gelen indeksleri hesaplamak için tartıldı: Bağıl organ ağırlığı=organ kütlesi (g)/bireysel vücut kütlesi (g) × yüzde 100 [14].

hücre deneyleri

HSC-T6 hücreleri, bir 96-yuvalı plakaya kaplanmıştır. Başlangıçta hücreler, 48 saat boyunca yüzde 10 FBS içeren DMEM ile kültürlendi. Ortam daha sonra hücreleri 12 saat aç bırakmak için FBS içermeyen DMEM ile değiştirildi. Hücreler daha sonra 24 saat süreyle 5.0 ng/mL TGF- 1 (FBS'siz) içeren DMEM ile kültürlendi. Son olarak, farklı CPhG konsantrasyonları(Cistanche kaynaklı fenil etanol glikozitler)(100ug/ml, 50ug/ml ve 25ug/ml), asteosit (6 ug/ml, 3 ug/ml ve 1.5 ug/ml) ve ekinakozit (500ug/ml, 250ug/ml ve 125ug/ml) plakada dörtlü kuyucuklarda gerçekleştirildi ve 48 saat inkübe edildi.

Gerçek zamanlı PCR analizi

NF-KB, p65 ve kollajen I'in mRNA ekspresyon seviyesi, gerçek zamanlı PCR ile belirlendi. HSC-T6 hücrelerinde mRNA ekspresyonlarını belirlemek için hücreler (4 x 105 hücre), yüzde 10 FBS içeren 3 mL DMEM'li altı oyuklu plakalara ekildi ve gece boyunca 37 derece ve yüzde 5 CO2'de inkübe edildi, ardından hücre kültürü ortamı serumsuz DMEM ile değiştirildi. Daha sonra, CPhG'ler(Cistanche kaynaklı fenil etanol glikozitler)(100 ug/ml, 50 ug/ml ve 25 ug/ml), asteosit (6 ug/ml, 3 ug/ml ve 1.5 ug/ml) ve ekinakozit (500 ug/ml) , 250 ug/ml ve 125 ug/ml) oyuklara eklendi. CPhG'ler veya monomerik kompozisyonlar ile 48 saatlik inkübasyondan sonra, toplam RNA, TRIzol reaktifi (Invitrogen, ABD) kullanılarak özümlendi ve 15 saniye boyunca kloroform ile kuvvetli bir şekilde çalkalandı. Oda sıcaklığında 3 dakika bekletildikten sonra, lizat 12,000 × g'de 15 dakika 4 derecede santrifüjlendi. Sulu fazdaki RNA, izopropanol ile çökeltildi ve üst sulu faz, yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. RNA, yüzde 0.75 etanol eklenerek çöktürüldü, ardından mikrosantrifüj tüpü ve 12,000 x g'de 4 dereceden en fazla 5 dakika santrifüjlendi. Süpernatant uzaklaştırıldı ve RNA oda sıcaklığında 5-10 dakika kurutuldu. Sıçan-aktin [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1] ve NF'nin amplifikasyonu için kullanılan spesifik primer setleri (Sangon, Shanghai, China) -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] genleri Batch Primer 3 kullanılarak tasarlandı. İleri (fw) ve ters (rv) primerleri aşağıdaki gibidir: Kollajen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -aktin (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Sonuçlar, bir iç kontrol olarak temizlik geni -aktin'in mRNA'sına normalleştirildi ve nispi mRNA seviyeleri olarak sunuldu. Reaksiyonlar 8 μL iQ SYBR Green Supermix, 1 μL 10 pM primer çifti, 8,5 μL distile su ve 2,5 μL cDNA ile gerçekleştirilmiştir. Her polimeraz zincir reaksiyonu, aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilmiştir: 95 derece 3 dakika, ardından 40 döngü 95 derecede 10 sn, 55 derecede 30 sn ve uzatma için 55 derece – 95 derece 10 sn, ardından tekli floresan ölçümü . Nihai sonuçlar, bağıl değerlerle (2-ΔΔCt) tanımlandı. Hesaplama ve analiz, iQ5 Real-Time PCR Detection System ile yapılmıştır.

Western blot analizi

Kollajen I (Abcam, Cambridge, UK, Art No: ab34710) protein ekspresyon seviyeleri, bir temizlik kontrolü olarak Western blot [with -actin (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, Çin) ile belirlendi. Tüm hücre özütleri, yüzde 1 Halt proteaz inhibitör kokteyli (Thermo Scientific, ABD) ve yüzde 1 Halt fosfataz inhibitör kokteylleri (Thermo Scientific, ABD) içeren Radioimmunopresipitasyon tahlili (RIPA) (Thermo Scientific, ABD) tamponu kullanılarak hazırlandı. Protein konsantrasyonu, Bradford yöntemi [18] ile ölçüldü ve nicelendirildi. Protein (10-50 ug), yüzde 10'luk bir SDS-PAGE jeli üzerinde ayrıldı ve PVDF membranlarına (Millipore, ABD) aktarıldı. Zarlar 1 saat boyunca oda sıcaklığında yüzde 5 BSA ile bloke edildi ve birincil antikorlar (Anti-Colla gen I antikoru, 1:200 seyreltme veya -aktin fare mAb'si, 1:5000 seyreltme) gece boyunca 4 derecede inkübe edildi. İlgili Alk-Phos. konjuge sekonder antikorlar oda sıcaklığında inkübe edildi. Son olarak, membranlar yüzde 0.1 Tween 20 içeren 1 x Tris-HCl salin ile üç kez yıkandı ve sinyaller GEL DOC XR Görüntüleme Sistemi (Bio-Rad) ile tarandı ve görselleştirildi. İlgilenilen proteinler üzerinde dansitometrik analiz yapıldı ve GEL DOC Image Studio yazılımı (Bio-Rad) ile -aktine normalleştirildi. -aktin iç kontrol olarak kullanıldı.

istatistiksel analiz

Normalliği doğrulamak için Shapiro-Wilk normallik testi ve Levene varyans homojenlik testi uygulanmış ve You ve ark. DARU Farmasötik Bilimler Dergisi (2015) 23:52 Sayfa 4 / 13 varyans homojenliği. Varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin post hoc testi, homojen olmayan, normal dağılan verilerdeki istatistiksel farklılıkları belirlemek için kullanıldı. Normal dağılmayan veya homojen olmayan verileri analiz etmek için Kruskal-Wallis parametrik olmayan testi kullanıldı. Sonuçlar ortalama ± SD olarak ifade edildi. Önem, P < 0.05="" olarak="" belirlendi.="" tüm="" veriler="" spss="" 16.0="" yazılımı="" (sincan="" tıp="" üniversitesi)="" ile="" analiz="">

Sonuçlar

CPhG'lerin kantitatif tayini

C. tubulosa'daki CPhG'ler iki feniletil alkol glikozit, ekinakozit ve asteozit içerir ve bunların CPhG'lerdeki içerikleri HPLC analiziyle (Şekil 1) yüzde 42.71 ± 0.42 ve 14.27 ± {{7 olarak belirlendi. }}, sırasıyla yüzde 18 .

Karaciğer ve dalak indeksleri

Tablo 1'de gösterildiği gibi, model grubunun karaciğer ve dalak indeksleri önemli ölçüde yükselmiştir [P < 0.01,="" p="">< 0.05].="" pozitif="" ilaç="" bjrg="" ve="" cphg'lerin="" farklı="" doz="" gruplarında="" karaciğer="" ve="" dalak="" endeksleri,="" model="" grubu="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0" ile="" karşılaştırıldığında="" önemli="" ölçüde="" azaldı.="" 004,="" pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," sırasıyla].="" karaciğer="" ve="" dalak="" indeksleri,="" model="" grubuna="" göre="" daha="">

CPhG'lerin ALT, AST aktiviteleri ve karaciğer fibroz belirteçleri üzerindeki etkileri

Bu çalışmada, model grubunda karaciğer enzimleri AST ve ALT'nin serum seviyeleri, BSA'nın neden olduğu karaciğer fibrozisi sıçanlarında hepatoselüler hasarı yansıtacak şekilde önemli ölçüde arttı. Ancak deneyler.

BJRG (600 mg/kg) ve CPhGs (125, 250 ve 5{{10}}0) ile tedavinin mg/kg) AST'yi önemli ölçüde azalttı [GEÇMİŞ < 0.0{{60}}1,="" geçmiş="">< 0.001,="" geçmiş="">< 0,001,="" geçmiş="">< 0,001="" ,="" sırasıyla]="" ve="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," sırasıyla]="" hepatik="" fibroz="" sıçanlarında="" .="" (tablo="" 2).="" model="" sıçanlarda="" ha,="" ln,="" pc="" ve="" iv-c="" seviyeleri="" önemli="" ölçüde="" arttı="" [pha="">< 0.001,="" pln="">< 0.001,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0.001).="" model="" grubu="" ile="" karşılaştırıldığında,="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," sırasıyla],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," sırasıyla],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," sırasıyla]="" ve="" iv-c="" [p="" iv-c="">< sıçanlarda="" 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,]="" farklı="" doz="" gruplarında="" (125,="" 250="" ve="" 500="" mg/kg)="" (tablo="" 3).hyp="" içeriği="" ve="" tgf-="" 1="" kollajen="" içeriği="" de="" karaciğer="" dokusundaki="" hyp="" seviyeleri="" ölçülerek="" tespit="" edildi.="" tablo="" 4'te="" gösterildiği="" gibi,="" ortalama="">model grubundaki seviye normal gruptan önemli ölçüde yüksekti, ancak BJRG grubunda ve farklı CPhGs doz gruplarında belirgin şekilde azaldı. Sıçanlarda model grubunun TGF{{0}} hepatik konsantrasyonu önemli ölçüde arttı [P < 0.001].="" model="" grubu="" ile="" karşılaştırıldığında,="" pozitif="" ilacın="" tgf-="" 1="" seviyeleri="" ve="" farklı="" cphgs="" doz="" grupları="" belirgin="" şekilde="" azaldı="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" sırasıyla].="" sonuçlar="" tablo="" 4'te="">

Histopatolojik inceleme

H&E ve Masson trikromu ile boyanmış normal karaciğer dokusu kesitlerinin gözlemleri, farklı hepatik lobüller ve hepatik sinüzoidler sergiler. Model sıçanlardaki karaciğer dokusu yapısı bozuktu ve karaciğer dokusu ve hepatik sinüzoidlerin yerini büyük miktarda bağ dokusu aldı. Ancak tedavi grubunda model grubuna göre daha normal hücre mimarisi ve daha az bağ dokusu tespit edildi.

H&E boyama

Normal grupta anormal portal alanlar ve hepatik sinüzoidler olmaksızın hepatik lobül yapısal bütünlüğü gözlendi. Karaciğer kordonları, çekirdek yuvarlak ve şeffaf olacak şekilde düzenli bir şekilde düzenlenmiştir. Çekirdekler, bol sitoplazmalı hücrenin merkezinde bulunur. Sadece portal alan az miktarda fibröz dokuya sahiptir (Şekil 2a). Model grubunda lobüler yapı ciddi şekilde hasar görmüştür. Karaciğer hücreleri, çoğunlukla balon şeklinde dejenerasyon ve/veya yağlı dejenerasyon olmak üzere hafif sulu dejenerasyon gösterdi. Enflamatuar hücre infiltrasyonu oluşumu, yaygın fibröz doku hiperplazisi, çok sayıda fibröz septum oluşumu, bölünmüş lobüller ve önemli karaciğer hücrelerinin proliferasyonu da gözlendi. Bu gözlemler, hepatik fibrozun sıçan immün yaralanmalı hayvan modelinin kurulmasının başarısını doğruladı (Şekil 2b). Model grubu ile karşılaştırıldığında, farklı CPhG'lerde inflamatuar hücre infiltrasyonunda bir azalma oldu. Ayrıca karaciğer hücrelerinde daha az nekroz ve yağlı dejenerasyon ve ayrıca fibrozun hafiflemesi gözlendi. CPhG'ler, sıçanlarda BSA ile indüklenen hepatik fibrozun patolojisini önemli ölçüde hafifletti, karaciğer hücrelerinin şişmesini hafifletti ve hepatosit nekrozu ve inflamatuar hücre infiltrasyonunu etkili bir şekilde önledi, bu da CPhG'lerin BSA ile indüklenen sıçan hepatik fibrozu üzerinde koruyucu bir etki yaptığını düşündürdü. (Şek. 2c–f ). Masson'un trikrom boyaması Normal grupta karaciğer dokusu normaldi. Hepatik portal alan az sayıda mavi kolajen lifi gösterdi ve karaciğer dokusu normal olarak yapılandırıldı (Şekil 3a). Normal grubun karaciğer dokusu ile karşılaştırıldığında, fibröz doku merkezi yaprakçık tarafından çoğalır ve karaciğer parankimine genişler. Kollajen lifleri uzatılmış ve bağlanmış ve

tüm lobülü sarar ve santral veni çevreler. Hepatosit fibrozu, lobüler yapısal hasar, periportal fibrozis ve psödolobül oluşumu (Şekil 3b) ile birlikte bu etkiler, modelin kurulduğuna dair kanıt sağlamıştır. Model grubu ile karşılaştırıldığında, pozitif ilaç kontrol grubundaki kollajen lifleri, periferik portal alandan hafifçe dışa doğru uzatıldı (Şekil 3c). Model grubu ile karşılaştırıldığında, farklı CPhGs doz gruplarındaki kolajen lifleri önemli ölçüde azaldı, lif çoğalması engellendi ve karaciğer parankimindeki lifli dokunun çoğalması önemli ölçüde azaldı. Bu sonuçlar, CPhG'lerin sıçanları BSA ile indüklenen hepatik fibrozdan koruduğunu gösterdi (Şekil 3d–f).

immünohistokimyasal boyama

Önemli olarak, kolajen tip I ve kolajen tip III'ün ekspresyonu, hepatik fibrozun gelişiminde temel roller oynar ve bunların karaciğer dokusunda oluşumu ve birikimi, anti-hepatik fibroz etkinliğinin önemli bir belirleyicisi olarak hizmet edebilir. Sonuçlar Tablo 5'te özetlenmiştir.

Kollajen tip I

Normal grup, kolajen tip I'i esas olarak kan damarlarında ve portal alanda ifade etti. Model grubu, portal alanlarda kollajen tip I vasküler fibrozu yüksek oranda ifade etti. Disse boşluğunda, kolajen tip I boyama, çizgiler veya yamalı bir dağılım olarak gözlendi. Kollajen kaplı fibröz septa psödolobül oluşturmak üzere. Bu deneylerde, BJRJ (600 mg/kg) ve farklı CPhGs s (125, 250 ve 500 mg/kg) doz grupları için daha az lifli septa oluşturuldu [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023 ve P Sütun I=0.044, sırasıyla]. Yarı niceliksel sonuçlar, kolajen tip I ekspresyonunun model grubu ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük olduğunu ortaya koydu (Şekil 4).

Kollajen tip III

Kollajen tip III normal grupta zayıf bir şekilde eksprese edildi ve portal ve hepatik venleri çevreleyen periferik alanlarda sürekli lifler yerine az miktarda ince sarı görüldü (Şekil 5a). Model grubunda, kollajen lifleri, esas olarak portal ve fibröz doku alanlarında bulunan güçlü ekspresyonu gösteren geniş ve kalın kordlar sergiledi (Şekil 5b). BJRJ'nin kollajen lifleri (600 mg/kg) ve CPhG'lerin farklı doz grupları (125, 250 ve 500 mg/kg) filamentli idi ve merkezi damar ve portal alanlara dağıldı. Model grubu ile karşılaştırıldığında, kollajen lifleri önemli ölçüde azaldı, boyama soluk ve inceydi ve immünohistokimyasal boyama zayıf pozitifti (Şekil 5c-f). Bu yarı niceliksel sonuçlar, pozitif ve farklı doz gruplarında pozitif olarak eksprese edilen hücrelerin [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 ve P Sütun III=0.037, sırasıyla] model grubundakilerden farklıydı.

TGF- 1

Normal sıçan karaciğer hücrelerinde çok az TGIF{{0}} ifadesi vardı. Ekspresyon, az sayıda interstisyel hücre ile sınırlıydı (Şekil 6a). Model grubunda, TGF- 1 ekspresyonu portal alanda, fibröz boşluklarda, hepatik stellat hücrelerde, inflamatuar hücrelerde, sinüzoidal duvarda ve sitoplazmada yaygın olarak dağılmıştır. Belirli bir portal alanı, kahverengimsi-sarı boyama ile güçlü bir pozitif ifade sergiledi (Şekil 6b). Portal alanda ve BJRJ'nin fibröz septasında (600 mg/kg) ve CPhG'lerin farklı doz gruplarında (125, 250 ve 500 mg/kg) az miktarda ekspresyon vardı. Bu gruplardaki pozitif boyamanın kapsamı, model grubuna kıyasla önemli ölçüde azaldı. Fibröz septadaki interstisyel hücrelerde ve inflamatuar hücrelerin sitoplazmasında boyanma azaldı (Şekil 6c–f). Yarı niceliksel sonuçlar, BJRJ ve farklı CPhGs [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" doz="" gruplarının="" .004,="" sırasıyla]="" model="" grubuyla="" karşılaştırıldığında="" anlamlıydı.="" makalede="" daha="" önce="" bahsedildiği="" gibi,="" tgf-="" 1="" karaciğer="" patofizyolojisinde="" önemli="" bir="">

fibrozis, hücre dışı matris üretimini uyarır [19]. Model grubunda TGF- 1 seviyesinin karaciğer fibrozunun ciddiyeti ile tutarlı bir şekilde arttığını gösterdik. Karaciğerdeki TGF- 1 ekspresyon seviyeleri, serum TGF- 1 seviyeleri ile tutarlıydı. Bu, CPhG'lerin, ECM'nin sentezine ve bozulmasına katılarak TGF- 1 ekspresyonuna bağlı karaciğer fibrozunu önemli ölçüde azaltabildiğini gösterir. Kollajen tip I, kolajen tip III ve TGF- 1 ekspresyonu, hepatik fibrozun patolojik sürecini tespit edebilir. Tedavi gruplarındaki ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde azaldı ve CPhG'lerin kolajenaz aktivitesini iyileştirebileceğini, karaciğer ECM sentezinin ve bozulmasının dinamik dengesini koruduğunu, böylece karaciğer fibrozunun oluşumunu geciktirdiğini ve önlediğini gösterdi.