Bölüm 2: Kannabinoid Reseptör Tip 2 -katenin Sinyalini Düzenleme Yoluyla Böbrek Fibrozisini Teşvik Ediyor

İletişim: emily.li@wecistanche.com

Şekil 4| -arrestin 1(-arr1)/SRC proto-onkogen (Src) kompleksi, kannabinoid reseptör tip 2(CB2) ile indüklenen -katenin(-cat) sinyalleme aktivasyonuna aracılık eder. (a) Temsili grafikler, CB2'nin -arr1 veya Src ile bağlanmasını gösterir. İnsanböbrekyakınboru şeklinde(HKC-8) hücreleri, tek başına amino kylindol (AM1241; 10 uM) ile muamele edildi veya 24 saat boyunca XL-001(10 uM) ile birlikte muamele edildi. Tüm hücre lizatları, CB2'ye karşı bir antikorla immüno-çökeltildi ve -arr1 ve Src'ye karşı antikorlarla lekelendi. (Devam etti)

Cistanche böbrek fibrozu için iyidir

CB2, -arrestin 1/Src/ -katenin yolunu teşvik ederek Wnt sinyalini güçlendirir

Şekil 6a-c'de gösterildiği gibi, CB2 veya Wntl'in ektopik ekspresyonu, aktif bir Src formu olan -arrestin 1 ve fosfo-Src'nin (Tyr15) yukarı regülasyonunu indüklemiştir. -Arrestin l ve fosfo-Src(Tyr416)'nın ekspresyon seviyeleri, CB2 ve Intl'nin birlikte ekspresyonu ile daha da geliştirilmiştir. Daha sonra UIRI farelerinde CB2 ve Wnt1'in birlikte ekspresyonu ile in situ hibridizasyon ve immünofloresan yoluyla -katenin ile CB2 için ortak eğitim gerçekleştirdik. Neredeyse tüm CB2-pozitif tübüler hücreler -katenin eksprese etti, bu da -katenin'in CB2 yolundaki potansiyel rolünü ima etti(Şekil 6d). Daha sonra -arrestin 1 ve aktif -katenin ekspresyonunu immünofloresan boyama ile test ettik. Şekil 6e'de gösterildiği gibi, CB2, ifadelerini arttırmak için Wntl ile işbirliği yaptı. Ayrıca, UIRI farelerinde, CB2-veya -katenin'in Wntl ile indüklenen aktivasyonu ve hedefleri MMP-7 ve Salyangoz, birbirleriyle birlikte ifade edilerek daha da arttırıldı (Şekil 6f-i). İmmünohistokimya ve Western blot analizi ile değerlendirildiği üzere Kim-1'in benzer ekspresyon paterni, CB2'nin Wnt1-indüklenen tübüler hasar üzerinde sinerjistik olarak uyarıcı bir etkiye sahip olduğunu da göstermiştir(Şekil 6e, f ve j).

cistanchegeliştirebilirböbrekişlev

Eksojen CB2 ve Wnt1, folik asit kaynaklı nefropatide sinerjistik olarak -katenin sinyalini ve renal fibrozu indükler

Ayrıntılı deneysel tasarım Şekil 7a'da gösterilmektedir. Şekil 7b ve c'de gösterildiği gibi, folik asit kaynaklıböbreklerCB2 veya Wntl'nin ektopik ekspresyonu, CB2'nin yukarı regülasyonunu indükledi ve CB2 seviyeleri, CB2 ve Wntl'nin birlikte ekspresyonu ile daha da yükseldi. Daha sonra -arrestin 1 ve fosfo-Src(Tyr416) ​​ifadesini inceledik. Şekil 7d-g'de gösterildiği gibi, eksojen CB2 ve Wnt1, hem -arrestin 1 hem de fosfo-Src'nin ekspresyonunu sinerjistik olarak arttırdı. Ayrıca, aktif -katenin immün boyaması, CB2 veya Wntl'nin -katenin aktivasyonunu arttırdığını ve işbirlikçi bir etkiye sahip olduklarını gösterdi (Şekil 7d). Aktif -katenin ekspresyonu ve bunun aşağı akış hedefleri MMP-7 ve Salyangoz Western blot ile değerlendirildiğinde de benzer sonuçlar elde edildi(Şekil 7h-k). Kim-1, fibronektin ve a-SMA'nın ekspresyon seviyeleri, CB2 veya Wnt1'in ektopik ekspresyonu ile yukarı regüle edildi ve bunların birlikte ekspresyonu ile daha da yükseltildi (Şekil 7h ve l ve 8a-c). Fibronektin, kollajen I, Kim-1 ve Masson'un trikrom boyaması değerlendirildiğinde de benzer sonuçlar elde edildi (Şekil 8d). Bu sonuçlar ayrıca CB2'nin -arrestin 1/Src ile indüklenen -katenin yolunda aktif bir rol oynadığını göstermektedir.

cistanchegeliştirebilirböbrekişlev

-Arrestin 1'in yıkılması, AM1241-indüklenen UIRI farelerinde -katenin sinyalini ve renal fibrozu iyileştirir

Daha sonra AM1241 enjekte edilmiş UIRI farelerinde -arrestin 1'in in vivo susturulmasının kısa saç tokası RNA aracılı rolünü inceledik(Şekil 9a). -arrestin l'in susturma etkinliği, nicel gerçek zamanlı PCR ile doğrulandı(Şekil 9b). AM1241'in uygulanması, serum kreatinin ve kan üre nitrojen seviyelerini daha da arttırdı; bununla birlikte, -arrestin 1'in yıkılması, AM1241 uygulamasından sonra UIRI farelerinde bile bu artışları önemli ölçüde inhibe etti (Şekil 9c ve d). Periyodik asit-Schiff boyamasının nicelendirilmesi (Ek Şekil S3), -arrestin 1'in yıkılmasının AM1241-indüklenen tübüler yaralanmaya karşı büyük ölçüde korunduğunu gösterdi (Şekil 9e). İmmün boyama sonuçları, -arrestin 1'in düşürülmesinin AM1241-yukarı regüle edilmiş aktif -katenin ekspresyonunu inhibe ettiğini gösterdi (Şekil 9f). Ayrıca, fibronektin, kollajen I ve Kim-1'in boyama sonuçları, -arrestin 1 ile interferansın koruyucu rolünü daha da doğruladı.böbrekfibrogenez(Şekil 9g). Aktif -katenin, MMP-7, Salyangoz, fibronektin, a.-SMA veya Kim-1 ekspresyonu Western blot analizi ile değerlendirildiğinde benzer sonuçlar gözlemlendi (Şekil 9h-n). İlginç bir şekilde, -arrestin 1 nakavtının CB2 ekspresyonunu inhibe ettiğini gözlemledik, bu da CB2, -arrestin 1 ve -katenin arasında bir aktivasyon döngüsüne işaret etti(Şekil 9h ve o). Masson'un fibrotik alanın trikrom boyaması ve kantifikasyonu ayrıca, -arrestin 1 susturmasının AM'yi güçlü bir şekilde inhibe ettiğini1241-hızlandırdığını gösterdiböbrekfibroz(Şekil 9g ve p).

CB2, -katenin'in aşağı akış hedefidir ve -katenin ile bir aktivasyon döngüsünü kolaylaştırır

Hem insan hem de fare CB2 genlerinin promotör bölgelerinde mükemmel varsayılan T-hücre faktörü/lenfoid güçlendirici-bağlayıcı faktör bağlanma bölgelerinin çoklu kopyaları vardı (Şekil 10a). HKC-8 hücreleri, N-terminal olarak kesilmiş, FLAG etiketli, yapısal olarak aktive edilmiş hücrelerle transfekte edildi

cistanchegeliştirebilirböbrekişlev