Bölüm 2: Klonlanmış Bir Köpek Üretmek İçin Hücre Koruyucu Olarak Acteoside'ın Etkisi

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2 , Min Kyu Kim1*

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com

Lütfen 1. bölüm için buraya tıklayın

Lütfen Bölüm 3 için buraya tıklayın

ActeosideiçindecistancheBirçok vardırsağlıkfaydalar

istatistiksel analiz

Veriler, IBM SPSS istatistikleri (SPSS Inc., Chicago, IL ABD) kullanılarak tek yönlü ANOVA ve Tukey'nin dürüstçe anlamlı fark testi kullanılarak analiz edildi. P-değeri 0.05'ten küçük olduğunda farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar

Acteoside'ın hücre döngüsü senkronizasyonu üzerindeki etkisi

Etkisiasteosithücre döngüsü senkronizasyonu, floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak araştırıldı (Tablo 1). Köpek fetal fibroblastları, çeşitli konsantrasyonlardaasteosit(10, 30, 50 μM) için farklı süreler (24, 48, 72 saat) ve hücreler G0/G1 aşaması, S aşaması ve G2/M aşaması olarak ayrıldı. FACS. FACS'nin sonuçları, serum açlığı ve temas inhibisyonu ile senkronize edilen hücrelerin sonuçlarıyla karşılaştırıldı. Serum açlığı, temas inhibisyonuna kıyasla G0/G1 aşamasında en yüksek hücre döngüsü senkronizasyon oranı (yüzde 88.2) ile sonuçlandı ve (yüzde 84.6) veasteosittedavi (yüzde 80.8-84.5).Acteosideen düşük verimlilikte (yüzde 80.8, 81,1 ve 82,0) 24 saatlik indüklenmiş G0/G1 hücre döngüsü senkronizasyonu için tedavi.Acteoside30 μM konsantrasyonda ve 48 saatlik tedavi süresinde (yüzde 84,5) G0/G1 hücre döngüsü senkronizasyonunu indüklemede en etkiliydi. Bununla birlikte, konsantrasyonlar ve süreler arasında anlamlı bir fark yoktu.asteositG1/G0 hücre döngüsü senkronizasyonunun uyarılmasında tedavi. Etraflı,asteosittedavi, G{{0}}/G1 hücre döngüsü senkronizasyonu açısından serum açlığı ve temas inhibisyonu ile karşılaştırıldığında anlamlı bir fark göstermedi. Üç grup arasında S aşamasında hücre döngüsü senkronizasyonunda da bir fark yoktu. Ek olarak, G2/M aşamasında tutuklanan hücrelerin oranı, G0/G1 aşamasında tutuklanan hücrelerin oranına benzerdi.

Tablo 1. Temas inhibisyonu, serum açlığı veasteositköpek fetal fibroblastlarında hücre döngüsü senkronizasyonu tedavisi.

Şekil 1. Köpek fetal fibroblastlarındaki ROS seviyeleri. (A) temas inhibisyonu, (B) serum açlığı ve (C) 48 saat boyunca 30 μM asteozid tedavisi ile hücre döngüsü senkronizasyonu. Histogramlar, köpek fetal fibroblastlarında tespit edilen ROS seviyelerini gösterir.

Acteoside'ın ROS ve apoptoz üzerindeki etkisi

EtkisiasteositROS üzerinde, esterazlar hücreler arasındaki asetat gruplarını çıkardığında hücrelerde aktive olan bir oksidatif stres göstergesi olan karboksi-H2DCFDA kullanılarak FACS tarafından belirlendi (Şekil 1). ROS, asteozid ile muamele edilmiş hücrelerde, serum açlığı veya temas inhibisyonu ile senkronize edilen hücrelere göre daha düşük seviyelerde tespit edildi. ROS seviyesi, asteosit tedavi grubunda (yüzde 42,8) temas inhibisyonu ve serum açlığı gruplarına göre (sırasıyla yüzde 54.3 ve yüzde 99,5) önemli ölçüde daha düşüktü (Tablo 2).

etkisini anlamak içinasteosithücre sağkalımı ve ölümü üzerinde, hücre döngüsü senkronizasyonunun indüklenmesinden sonra hücrelerde apoptoz araştırıldı. Acteoside ile muamele edilmiş hücrelerin hayatta kalma oranı (yüzde 94.8 ± 1.2), hem temas inhibisyonu hem de serum açlığı gruplarından (yüzde 87.3 ± 0.5) önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 2D). Serum açlığı grubunda apoptoz oranları

(yüzde 52.1 ± 5.3), temas inhibisyonu ve asteozid tedavi gruplarındakilerden önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 2E). Temas inhibisyonu grubunda gözlenen apoptoz yüzde 10,6 idi ve bu da ateozid tedavi grubundan (yüzde 4,2) önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 2E). Ek olarak, kontakt inhibisyon grubuna kıyasla asteozid ile muamele edilmiş hücrelerde daha az nekroz bulundu (Şekil 2F).

cistancheDeserticola acteoside artırabilirbağışıklıkve azaltmakapoptoz

Acteoside'ın köpek nükleer transfer embriyolarının in vitro gelişimi üzerindeki etkisi

Acteosidin SCNT embriyo gelişimindeki etkisini araştırmak için, nükleer donör hücreler, hücre döngüsü senkronizasyonundan sonra köpek çekirdekli oositlere aktarıldı.asteosit. Tablo 3'te gösterildiği gibi, nükleer embriyodan erken embriyo gelişiminde önemli bir fark yoktu.

Tablo 2. ROS'un Kantifikasyonu

Şekil 2. Köpek fetal fibroblastlarının hücre hayatta kalma, apoptoz ve nekroz oranları. (A) temas inhibisyonu, (B) serum açlığı ve (C) 30 μM'deki apoptotik hücrelerasteosit48 saatlik grup için tedavi FACS ile belirlendi; (D) hücre sağkalımı, (E) apoptoz ve (F) nekrozun FACS sonuçlarının kantitatif analizi. Bu deney bağımsız olarak dört kez tekrarlandı. (P<>

ya temas inhibisyonu ya da asteosit tedavisinin farklı hücre döngüsü senkronizasyon yöntemlerine sahip donör hücreler. Bununla birlikte, yalnızca G0/G1 aşamasında senkronize edilmiş nükleer donör hücreleri kullanılarak tasarlanan köpek SCNT embriyoları, 10-hücre embriyo aşamasının ötesinde geliştirilen ateosit ile.

ile kültürlenmiş hücreler kullanılarak klonlanmış bir köpek üretimiasteosit

Temasla inhibe edilmiş donör hücreleri kullanılarak üretilen elli yedi klonlanmış köpek embriyosu, 6 alıcının yumurta kanallarına cerrahi olarak transfer edildi. 6 alıcıdan hiçbiri yavru üretmedi

Tablo 3. Köpek nükleer transfer embriyolarının in vitro gelişimi.

Tablo 4. SCNT ile klonlanmış bir köpeğin üretimi.

hatta hamile kaldı. Acteoside ile tedavi edilen donör hücrelerden üretilen otuz sekiz klonlanmış köpek embriyosu da cerrahi olarak 3 alıcının yumurta kanallarına transfer edildi. 354 g ağırlığında sağlıklı bir köpek yavrusunu sezaryen ile doğuran üç taşıyıcı anneden birinde gebelik doğrulandı (Tablo 4 ve Şekil 3). Genomun kökenini belirlemek için klonlanmış köpeğin genleriyle mikro uydu amplifikasyonu yapıldı. Mikrosatellitler, ailelerde kalıtım ve bağlantı analizini izlemek için genom taramalarında kullanılan kısa tandem tekrarlanan dizilerdir. Klonlanmış köpekteki genomun kökenini belirlemek için yedi mikro uydu işaretçisi kullanıldı (Tablo 5). Klonlanmış köpek ve köpeği klonlamak için kullanılan donör hücreleri aynı mikro uydu işaretçilerine sahipken, oosit donörü ve vekil sadece kısmi alelleri paylaştı (Tablo 5). Maternal soy testinde, klonlanmış köpek ve alıcı oosit, klonlanmış köpeğin mtDNA'sının oosit donöründen türetildiğini gösteren özdeş mitokondriyal DNA (mtDNA) dizilerine sahipti (Tablo 6).

asteositcistanche'de

Tartışma

Verici hücre döngüsünün senkronizasyonu, SCNT verimliliğini artırmak için önemli bir faktördür [43]. SCNT embriyo gelişim hızı ve hayvansal üretimlerin klonlanmasının etkinliği

Şekil 3. Klonlanmış bir köpek: (A) embriyo transferinden 32 gün sonra fetal veziküldeki fetüsün ultrasonogramı; (B) 2 aylıkken klonlanmış beagle.

asteositiçindecistancheyaşlanmayı geciktirebilir