Bölüm 3: Drosophila Kenyon Hücrelerinden Magnezyum Akışı Normal ve Diyetle Geliştirilmiş Uzun Süreli Bellek İçin Kritiktir

daha fazla bilgi için:ali.ma@wecistanche.com

Lütfen Bölüm 2 için buraya tıklayın

TıklaCistanche faydaları ve hafıza için yan etkileri

yetişkin sineklerle sınırlıydı, bu da UEX'in nöronal fizyolojide daha sürdürülebilir bir rolü olduğunu düşündürdü. Buna karşılık, abs ya da a{{0}}b0 nöronlarında uex ifadesini devre dışı bırakmak LTM'yi bozmadı. İştah açıcı LTM'yi (Krashes ve Waddell, 2008) pekiştirmek için eğitimden sonra a0 b0 nöronlarının aktivitesi gereklidir, oysa abc ve abs KC çıktısı birlikte ve ayrı ayrı, ifadesi için gereklidir (Krashes ve Waddell, 2008; Perisse ve diğerleri, 2013). Bu nedenle, abs ve a0b0 nöronlarında uex fonksiyon kaybı olan sineklerde normal LTM performansını gözlemlemek, uex'i manipüle ederken genel bir ab nöronal fonksiyon eksikliğine karşı çıkar.

Diyet Mg2 plus, yapısal olarak uex mutantı olan veya ab KC-kısıtlı uex fonksiyon kaybı barındıran sineklerin kusurlu LTM performansını artıramadı. Bununla birlikte, uex mutant sineklerin ab KC'lerinde uex'in ifade edilmesi, Mg2 plus'ın performansı artırma yeteneğini restore etti. Bu nedenle, ab KC'ler, Mg2 plus için hücresel lokustur.hafızaanında.

KC'lerde UEX-yönelimli magnezyum akışının gerekli olması belki de mantık dışı görünebilir.hafıza- Diyet Mg2 artı KC'yi [Mg2 artı ]i yükselttiğinde, Mg2 artı beslemenin arttırıcı etkileri. Bu aşamada, bunun neden böyle olduğu konusunda sadece spekülasyon yapabiliriz. Özellikle beyin ve ab KC'lerin, diyet takviyesinden kaynaklanan daha yüksek hücre içi ve hücre dışı Mg2 plus seviyelerine dengeli bir şekilde adapte olması gerektiğini varsayıyoruz. Yabani tip ve uex mutant beyinlerde KC [Mg2 plus ]i'nin canlı görüntülemesi, UEX'e yönelik akışın, bu yüksek seviyelerin aktif ve belki de uyaranla uyarılmış homeostatik bakımında önemli bir faktör olabileceğini düşündürmektedir.

Bir dizi memeli hücre tipi, β-adrenerjik stimülasyona maruz kaldıktan birkaç dakika sonra, cAMP'ye bağlı bir şekilde Mg2 plus'ı ekstrüde eder (Romani ve Scarpa, 2000; Vormann ve Günther, 1987; Jakob ve diğerleri, 1989; Romani ve Scarpa, 1990b; Romani ve Scarpa, 1990a; Vormann ve Günther, 1987; Gunther ve diğerleri, 1990; Howarth ve diğerleri, 1994). Bir CNBH alanının varlığı, UEX ve CNNM'lerin doğrudan cAMP tarafından düzenlenebileceğini gösterir. UEX CNBH'de cAMP bağlanmasını bloke etmesi gereken bir R622K amino asit ikamesi ekleyerek CNBH'nin önemini test ettik. Bu ince mutasyon, uexR622K transgeninin, uex mutant sineklere LTM performansını geri kazandırma yeteneğini ortadan kaldırdı. Yerel uex lokusunda CNBH'yi mutasyona uğratmak için CRISPR'ı da kullandık. CNBH'nin CNNM4'ten silinmesi Mg2 artı akış aktivitesini ortadan kaldırmış olsa da (Chen ve diğerleri, 2018), uexT626NRR lezyonu için homozigot sinekler yaşayabilirdi ve yeterli düzeyde UEX işlevini koruduklarını gösterdi. Bununla birlikte, bu sinekler, ani ve uzun vadeli bozulmuşhafıza. Ek olarak, uexT626NRR sineklerinin performansı Mg2 artı besleme ile geliştirilemedi. Bu veriler, bozulmamış bir CNBH'nin kritik bir unsur olduğunu göstermektedir.hafıza-ilgili UEX işlevi. Klatrin adaptör proteinlerinin CNNM4 CNBH'ye bağlanması, bazolateral hedeflemeye dahil edilmiştir (Hirata ve diğerleri, 2014), bu da UEXT626NRR'nin KC'lerde uygun olmayan şekilde lokalize olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, artık işlevi koruyan CNNM2 E122K mutant varyantının KC ifadesi

ancak bir insan ticareti kusuru vardır (Arjona ve diğerleri, 2014), uex LTM kusurunu düzeltmemiştir.

CNNM2/3 CNBH alanlarının siklik nükleotitleri bağlayıp bağlamadığı sorgulanmasına rağmen (Chen ve diğerleri, 2018), FSK'nın uex mutasyonuna duyarlı olan ab KC [Mg2 plus ]i'de bir artış uyandırdığını ve UEX'in: :HA, rut2080 adenilat siklazda (Han ve diğerleri, 1992) ve dnc1 fosfodiesterazda (Dudai ve diğerleri, 1976) hatalı mutant sinekleri öğrenerek yanlış konumlandırılmıştır. UEX::HA etiketi, vahşi tip sineklerde g, abc ve abs KC'lerinde eşit olarak dağılmışken, UEX::HA etiketi, g ve abs KC'lerinde azaldı ve rut2080 ve dnc1 mutantlarında abc nöronlarında daha güçlüydü. Mutantlarda cAMP'nin kronik manipülasyonları, bu nedenle, belki de CNBH ile etkileşime girerek, UEX lokalizasyonunu etkileyen cAMP ile tutarlıdır. Ayrıca, değiştirilmiş UEX yerelleştirmesi,hafızarut2080 ve dnc1 sineklerinin kusurları.

Memeli hücre kültüründe Magnezyum Yeşili ve ab KC'lerde genetik olarak kodlanmış MagIC raportörünü kullanan fizyolojik verilerimiz, sinek UEX'in Mg2 artı akışı kolaylaştırdığını göstermektedir. Sinek beyninin FSK ile uyarılması, UEX'in Drosophila KC'lerinde [Mg2 artı ]i'deki bir artışı sınırladığına dair ilk kanıtı sağlayan vahşi tip kontrollere kıyasla uex mutant beyinlerde ab KC'de [Mg2 artı ]i'de daha büyük bir artış uyandırdı. MagIC kayıtlarımız ayrıca, UEX'e bağlı olan ab KC [Mg2 plus ]i'nin yavaş bir salınımını (ortalama 0.015 Hz civarında, yaklaşık olarak dakikada bir) ortaya çıkardı. Bu [Mg2 artı ]i dalgalanmasının fizyolojik işlevini henüz anlamıyoruz, ancak muhtemelen hücrelerin homeostatik sistem düzeyinde bir özelliğini yansıtıyor. Biyokimyasal salınım aktivitesi, hücresel fizyolojinin birçok yönünde çok önemli bir rol oynar (Nova´k ve Tyson, 2008). En önemlisi, [Mg2 plus ]i'nin sirkadiyen zamanlı dalgalanması, dinamik hücresel enerji metabolizmasını Mg2 artı hassas mTOR (rapamisinin mekanik hedefi) yolu aracılığıyla saat kontrollü çeviriye bağlar (Feeney ve diğerleri, 2016). Bu nedenle, yavaş Mg2 artı salınımların cAMP, UEX, enerji akışı (Plac¸ais ve diğerleri, 2017) ve LTM ile ilgili sinaptik plastisitenin altında yatan mTOR'a bağlı çeviri için rolleri birleştirmesi mümkündür (Casadio ve diğerleri, 1999). ; Huber ve diğerleri, 2000; Beaumont ve diğerleri, 2001; Hou ve Klann, 2004; Hoeffer ve diğerleri, 2008).

Reaktif ve kaynak paylaşımı için iletişim

Reaktiflerin tam listesi Ana Kaynaklar Tablosunda görüntülenebilir.

Kaynaklar ve reaktifler için daha fazla bilgi ve talepler, Baş İrtibat Kişisi Scott Waddell'e (scott.waddell@cncb.ox.ac.uk) yönlendirilmeli ve bunlar tarafından yerine getirilecektir.

Deneysel model ve konu detayları

sinek suşları

Aksi belirtilmedikçe, sinekler, yüzde 60 nem ve 25°C'de 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü altında standart mısır unu yemi üzerinde büyütüldü. GAL80ts deneyleri için test ve kontrol sinekleri 18˚C'de büyütüldü. Deneylerde 1–7-günlük karışık cinsiyetli sinekler kullanıldı.

Canton-S, vahşi tip suştu. Bu çalışmada kullanılan GAL4 sürücü hatları c739-GAL4 (McGuire ve diğerleri, 2001), c305a-GAL4 (Krashes ve diğerleri, 2007), NP7175-GAL4 (Tanaka ve diğerleri, 2004), 0770-GAL4 (Gohl ve diğerleri, 2011), MB247-GAL4 (Zars ve diğerleri, 2000), nSyb-GAL4 (Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765) ve uex-GAL4 (Kvon ve diğerleri, 2014); Viyana Drosophila Kaynak Merkezi, VDRC, VT23256-GAL4). Stok merkezinden elde edilen UAS hatları, UAS-CD8::GFP (BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi (BDSC, 25941) ve UAS-uexRNAi'dir (BDSC, 36116). Çeşitli mutant ve transgenik soylar, uexMI01943 (Venken ve diğerleri, 2011; BDSC, 32805), uexNC1 (BDSC, 7167), rut2080 (Han ve diğerleri, 1992) ve dnc1 (Dudai ve diğerleri, 1976) tarif edilmiştir. tubP-GAL80ts (McGuire ve diğerleri, 2003) ve PhsILMiT (BDSC, 24613). uexMI01943.ex1 ve uexMI01943.ex2 Minos eksizyon hatları, Arc ve diğerleri, 1997'de açıklanan prosedür kullanılarak oluşturulmuştur. Ayrıntılı eşleştirme şeması Şekil 2—şekil eki 2A'da gösterilmektedir. Sarı gövde rengi fenotipini sergileyen bireysel sineklerden potansiyel eksizyon hatları oluşturuldu. Genomik DNA, bu tür altı hattan ekstrakte edildi ve uexMI01943 MiMIC'i çevreleyen DNA, PCR ile büyütüldü ve dizilendi. uexMI01943.ex1 ve uexMI01943.ex2 hatlarının, vahşi tip genomik diziyi restore ederek kesin eksizyonları barındırdığı belirlendi. PCR ve sekanslama primer sekansları için Kaynak Tablosuna bakın. uexMI01943 MiMIC yerleştirmesinin ve eksizyonların dizi detayının şeması Şekil 2'de gösterilmiştir—şekil eki 2B. UAS-uex transgenik sinekleri oluşturmak için tam uzunlukta bir uex kodlama dizisi (CDS), RT-PCR ile klonlandı. Toplam RNA, TRIZOL (Thermo Fisher, 15596018) kullanılarak vahşi tür sineklerden izole edildi ve SuperScript III birinci iplik sentez sistemi (Invitrogen, 18080400) kullanılarak cDNA'ya ters kopyalandı. Bu toplam cDNA karışımı, uex CDS'yi büyütmek için bir şablon olarak kullanıldı. Primer dizileri için Kaynak Tablosuna bakın. PCR ürünü SacII ve XhoI ile sindirildi ve daha sonra pUAST'ın tamamlayıcı bölgelerine bağlandı (Brand ve Perrimon, 1993). pUAST klonlanmış uex CDS, tamamen sıralandı ve vahşi tip uex cDNA okuma çerçevesinin 2505 bp'sini temsil ettiği doğrulandı (dört olası uex mRNA izoformunun tümü, FlyBase Release 6, aynı 834 amino asit proteinini kodlar). UAS-uex transgenik sinekleri, pUAST-uex vektörü ile transformasyon yoluyla ticari olarak (Bestgene) üretildi. 10 bağımsız transgenik hattın UAS-uex kromozomu yerleştirmesinin haritasını çıkardık ve davranışsal olarak UAS-uex3M, UAS-uex5M ve UAS-uex8M olarak adlandırılan ve üçüncü kromozom üzerinde bir ekleme ile üç hattı test ettik. UAS-uex3M sinekleri, çalışma boyunca kullanılan ve el yazmasında UAS-uex olarak anılan sineklerdi.

UAS-uexR622K transgenik sinekler, UAS-uex sineklerine benzer şekilde üretildi. Daha önce protein kinaz A'nın düzenleyici alt biriminin cAMP-bağlama alanında tasarlanmış olanı taklit eden, CNBH alanı içinde UEX'in 622. kodonunda bir yanlış anlamlı mutasyon dahil edilmiştir (Bubis ve diğerleri, 1988). Mutasyon, Arg kodlayan CGT kodonunu Lys kodlayan AAA'ya değiştirir. Mutasyon, 'Gibson Assembly Master Mix kullanılarak sahaya yönelik mutajenez için geliştirilmiş yöntemler' (NEB Uygulama Notu)'nda açıklandığı gibi Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs, E2621S) kullanılarak vahşi tip uex CDS'ye dahil edildi. Kullanılan primer setleri Kaynak Tablosunda detaylandırılmıştır. Gibson düzeneğinin ürünü, PCR ile daha da büyütüldü ve nihai ürün, pUAST vektörüne klonlandı ve dizilendi. Transgen eklemeleri UAS-uex'te olduğu gibi haritalandı ve davranış deneylerinde üçüncü kromozomla eşlenen iki eklemeden biri kullanıldı.

UAS-CNNM2, UAS-CNNM2E122K, UAS-CNNM2E357K, UAS-CNNM2S269W ve UAS-CNNM2T568I transgenik sinek hatları, HA (mCNNM2:: HA), Arjona ve diğerleri, 2014'te açıklanmıştır. CNNM2'nin vahşi tip veya mutasyona uğramış versiyonları, pCiNEO_IRES_GFP plazmitlerinde orijinal mCNNM2::HA klonlarından amplifiye edildi (Arjona ve diğerleri, 2014). Primerler Kaynak Tablosunda detaylandırılmıştır. PCR ürünleri, XhoI ve XbaI ile sindirildi ve pUAST'ta tamamlayıcı bölgelere bağlandı. Her bir yapının üçüncü kromozom üzerindeki eklemeleri, yukarıda tarif edildiği gibi haritalama yoluyla tanımlandı ve davranış deneylerinde kullanıldı. Çalışmada kullanılan tüm CNNM2 kodlama yapılarının HA etiketli olduğuna dikkat edin, ancak gösterim genellikle kısalık için atlanır.

UAS-MagFRET-1 transgenik sinek hatları, Lindenburg ve diğ. , 2013. Primerler Kaynak Tablosunda detaylandırılmıştır. PCR ürünleri, XhoI ve XbaI ile sindirildi ve pJFRC-MUH'deki tamamlayıcı bölgelere bağlandı. Yapının yerleştirilmesine siteye özgü transgenez sistemi aracılık etti ve iniş yeri attP2'dir (üçüncü kromozom üzerinde).

UAS-MagIC ve UAS-MARIO transgenik sinek çizgileri, T. Nagai tarafından sağlanan MagIC/pcDNA3 ve MARIO/pcDNA3 plazmitlerinden alt klonlanan MagIC/MARIO CDS içeren pTW yapıları ile transformasyon yoluyla üretildi: (Maeshima ve diğerleri, 2018 ve Koldenkova ve diğerleri, 2015). MagIC/MARIO CDS, ilk olarak sırasıyla MARIO/pcDNA3 ve MagIC/pcDNA3'ten PCR amplifiye edildi ve pENTR/D-TOPO vektörüne klonlandı. Primerler Kaynak Tablosunda detaylandırılmıştır. MARIO duyu primerinin, MARIO'nun yerleştirme yerinde pcDNA3 dizisi ile örtüşecek şekilde tasarlandığına dikkat edin. MagIC/MARIO CDS ayrıca Gateway hedef vektörü pTW'ye (Drosophila Gateway Vector Collection) klonlandı.

CRISPR/Cas9 tarafından düzenlenen uexD lokusu ticari olarak GenetiVision tarafından oluşturulmuştur. Düzenleme şeması Şekil 2—şekil eki 2C'de gösterilmiştir. uex lokusu, kromozom 2R üzerinde ters oryantasyonda bulunur ve 3.900.285 ve 3.949.425 (FlyBase, Sürüm 6) arasındaki 49.141 bp'lik bir bölgeyi kapsar. Aşağıdaki açıklama, uex konumu içindeki bu koordinatlarla ilgilidir. uexD oluşturmak için iki gRNA plazmidi ve bir çift sarmallı DNA donör (dsDNA) plazmidi inşa edildi ve nos-Cas9 embriyolarına enjekte edildi (BDSC, 54591). Şekil 2—şekil eki 2C'de belirtildiği ve Kaynak Tablosunda detaylandırıldığı gibi, yukarı akış gRNA1, Exon 6'da yer alır ve 30,930.30.952 dizisini hedefler. Karşılık gelen aşağı akış gRNA2, 33.988 ile 34.010 arasında Exon 7 ve Exon 8 arasında yer alır. Her iki gRNA da ayrı ayrı pCFD3-dU63gRNA'ya klonlandı (Addgene, 49410). gRNA1'in kesim bölgesi 30.946 ile 30.947 arasında olmalıdır, gRNA2 ise 33.993 ile 33.994 arasında bir kesime yol açmalıdır. 795 bp yukarı akış homoloji kolu (30,152.30,946) ve 977 bp aşağı akış homoloji kolu (33.994.34.970) donör DNA plazmitine klonlandı. İki homoloji kolu arasına bir sonlandırma kodonu (üç okuma çerçevesinin hepsinde DUR) yerleştirildi ve ardından bir 3xP3 promotörü tarafından çalıştırılan bir GFP kaseti yerleştirildi. Donör DNA omurgası GenetiVision tarafından tasarlanmıştır ve uexD hattı için tam donör dizisi istek üzerine mevcuttur. Başarılı düzenleme, sinek gözlerinde GFP ekspresyonu ile belirlendi ve genomik PCR ve dizileme ile doğrulandı. uexD sineklerinde, 30.947'den 33.993'e kadar olan 3047 bp'lik bir fragman, donör plazmitindeki iki homoloji kolu, esas olarak STOP sinyali ve GFP kaseti arasındaki sekans ile değiştirildi. uexD aleli, uex ORF'yi keser. Genomik PCR doğrulaması için kullanılan primerler Kaynaklar Tablosunda detaylandırılmıştır. nos-Cas9 transgeni (X kromozomu üzerinde) çaprazlama ile çıkarıldı.

CRISPR/Cas9-düzenlenmiş uex::HA sinekleri, Kate O'Connor-Giles'in laboratuvarı tarafından geliştirilen ScarlessDsRed sistemi kullanılarak WellGenetics tarafından üretildi (yayınlanmamış, orijinal plazmit Addgene'ye bağışlandı, #80822). Bir 6XHA etiketi, uex lokusundaki doğal STOP kodonundan hemen önce 6XHA kodlama sekansı eklenerek UEX'in karboksi terminaline çerçeve içinde kaynaştırıldı (Şekil 3—şekil ek 1A). Süreç iki ana adımı içeriyordu. 1. adımda, bir DsRed kaseti içeren bir pBAC transpozonu ile birlikte bir 6XHA etiketi, 1 gRNA ve bir dsDNA plazmit donörü. gRNA, uex STOP kodonundan 50 bp'dir ve 48.587 ile 48.588 arasında bir kesim yönlendirmelidir. gRNA, bir pCFD3-dU63gRNA plazmitine klonlandı. 1.200 bp'lik bir yukarı akış kolu (47.438.48.637) ve 1.033 bp'lik aşağı akış kolu (48.641.49.673), pUC57-Kan (2579 bp) omurgası ile donör DNA plazmitine klonlandı. gRNA ve primer dizileri için Kaynak Tablosuna bakın. HDR'yi desteklemek için donöre bir Protospacer Bitişik Motif (PAM) mutasyonu (TCC'den TCG'ye, 48,581.48,583) dahil edildi. Bir 6XHA etiketi, ardından bir 3XP3 promotör güdümlü DsRed kaseti içeren bir pBAC transpozonu, iki homoloji kolu arasına yerleştirildi. Bir pBAC tanıma motifi TTAA, 6XHA'nın STOP kodonuna gömülüdür. Tam donör dizisi istek üzerine mevcuttur. Donör ve gRNA plazmitleri, nos-Cas9 embriyolarına (NIG-FLY, CAS0002) enjekte edildi. Başarılı düzenleme, sinek gözlerinde DsRed ifadesi ile tanımlandı ve genomik PCR ve dizileme ile doğrulandı. Altı bağımsız pozitif çizgi belirlendi ve dördü PCR doğrulamasını geçti. Bu dört satırdan biri, dizileme doğrulamasını daha da geçti ve Şekil 3—şekil eki 1A'da temsil edilen ara satırdır. Bu hattan dört izogenize ve dengeli stok oluşturulmuştur. Adım 2'de, DsRed seçim işareti, yardımcı hat Tub-PBac (BDSC, 8285) ile PiggyBac (PBac) transpozisyonu ile kesilmiştir. Başarılı eksizyona sahip beş homozigot canlı çizgi, genomik PCR ve dizileme ile doğrulandı. El yazmasındaki deneylerde belirlenmiş bir uex::HA kullanıldı.

CRISPR/Cas{{0}}düzenlenmiş uexT626NRR sineklerini oluşturmak için bir gRNA tasarladık ve klonladık ve tek sarmallı bir oligo-deoksinükleotit (ssODN) tasarladık ve sipariş ettik (Sigma). gRNA ve ssODN dizileri Kaynak Tablosunda detaylandırılmıştır. UEX CNBH alanında tek bir R622K amino asit ikamesi yapmayı planladığımız için, 120 bp ssODN donörü R622 kodonu üzerinde merkezlendi ve kodon değişikliği CGT'yi R622K'ya karşılık gelen AAA'ya (31.179.31,181'de) taşıyor. gRNA'nın beklenen kesim bölgesi (31,192 ile 31,193 arasında) beklenen mutasyon noktasından sadece 11 bp uzaklıktadır. Verici olarak ssODN kullanıldığında düşük olduğu bildirilen HDR olasılığını arttırmak için ticari olarak (GenetiVision) 250 lig4 KO vasa-Cas embriyosuna düzenleme materyali enjekte ettik (Zimmer ve diğerleri, 2016). Enjekte edilen embriyolardan 37 canlı G0 sinek elde ettik. Toplam 224 G1 sineği, tek sinek genomik PCR'sine ve beklenen mutasyonu taramak için dizilemeye tabi tutuldu. Kaynak Tablosunda ayrıntılı olarak verilen astarlar. İlk tur taramadan 59 varsayılan düzenlenmiş satır belirledik ve bunlardan 12'si doğrulandı. lig4 KO vasa-Cas9 kullanılmasına rağmen, HDR aracılı nokta mutasyonları yerine sadece homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) olayları tespit ettik. Düzenlenen 12 satırdan altısı homozigot öldürücüydü ve diğer altısı uygulanabilirdi. Homozigot canlı hatların dördünde, 31,192 ve 31,193 arasında 6 bp çerçeve içi ATCTTC eklenmesiyle birlikte G'nin 31,192 konumunda T ile değiştirildiğini bulduk. Bu NHEJ düzenlemesi T626'ya karşılık gelir! UEX'in protein dizisindeki NRR değişikliği (Şekil 5A). Bu satırlardan çaprazlama yapılarak X kromozomu vasa-Cas9 çıkarılmış ve el yazmasındaki davranış deneylerinde uexT626NRR olarak adlandırılan bir satır kullanılmıştır.

Yöntem ayrıntıları

davranış deneyleri

Davranışsal T-labirent deneyleri için 1–7-günlük karışık eşeyli sinekler kullanıldı. Kokular, 4-metilsi-sikloheksanol (MCH) ve 3-oktanol (OCT), ~1:103 oranında seyreltilmiştir (özellikle, 8 ml mineral yağda 9 ml MCH veya 7 ml OCT). Tüm deneyler 23˚C'de ve yüzde 55-65 bağıl nemde gerçekleştirilmiştir.

İştah açıcı hemen ve sonrahafızadeneyler esasen tarif edildiği gibi yapıldı (Krashes ve Waddell, 2008; Perisse ve diğerleri, 2013). 100-120 sineklik gruplar, eğitimden önce 21-23 saat boyunca ~2 ml yüzde 1 agar (su kaynağı olarak) ve 2 cm 4 cm filtre kağıdı içeren 35 ml'lik açlık şişelerinde aç bırakıldı. Eğitim için şeker kağıtları (5 cm 7.5 cm), 4 ml 2 M sakaroz ile ıslatılarak ve gece boyunca kurutularak hazırlanmıştır. Aynı boyuttaki su kağıtları suyla ıslatılmış ve gece boyunca bırakılmıştır. İştah açıcı eğitim için, sinekler bir açlık tüpünden kuru bir 'su' kağıdına sahip bir eğitim tüpüne aktarıldı ve hemen T-labirentinin eğitim koluna bağlandı ve 2 dakika boyunca CS kokusuna maruz bırakıldı, ardından 30 s. temiz hava. Sinekler daha sonra kuru şeker kağıdı olan başka bir eğitim tüpüne aktarıldı, T-labirentine bağlandı ve 2 dakika boyunca CS plus kokusuna maruz bırakıldı. acilhafızasinekleri T-seçim noktasına taşıyarak ve iki koku akışı arasında seçim yapmalarına 2 dakika izin verilerek test edildi. 24 saat tahlil içinhafıza, sinekler eğitim tüpünden çıkarıldı ve 1 saat boyunca standart mısır unu gıda şişelerine aktarıldı, daha sonra test edilene kadar 23 saat boyunca açlık şişelerine geri aktarıldı. Performans İndeksi, CS artı koldaki sinek sayısı eksi CS kolundaki sayının toplam sinek sayısına bölünmesiyle hesaplandı. MCH ve OCT, dönüşümlü olarak CS plus veya CS olarak kullanıldı ve tek bir numune veya n, karşılıklı olarak eğitilmiş iki gruptan alınan ortalama Performans İndeksini temsil eder.

Mg2 artı beslenmeden sonraki davranış testleri için, 1–2-günlük sinekler, yukarıda açıklandığı gibi iştah açıcı eğitim ve test için aç bırakılmadan önce 1-5 gün boyunca Mg2 artı takviyeli gıda içeren şişelerde barındırıldı. 80 mM [Mg2 artı ] gıda yapmak için, 460 ml normal sıvı uçucu gıdaya 40 ml 1 M MgCl2 solüsyonu ilave edildi; 1 mM [Mg2 plus ] yemi, 0,5 ml 1 M MgCl2'nin 39,5 ml MilliQ su içinde seyreltilmesi ve 460 ml sıvı gıdaya eklenmesiyle yapılmıştır. Yiyecekler bölündü ve katılaşması için soğutuldu. MgSO4 ve CaCl2 katkılı gıdalar da aynı şekilde hazırlandı.

Aversive hemen ve 24 saathafızadeneyler daha önce tarif edildiği gibi yapıldı (Hirano ve diğerleri, 2013; Perisse ve diğerleri, 2016; Tully ve Quinn, 1985). 100-120 sineklik gruplar, ya bir caydırıcı eğitim döngüsü ya da 15 dakikalık denemeler arası aralıklarla (aralıklı eğitim) aralıklı beş döngü ile eğitildi. caydırıcı acil içinhafıza, sinekler bir döngü eğitiminden sonra test edildi. Önleyici 24 saathafızaiki farklı protokol kullanılarak test edilmiştir. Açlığı kolaylaştıran protokolde, sinekler bir döngü eğitiminden önce 16 saat aç bırakıldı (Hirano ve diğerleri, 2013). Aralıklı eğitim için, sinekler eğitimden önce aç bırakılmadı. Sinekler için test edilmeden önce aç bırakılmış ve aralıklı eğitimden sonra 24 saat boyunca normal sinek yemi ile beslendi.hafızaverim. Her caydırıcı eğitim döngüsü sırasında, sinekler 1 dakika boyunca ilk kokuya (CS plus) ve 5 saniyelik aralıklarla on iki adet 90 V elektrik şokuna maruz bırakıldı. 45 s temiz havanın ardından, şok olmadan 1 dakika boyunca ikinci bir koku (CS) sunuldu. Performans İndeksi, CS kolundaki sinek sayısı eksi CS artısındaki sayı olarak hesaplandı.

kol, toplam sinek sayısına bölünür. MCH ve OCT, dönüşümlü olarak CS plus veya CS olarak kullanıldı ve tek bir numune veya n, karşılıklı olarak eğitilmiş iki gruptan alınan ortalama Performans İndeksini temsil eder.

Duyusal keskinlik testleri (Şekil 2-kaynak veri 1), tarif edildiği gibi (Keene ve diğerleri, 2004; Keene ve diğerleri, 2006; Schwaerzel ve diğerleri, 2003) modifikasyonlarla yapıldı. Koku alma keskinliğini test etmek için, eğitimsiz sineklere, şartlandırmada kullanıldığı gibi seyreltilmiş bir koku ile T labirentinde mineral yağın içinden geçirilmiş hava arasında seçim yapmaları için 2 dakika verildi. Bir Kaçınma İndeksi, hava kolundaki sinek sayısı eksi koku kolundaki sayının toplam sinek sayısına bölünmesiyle hesaplandı. Elektrik çarpmasından kaçınma benzer şekilde yapıldı ve hesaplandı. Eğitimsiz sinekler, elektrik şebekeleri içeren iki tüp arasında 1 dakika seçti, ancak yalnızca biri güç kaynağına bağlıydı. Bir kaçınma endeksi, elektrikli olmayan koldaki sinek sayısı eksi elektrikli koldaki sayının toplam sinek sayısına bölünmesiyle hesaplandı. Şeker keskinliğini değerlendirmek için, aç sineklere, T-labirentin kurutulmuş şeker kağıdı içeren bir kolu ile kurutulmuş bir 'su' filtre kağıdı içeren diğer kolu arasında seçim yapmaları için 2 dakika verildi. Her iki kağıt da iştah açıcı olarak hazırlandı.hafızatahliller. Şeker kolundaki sinek sayısı ile diğer koldaki sinek sayısının toplam sinek sayısına bölünmesiyle bir Tercih İndeksi hesaplandı. Davranış odasında ışığı açık tutmanın ve test tüplerinden geçen hava akışının, vahşi tip sineklerde Tercih İndeksini büyük ölçüde arttırdığını ve bu nedenle tüm şeker tercih testleri için bu koşulları uyguladığını bulduk.

Anti-UEX antikoru ve western blot

Eurogentec tarafından ticari olarak bir poliklonal UEX antikoru geliştirilmiştir. Antijen olarak iki peptit sentezlendi: Peptid 1 H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH (16aa) ve Peptid 2H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2 (16aa) ve tavşanlara enjekte edildi. Yalnızca Peptid 2, güçlü bir bağışıklık tepkisi indükledi ve daha fazla işlendi. Nihai serum, Peptid 2'ye karşı saflaştırıldı ve western blot analizi için 1:2000 seyreltme olarak kullanıldı.

Western blot'taki her numune için proteinler, 30 ml 2-merkaptoetanol (Bio-Rad), 270 ml 4 karışımı içeren 120 ml protein numune tamponu içinde iyice homojenize edilerek 20 sinek kafasından ekstrakte edildi. Laemmli numune tamponu (BioRad) ve 900 ml Nükleazsız Su (Invitrogen). Numuneler daha sonra 100˚C'lik bir ısı bloğunda 3 dakika kaynatıldı ve yüklemeden önce 10 dakika santrifüjlendi. Her bir SDS-PAGE jel şeridine dört kafaya eşdeğer bir numune hacmi yüklendi. Proteinler PVDF membranına aktarıldı ve yüzde 5 yağsız süt içinde 1 saat 25°C'de 35 rpm çalkalama ile bloke edildi. Zar daha sonra anti-UEX solüsyonunda (yüzde 5 yağsız sütte 1:2000 tavşan anti-UEX) gece boyunca 4°C'de 35 rpm çalkalama ile inkübe edildi. Membran hızlı bir şekilde üç kez yıkandı, ardından TBST solüsyonunda (100 ml TBS 10 solüsyonu, BioRad, 900 ml MilliQ su içinde seyreltilmiş, yüzde 0.1 Tween 20 ile) 3 10 dakika yıkandı ve ardından HRP-konjuge ile inkübe edildi. sekonder antikor çözeltisi (1:5000 keçi anti-tavşanı yüzde 5 süt içinde) 1–2 saat 25°C'de 35 rpm çalkalama ile. Membran tekrar hızlı bir şekilde üç kez yıkandı, ardından TBST'de 3 10 dakika yıkandı. Protein bantları, Pierce ECL western blot substratı (Life Technologies, 32134) kullanılarak görselleştirildi. Membran daha sonra Millipore ReBlot Plus Mild solüsyonu (Merck, 2502) kullanılarak sıyrıldı, tekrar yüzde 5 yağsız süt içinde bloke edildi ve fare anti-Tubulin birincil antikoru (1:2000, Sigma, T6199) ve ilgili HRP konjuge keçi anti- ile problandı. fare sekonder antikoru (1:5000) yukarıda ayrıntılı olarak açıklanan protokolü takip eder.

bağışıklık kazandırma

İmmün boyama, tarif edildiği gibi yapıldı (Wu ve Luo, 2006). 1- ile 5-günlük yetişkin sineklerin beyinleri, PBS içinde parçalandı ve oda sıcaklığında yüzde 4 paraformaldehit içeren PBS içinde 20 dakika sabitlendi. Daha sonra iki kez kısaca 0%0.5 PBT (497.5 ml PBS içinde 2.5 ml Triton-X100) ve üç 20 dakikalık yıkama yıkandı. Beyinler daha sonra oda sıcaklığında yüzde 5 normal keçi serumu içeren PBT'de 30 dakika süreyle bloke edildi ve ardından 1 veya 2 gün boyunca 4°C'de hafif rotasyonla (35 rpm) birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edildi. Birincil antikorlar, tavşan anti-GFP (1:250; Invitrogen A11122) ve tavşan anti-HA (1:250, NEB 3724T) idi. Alexa 488-konjuge keçi anti-tavşan (1:250; Invitrogen, A11034) ikincil antikordu. İkincil antikor inkübasyonundan önce ve sonra, beyinler iki hızlı yıkamaya ve ardından yüzde 0,5 PBT'de 20 dakikalık üç yıkamaya tabi tutuldu. Lekeli beyinler Vectashield'de (Vector Labs H1000) cam slaytlara monte edildi ve 40 büyütmede bir Leica TCS SP5 konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülendi (HCX PL APO 40, 1.3 CS yağa daldırma hedefi, Leica). Görüntü yığınları, 1 mm'lik adımlarla 1024 1024 çözünürlükte toplandı ve Fiji kullanılarak işlendi (Schindelin ve diğerleri, 2012). Şekil 3G ve H'deki miktar tayini için, dünya için yaklaşık 40 25 mm dikdörtgen ROI'ler veya ab, a'b' ve EB için 15 mm çapında yuvarlak ROI'ler tek bir bölüme manuel olarak çizilmiştir. sinek beyninin z-yığın taraması. Karşılık gelen ROI'ler ayrıca arka plan kontrol bölgesi olarak üstün medial protoserebrum (SMP) üzerine çizilmiştir ve ortalama floresans ImageJ kullanılarak hesaplanmıştır. MB loblarının ve EB'nin ROI yoğunluğu, ilgili SMP yoğunluğununkine normalleştirildi. Tek bir veri noktası için sol ve sağ beyinler arasında bir ortalama kullanıldı. Şekil 7C ve D'deki miktar tayini için, ROI'ler şekillerde belirtilmiştir ve ROI yoğunluğu, Şekil 3H'deki sonuçlara benzer şekilde hesaplanmıştır. Şekil 7C'de, a lobunun ucunun en geniş kısmından bir çizgi çizilmiştir. Bu hattın yoğunluk profili ImageJ ile elde edildi. Her bir hat profili için yaklaşık 15 mm'lik bir çizgiyi kapsayan böyle bir profilin ortasındaki otuz veri noktası çıkarıldı. Profil, ilk beş veri noktasının (F0) ortalama değerine daha da normalleştirildi ve (F F0)/F0 olarak hesaplandı. Farklı beyinlerden bu normalleştirilmiş profillerin ortalama değerleri çizildi (Şekil 7C, orta panel). Beyinlerin sol ve sağ profilleri hesaplandı ve ayrı ayrı görüntülendi. Şekil 7D'de, farklı bölgeleri temsil eden farklı ROI'lerden gelen göreli yoğunluklar, MB için bir toplam yoğunluk ölçüsü oluşturmak üzere bir araya eklenir.

Hücre kültüründe Mg2 artı akışı araştırmak için kullanılan insan CNNM4 cDNA ekspresyon yapısı, daha önce tarif edilendir (Yamazaki ve diğerleri, 2013). Drosophila uex'i ifade eden bir yapı, uex CDS'nin STOP kodonunun önüne bir FLAG etiketi yerleştirilerek üretildi. FLAG etiketli CNNM4 ve uex cDNA'lar daha sonra HEK293 hücrelerinde ekspresyon için pCMV etiketine-4A (Agilent) yerleştirildi. HEK293 hücreleri, yüzde 10 Fetal Bovine Serum (FBS) ve antibiyotiklerle takviye edilmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (Nissui) kültürlendi. Ekspresyon plazmitleri, Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ile transfekte edildi.

İmmün boyama için hücreler 20 dakika boyunca PBS içinde yüzde 3,7 formaldehit ile sabitlendi ve ardından her ikisi de oda sıcaklığında olmak üzere 5 dakika boyunca PBS içinde yüzde 0,2 Triton X-100 ile geçirgenleştirildi. Daha sonra, oda sıcaklığında 1 saat boyunca yüzde 3 FBS ve yüzde 10 sığır serum albümini (blokaj tamponu) içeren PBS ile bloke edildiler. Hücreler daha sonra bloke edici tamponda seyreltilmiş tavşan anti-FLAG antikoru (F7425, Sigma-Aldrich) ile 4°C'de gece boyunca inkübe edildi, 3'ü PBS ile yıkandı ve 1 saat boyunca Alexa 488-konjuge anti- ile oda sıcaklığında inkübe edildi. tavşan IgG'si (Invitrogen) ve rodamin-phalloidin (F-aktin görselleştirmesi için, Invitrogen) bloke edici tampon içinde seyreltildi. PBS ile üç yıkamadan sonra, lameller lamlara monte edildi ve konfokal bir mikroskopla (FluoView FV1000; Olympus) görüntülendi.

Magnezyum Yeşili ile Mg2 artı görüntüleme, hafif modifikasyonlarla tarif edildiği gibi (Yamazaki ve diğerleri, 2013) yapıldı. [Mg2 plus ]i'nin eksprese edilen proteinlerle potansiyel olarak azalmasını önlemek için, transfekte edilmiş HEK293 hücreleri, görüntülemeye kadar 40 mM MgCl2 ile desteklenmiş büyüme ortamında kültürlendi. Hücreler daha sonra 2 mM Magnezyum Yeşil-AM dahil olmak üzere Mg2 artı yükleme tamponu (78.1 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 40 mM MgCl2, 5.5 mM glikoz ve 5.5 mM HEPES-KOH [pH 7.4]) ile inkübe edildi. (Invitrogen), 30 dakika 37˚C'de. Hücreler daha sonra yükleme tamponu ile bir kez durulandı ve bir ORCA-Flash 4.0 CMOS kamera (Hamamatsu) ve bir SHI-1300L cıva lambası (Olympus) ile donatılmış bir Olympus IX81 mikroskobu ile görüntülendi. Floresans, Metamorph yazılımının (Molecular Devices) kontrolü altında her 20 saniyede bir (470–490 nm'de eksitasyon ve 505–545 nm'de emisyon) ölçüldü. Tampon daha sonra Mg2 artı serbest tampon olarak değiştirildi (yükleme tamponundaki MgCl2, 60 mM NaCl ile değiştirildi). Veriler, çizgi grafikleri olarak sunulur (10 hücrenin ortalaması). Görüntülemeden sonra hücreler, yüzde 3,7 formaldehit içeren PBS ile sabitlendi ve protein ekspresyonunu doğrulamak için immünofloresan mikroskopisine tabi tutuldu.

Sabit sinek beyinlerinde FRET tabanlı Mg2 plus konsantrasyon ölçümleri

c739 genotipli bir ila iki günlük sinekler; UAS-MagFRET-1, toplanmadan önce 4 gün boyunca 1 mM veya 80 mM [Mg2 artı ] gıda içeren şişelerde muhafaza edildi. Sinek beyinleri PBS içinde parçalandı ve oda sıcaklığında yüzde 4 paraformaldehit içeren PBS içinde 20 dakika sabitlendi. Daha sonra yüzde 0,5 PBT (497.5 ml PBS içinde 2.5 ml Triton-X100) ve üç 10 dakikalık yıkama ile iki kez kısaca yıkandı. Beyinler daha sonra Vectashield'de (Vector Labs H1000) cam slaytlara monte edildi ve 40, 0.8 NA suya daldırma objektifli geniş alan Scientifica Slicescope ve Andor Solis yazılımına sahip bir Andor Zyla sCMOS kamera kullanılarak görüntülendi (v4.27). Ab nöronunun Mg2 artı konsantrasyonunu gösteren FRET oranını elde etmek için, cerulean kanalı ile sitrin kanalı arasında alternatif olarak 3 Hz'de 512 512 piksel ve 16 bit ile zaman serileri elde edilmiştir. Her iki kanal için uyarma dalga boyu 436 nm iken, cerulean için emisyon filtresi 460-500 nm ve sitrin için bu 520-550 nm'dir. Seri alımı cerulean kanalından başlar ve 5 s sürer, ardından sitrin kanalına geçer ve 5 s daha sürer ve bu döngü iki kez daha tekrarlanır. Bu nedenle her beyin için toplam 30 s (90 kare) görüntü yığını elde edildi. Görüntü yığınları daha sonra ImageJ ve özel olarak yazılmış Matlab komut dosyaları kullanılarak analiz edildi. Özetle, dikdörtgen ROI'ler (Şekil 1E, sol panel) arka plan kontrolü olarak ab loblarında (her yarım küre için bir lobda ve bir b lobunda) ve ab loblarının dışında (her yarım küre için bir tane) manuel olarak çizilmiştir. Cerulean kanalından gelen floresan yoğunluğu, her dikey veya yatay lob ROI'sinin arka plan ROI'sine bölünmesiyle hesaplandı ve her lob için iki yarım kürenin ortalaması alındı ​​ve her döngü için 15 kare üzerinden ortalaması alındı. Sitrin kanalından da benzer şekilde elde edilmiştir. Yukarıdaki yoğunluklardan bir FRET oranı elde edildi, ayrıca Şekil 1E'de (sağ panel) bir veri noktası olarak gösterilen üç edinme döngüsü arasında ortalaması alındı.

Eksplant sinek beyninde konfokal Mg2 artı görüntüleme

c739-GAL4 tahrikli UAS-MagIC'yi ifade eden eksplant beyinleri, hücre dışı altına 35 mm'lik cam tabanlı bir mikro kuyucuk çanağının (Parça No. P35G-1.5–14 C, MatTek Corporation) altına yerleştirildi. tuzlu su tampon solüsyonu (103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM N-Tris, 10 mM trehaloz, 10 mM glukoz, 7 mM sakaroz, 26 mM NaHC03, 1 mM NaH2P04, 1.5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, ozmolarite 275 mOsm pH 7.3]) kalsiyum içermeyen tamponda diseksiyonun ardından (Barnstedt ve ark., 2016). UAS-MagIC'nin Mg2 artı duyarlılığının yanı sıra UAS-MagIC'nin EDTA, EGTA ve CaCl2 gibi diğer kimyasallara tepkisini belirlemek için (Şekil 8B), beyinler 20 mg/ml digitonin ile tuzlu su tampon çözeltisinde inkübe edildi. Görüntülemeden 6 dakika önce (Koldenkova ve ark., 2015). Forskolin (FSK) uygulamasına yanıt olarak Mg2 artı dalgalanmayı araştırmak için (Şekil 8C–I), beyinler digitonin veya inkübasyon olmadan salin tampon çözeltisine konuldu. Her iki durumda da tuzlu su, beynin içine daldırıldığı tamponu (dijitoninli veya dijitoninsiz) ifade eder.

Görüntüleme, ZEN 2011 yazılımı kullanılarak 20 hava hedefi olan bir LSM780 konfokal mikroskopta (Zeiss) gerçekleştirildi. MagIC'nin Venüs kısmı 488 nm lazer ile heyecanlandı ve emisyonu 520-560 nm aralığında toplandı. mCherry 561 nm lazer ile heyecanlandı ve emisyonu 600-640 nm aralığında toplandı. Zaman serileri, 512 512 piksel ve 16 bit ile 0,5 Hz'de elde edilmiştir. 60 s'lik başlangıç ​​Venüs/mCherry ölçümünün ardından, 2–20 ml salin veya diğer ilgili kimyasal solüsyon bir mikropipet aracılığıyla sabit görüntü yakalama ile tabağa eklendi. Uygulanan ajanların Venus/mCherry emisyonu üzerindeki etkileri 15-20 dakika süreyle kaydedildi.

Görüntü yığınları daha sonra ImageJ ve özel olarak yazılmış Python komut dosyaları kullanılarak analiz edildi. Kısaca, dikdörtgen ROI'ler ab nöronları üzerine manuel olarak çizilmiştir (her yarım küre için bir tane, Şekil 8A) ve aynı boyutta başka bir ROI, arka plan kontrolü olarak MB'lerin ortasında ancak dışına çizilmiştir. Venüs (veya mCherry) kanalından gelen floresan yoğunluğu, sırasıyla kaliks ROI'lerinden arka plan ROI'si çıkarılarak hesaplandı ve iki yarım küre arasında ortalaması alındı. Buna 'Rel' denir. Şekil 8D ve E'de Yoğunluk (au)'. Venüs ve mCherry yoğunluğu arasındaki oran, Şekil 8B ve C ve Şekil 8F ve G'de 'MagIC Ratio' olarak hesaplanmıştır. Şekil 8H için, iki kanalın yoğunluğu ayrı olarak hesaplanmıştır. Bu durumda, 'Rel. Yoğunluk (DF/F0)', (FF0)/F{{9} olarak hesaplanan, F0 başlangıç ​​döneminden ortalama yoğunluğa normalize edilen bağıl floresan yoğunluğunu ifade eder. }. Venüs'ün nispi yoğunluğu DF/F0, Welch'in ortalama periodogram yöntemini benimseyen python işlevi psd (matplotlib.pyplot altında) aracılığıyla PSD'yi (Şekil 8I) hesaplamak için kullanıldı (Bendat ve diğerleri, 2000).

Ters transkripsiyon ve kantitatif gerçek zamanlı PCR

Her numune için 120 sinek sıvı nitrojen içinde donduruldu ve kafaları TRIzol reaktifi (Invitrogen) içinde tamamen homojenleştirildi. Toplam RNA, üreticinin talimatları izlenerek bir Direct-zol RNA MiniPrep (R2050) kiti kullanılarak ekstre edildi. cDNA, SuperScript III First-Strand sentez sistemi (Invitrogen) kullanılarak sentezlendi. Her farklı muamele veya genotip için beş bağımsız numune hazırlandı. Kantitatif PCR, SYBR Green I Master Mix (Roche) kullanılarak bir LightCycler 480 Aleti (Roche) üzerinde her cDNA numunesi için üç kopya halinde gerçekleştirildi. Amplifikasyondan sonra erime eğrileri analiz edildi ve amplikonlar, primer spesifikliğini doğrulamak için agaroz jel elektroforezi ile görselleştirildi. Göreceli transkript seviyeleri 2-DDCt yöntemi (Livak ve Schmittgen, 2001) ile hesaplandı ve normalizasyon için üç referans genin (Gapdh, Tbp ve Ef1a 100E) Ct değerlerinin geometrik ortalaması kullanıldı. Primerler Kaynak Tablosunda detaylandırılmıştır.

Ters PCR

uexMI01943 sineklerinde MiMIC yerleştirme konumunu haritalamak için ters PCR kullanıldı. 15 yetişkin sinekten genomik DNA hazırlandı. İki sineğe eşdeğer DNA daha sonra Mbo I ile 25 ml'lik bir kısıtlama reaksiyonunda sindirildi ve 10 ml ürün, parçaları dairesel hale getirmek için gece boyunca 4°C'de bağlandı; Ters PCR için 5 ml ligasyon ürünü kullanıldı. PCR ürünü, dizilemeden önce Exo/SAP reaksiyonu (Thermo Fisher, 78201) kullanılarak saflaştırıldı. Dizi, BLAST tarafından D. melanogaster genomu (FlyBase, Release 6) ile karşılaştırıldı ve FlyBase üzerinde rapor edilen uexMI01943 eklemesi ile tutarlı olarak, 2R üzerinde 3,882,886.3,882.641 bölgesi ile eşit olarak eşleştirildi. Primerler Kaynak Tablosunda detaylandırılmıştır.

Protein alanı tahmini ve hizalama

Protein dizisi hizalaması Geneious R10.2.2 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Protein alanı tahmini, InterPro (Finn ve diğerleri, 2017; Jones ve diğerleri, 2014) ve Phyre2 (Kelley ve diğerleri, 2015) ile yapıldı. Protein alanı ve yapı hizalaması TM-align kullanılarak yapıldı (Zhang ve Skolnick, 2005). Protein yapısı görselleştirmesi Chimera 1.11.2'de yapılmıştır (Pettersen ve diğerleri, 2004).

Kantifikasyon ve istatistiksel analizler

Davranış verileri Excel ve Prism 6 kullanılarak analiz edildi. Görüntüleme verileri, ImageJ ve özel olarak yazılmış MATLAB veya Python komut dosyaları kullanılarak analiz edildi. İki grubu karşılaştırmak için eşleştirilmemiş iki kuyruklu t testleri kullanıldı ve çoklu grupları karşılaştırmak için tek yönlü ANOVA ve ardından bir Tukey post-hoc testi kullanıldı. İstatistiksel anlamlılık eşiği p olarak belirlendi<>

Teşekkür

FJ Arjona ve JGJ Hoenderop'a murin CNNM2 klonları ve el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. MagIC ve MARIO klonları için T Nagai'ye ve sinekler için Bloomington Stok Merkezi ve VDRC'ye minnettarız. Teknik destek için P Cogigni, Y Huang, R Brain, R Szoke-Kovacs ve M Goodwin'e ve tartışma için Waddell grubunun diğer üyelerine teşekkür ederiz. N Halidi, C Monico ve Micron Advanced Biyogörüntüleme Birimi'ne (Well-come Strategic Awards 091911/B/10/Z ve 107457/Z/15/Z tarafından desteklenmektedir) bu çalışmadaki destekleri ve yardımları için teşekkür ederiz. EM, bir EMBO uzun vadeli bursu (ALTF 184-2109) ​​tarafından finanse edildi. KDJ, Rhodes Trust'ın desteğini kabul eder. SW, bir Wellcome Principal Research Fellowship (200846/ Z/16/Z) ve bir ERC Advanced Grant (789274) tarafından finanse edildi.