Bölüm Ⅰ:Cistanche Tubulosa Feniletanoid Glikozitler, Mitokondriye Bağlı ve MAPK Yolları ile Hepatoselüler Karsinom Hücrelerinin Apoptozunu İndükler ve Cisplatin ile Kombinasyon Yoluyla Antitümör Etkisini Artırır

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Changshuang Fu, Yi Yang, Aipire Adila, Fangfang Zhou, Xianxian Wei, Weilan Zhang, Jie Lv, Yijie Li, Lijie Xia, Jinyao Li

Soyut

Cistanche tübülozaÇin bitkisel tıbbının bir türüdür ve çeşitli biyolojik işlevler uygular. Önceki çalışmalar göstermiştir kiCistanche tubulosa feniletanoid glikozitler (CTPG)çeşitli tümör hücreleri üzerinde antitümör etkiler gösterir. Bununla birlikte, CTPG'nin HepG2 ve BEL-7404 hepatoselüler karsinom (HCC) hücreleri üzerindeki antitümör etkileri hala belirsizdir. Çalışmamız, CTPG'nin, p38'in yukarı regüle edilmiş fosforilasyonu, JNK, ve ERK1 / 2 ve mitokondriyal membran potansiyelinin azalması ile karakterize edilen mitokondriyal bağımlı yol. Sitokrom c'nin salınımı ve kaspaz-3, -7, -9 ve PARP bölünmesi, daha sonra CTPG tedavisi ile arttırıldı. Ayrıca, CTPG, matris metalloproteinaz-2 ve vasküler endotelyal büyüme faktörlerinin seviyelerini azaltarak HepG2'nin göçünü önemli ölçüde bastırdı. İlginç bir şekilde, CTPG sadece splenositlerin proliferasyonunu arttırmakla kalmadı, aynı zamanda sisplatin tarafından indüklenen splenositlerin apoptozunu da azalttı. H22 tümör fare modelinde, sisplatin ile birleştirilen CTPG, H22 hücrelerinin büyümesini daha da inhibe etti ve sisplatinin yan etkilerini azalttı. Birlikte ele alındığında, CTPG, doğrudan antitümör etkisi ve dolaylı bağışıklık geliştirme etkisi yoluyla HCC'nin büyümesini inhibe etti ve sisplatinin antitümör etkinliğini geliştirdi.

anahtar kelimeler

Cistanche tübülozafeniletanoid glikozitler, apoptoz, MAPK yolu, mitokondriyal bağımlı yol, sisplatin, bağışıklık geliştirme.

giriiş

Karaciğer kanserinin, 2018'de, Güneydoğu Asya'da (Moğolistan, Kamboçya ve Vietnam) her yıl yaklaşık 841 000 yeni vaka ve 782000 ölümle dünya çapında en sık teşhis edilen altıncı kanser ve kansere bağlı ölümlerin dördüncü önde gelen nedeni olduğu tahmin ediliyordu. .1 Çin'de karaciğer kanseri, 2015 yılında kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedeniydi.2 Dünya çapında birincil karaciğer kanserlerinin yüzde 90'ından fazlası hepatoselüler karsinomdur (HCC). Şu anda, hepatektomi, karaciğer transplantasyonu ve perkütan ablasyon HCC tedavisi için ana yöntemlerdir. Ne yazık ki, bu tedaviler erken karaciğer kanseri teşhisi konan hastaların yüzde 30'u için etkilidir, öte yandan ileri karaciğer kanseri teşhisi konan hastalar (yüzde 40'a karşılık gelir) hayatta kalma sürelerini uzatmak için palyatif tedaviye güvenmek zorundadır.3,4 Sorafenib hepatik ile kombinasyon halinde arteriyel kemoembolizm, Asya-Pasifik bölgesinde ilerlemiş HCC'li çoğu hasta için önemli ve yaygın bir palyatif tedavidir.5 İleri karaciğer kanseri tedavisi için FDA tarafından 2006 yılında onaylanan Sorafenib, tümör hücresi proliferasyonunu ve vasküler üretimi ve tümör hücresi apoptozunu teşvik eder. Sorafenib, hastanın yaşam süresini 3 ila 5 ay arasında önemli ölçüde uzatır, ancak ciddi yan etkileri vardır ve ilaç direncinin ortaya çıkmasıyla yakından ilişkilidir.6 Bu nedenle, HCC için yeni ilaçlar veya stratejiler geliştirmek acildir.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM) tek başına veya diğer stratejilerle kombinasyon halinde HCC'yi tedavi etmek için kullanılmıştır ve uzun sağkalım süresi, iyileştirilmiş yaşam kalitesi, azaltılmış advers reaksiyonlar vb. dahil olmak üzere klinik faydalar göstermiştir.7,8cistanchefeniletanoid glikozitler (PhG'ler), iridoidler, lignin ve polisakkaritleri içeren ve anti oksidasyon, anti-inflamasyon, anti-aging, hafıza geliştirme ve bağışıklık geliştirme fonksiyonları gibi çeşitli biyolojik fonksiyonlara sahip bir TCM'dir.9 PhG'ler, ana aktif bileşenlericistancheve anti-oksidasyon, anti-inflamasyon, anti-apoptoz, hepatoproteksiyon ve nöroproteksiyon dahil olmak üzere birçok işlevi vardır.10-12 Grubumuz bunu bildirmişti.Cistanche tubulosa feniletanoid glikozitler(CTPG), melanom B16-F10 hücrelerinin, özofagus karsinomu Eca-109 hücrelerinin ve HCC H22 hücrelerinin büyümesini in vitro veya in vivo olarak dışsal veya içsel sinyal yolları yoluyla inhibe edebilir; ayrıca CTPG'nin immün sistemi uyarıcı bir etkisi vardı.13-15

Bu çalışmada, CTPG'nin HepG2 ve BEL-7404 hücreleri üzerindeki antitümör etkisini ve mekanizmasını in vitro araştırdık, CTPG'nin immünomodülatör işlevini in vitro ve in vivo analiz ettik ve ayrıca kemoterapi ile birlikte CTPG'nin terapötik etkisini değerlendirdik. in vivo olarak HCC H22 tümör farelerinde ilaç cisplatin. CTPG'nin, mitokondriye bağımlı apoptoz ve MAPK sinyal yolu yoluyla HepG2 ve BEL{4}} hücrelerinin büyümesini engelleyebileceğini bulduk. CTPG, matris metalloproteinaz-2 (MMP-2) ​​ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) seviyelerini azaltarak HepG2 hücrelerinin göçünü önemli ölçüde inhibe etti. Ek olarak, CTPG, bağışıklık hücrelerinin çoğalmasını ve aktivasyonunu destekledi ve farelerin bağışıklığını arttırdı. Önemli olarak, sisplatin ile birleştirilmiş CTPG, in vivo olarak H22 hücrelerinin büyümesini daha da inhibe edebilir ve sisplatinin yan etkilerini azaltabilir.

Malzemeler ve yöntemler

Hayvanlar

Yaklaşık 6 ila 8 haftalık erkek BALB/c, Kunming fareleri ve dişi C57BL/6 fareleri, Sincan Tıp Üniversitesi (Urumqi, Xinjiang, Çin) Hayvan Laboratuvarı Merkezi'nden satın alındı ​​ve Xinjiang Üniversitesi'nin bir hayvan tesisine oda sıcaklığında yerleştirildi. (RT) 25±3 derece ve 12/12 saat aydınlık-karanlık periyodu.

Hücre Çizgileri ve Hücre Kültürü

Murin H22 hücreleri, Procell Life Science & Technology Co., Ltd.'den (Wuhan, Hubei, Çin) satın alındı ​​ve insan HCC HepG2 ve BEL-7404 hücreleri, Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering'den elde edildi. , Xinjiang Üniversitesi (Urumqi, Xinjiang, Çin) ve yüzde 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (MRC, Çin), yüzde 1 L içeren RPMI 1640 ortamında (Gibco, ABD) veya Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamında (DMEM) (Gibco) kültürlendi. -glutamin (100mM), 100U/mL penisilin ve 100ug/mL streptomisin, yüzde 5 CO2'lik nemli bir atmosferde 37 derecede.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)

CTPG'nin ana bileşikleri (Upbio Tech Co., Ltd., Şanghay, Çin) daha önce bildirildiği gibi HPLC ile nitelenmiş ve nicelleştirilmiştir.13 Bir ZORBAX SB-C18 Sütunu (250×4.6mm; 5μm) kullanılmıştır. ve mobil faz, yüzde 0.2 formik asit çözeltisi ve yüzde 23 ila yüzde 31 arasında değişen bir metanolden oluşuyordu. Toplam 10μL numune enjekte edildi ve 330 nm'de tespit edildi. CTPG bileşenlerini analiz etmek için echinacoside ve acteoside standartları (Yuanye, Shanghai, China) kullanıldı.

Hücre Canlılığının Analizi

CTPG'nin HepG2 ve BEL-7404 hücreleri üzerindeki antitümör etkileri, MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiyazolil)-2, {{7 kullanılarak değerlendirildi. }}difenil-2-H-tetrazolyum bromür). HepG2 ve BEL-7404 hücreleri, 96-kuyu plakalarına (5 × 104 hücre/kuyu) kaplandı ve 0, 200, ile işlendi. 37 derecede 24 saat inkübasyondan sonra sırasıyla 24 ve 48 saat boyunca 400 ve 600 ug/mL CTPG. Pozitif kontrol olarak yaklaşık 35 ug/mL sisplatin (Yuanye) kullanıldı. Daha sonra her bir oyuğa 100 uL MTT (0.5 mg/mL, FBS ortamı içermeyen ortamla seyreltilmiş) ilave edildi ve 3 saat 37 derece ve yüzde 5 CO2'de kültürlendi. İnkübasyondan sonra plakalar 7 dakika 1200 rpm'de santrifüjlendi, ortam çıkarıldı ve oluşan formazan kristallerini çözmek için her bir oyuğa 200 ug/mL DMSO ilave edildi. OD490 değerleri bir 96-kuyulu mikroplaka okuyucu (Bio-Rad Laboratories, CA, ABD) ile ölçülmüştür. CTPG'nin splenositler üzerindeki etkilerini değerlendirmek için hücreler C57BL/6 farelerinden izole edildi ve 1 x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda 96-yuvalı plakalara kaplandı. Splenositler sırasıyla 24, 48 ve 72 saat boyunca 0, 200, 400 ve 600 ug/mL ile muamele edildi. Hücre canlılığı, aşağıdaki formülle hesaplandı: Hücre canlılığı (yüzde)=(ODtedavi edilmiş/ODtedavi edilmemiş) x yüzde 100.

Ki-67'nin Tespiti

Ki{0}} tespiti önceki çalışmamıza göre yapıldı.16 Kısaca, BEL-7404 hücreleri farklı konsantrasyonlarda (0, 200, 400 ve 600ug/mL) CTPG ile tedavi edildi. veya sisplatin (35ug/mL). 24 saat sonra hücreler toplandı ve PBS ile yıkandı, daha sonra sabitlendi ve üreticinin talimatlarına göre Foxp3 Boyama Tampon Seti (eBioscience, ABD) ile geçirgenleştirildi. Hücre içi boyama, RT'de 15 dakika süreyle FITC konjuge Ki-67 antikoru (BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) kullanılarak yapıldı. Örnekler akış sitometrisi (BD FACSCalibur, CA, ABD) ile analiz edildi.

Hücre Apoptoz ve Hücre Döngüsünün Analizi

HepG2 ve BEL-7404 hücreleri, 2.5x105 hücre/tabak yoğunluğunda ekildi ve gece boyunca 37 derecede inkübe edildi. Hücreler tripsinize edildi ve çeşitli konsantrasyonlarda CTPG ile muamele edildikten sonra veya kaspaz inhibitörü (Z-VAD-FMK) veya kaspaz-3 inhibitörü (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Çin) ile 2 için ön işleme tabi tutulduktan sonra santrifüjleme ile toplandı. CTPG tedavisinden saatler önce. 24 saat sonra, akış sitometrisi ile apoptoz tespit edildi. Kısaca, toplanan hücreler soğuk PBS (Gibco) ile yıkandı ve 2.5μL Annexin V-FITC ve 5μL PI-PE Boyama Solüsyonu (Solarbio, Beijing, Çin) ile anneksin bağlama tamponunda yeniden süspanse edildi ve ardından hücreler oda sıcaklığında inkübe edildi. 15 dakika karanlıkta. Hücre döngüsü dağılımının analizi için, hücreler CTPG işleminden sonra toplandı ve 30 dakika boyunca 4 derecede soğuk yüzde 70 etanol içinde sabitlendi. Hücreler, karanlıkta 30 dakika boyunca PI (BD Biosciences) ile boyandı. Örnekler akış sitometresi (BD FACSCalibur) ile analiz edildi. Western blot ile hücre apoptozunun ve döngü ile ilgili proteinlerin ekspresyon seviyeleri tespit edildi.

Batı lekesi

Western blot, önceki çalışmamıza göre yapıldı.17 HCC, 24 saat CTPG ile tedavi edildi. Buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkandıktan sonra, tüm yapışık ve yüzen hücreler toplandı ve RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) içinde buz üzerinde 20dakika boyunca parçalandı. 12000 rpm'de 4 derece 10 dakika santrifüj edildikten sonra, üreticinin talimatlarına göre bir Bicinchoninic Acid Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, ABD) kullanılarak protein konsantrasyonu belirlendi. Aynı protein konsantrasyonu yüzde 12 SDS-PAGE ile ayrıldı ve PVDF membranlarına aktarıldı. PBST tamponu (yüzde 0.05 Tween'li PBS-20) ile yıkandıktan sonra, membranlar yüzde 5 yağsız süt ile 37 derecede 1 saat bloke edildi ve ardından birincil antikorlarla (Cell Signaling Technology, MA, ABD) inkübe edildi. ) 4 derecede gece boyunca uygun seyreltmelerde . PBST ile 3 kez yıkandıktan sonra membran, karşılık gelen HRP-konjuge sekonder antikorlar (eBioscience) ile 2 saat 37 derecede inkübe edildi. Hedef proteinler, bir ECL tahlil kiti (Beyotime) kullanılarak saptandı. Gri tonlamalı tarama verileri Image J ile elde edilmiştir.

Mitokondriyal Membran Potansiyelinin Analizi (Δψm)

Δψm, zar geçirgen JC-1 boyası (Beyotime) ile belirlendi. Kısaca, HepG2 ve BEL-7404 hücreleri, 24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CTPG (0, 200, 400 ve 600ug/mL) ile muamele edildi. Tüm hücreler toplandı ve JC-1 yıkama tamponu ile yıkandı. Hücreler, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca üreticinin talimatına göre JC-1 floresan probu ile boyandı. PBS ile iki kez yıkandıktan sonra tüm numuneler akış sitometrisi (BD FACSCalibur) ile analiz edildi.

Hoechst 33342 Boyama

Hoechst 33342 boyaması önceki çalışmamıza göre yapıldı.16 Çekirdeklerin morfolojik değişiklikleri, membran geçirgen DNA bağlayıcı boya Hoechst 33342 (Beyotime) kullanılarak incelendi. Kısaca, hücreler bir 6-kuyu plakasına 2 mL'lik bir ortam içinde 1 x 105 hücre/kuyu konsantrasyonunda aşılandı. Yüzde 70 ila yüzde 80 birleşme noktasına ulaştığında hücreler, 24 saat boyunca 200, 400 ve 600 ug/mL CTPG veya sisplatin ile tedavi edildi. Hücreler PBS ile yıkandı ve yüzde 4 buz gibi soğuk paraformaldehit ile 4 derecede 10 dakika sabitlendi. PBS ile yıkandıktan sonra hücreler Hoechst 33342 ile 4 derecede 10 dakika boyandı. Örnekler, floresan ters çevrilmiş mikroskopla (Nikon Eclipse Ti-E, Japonya) gözlemlendi.

Göç Tahlili

HCC hücre göçü, yara iyileştirme deneyi yoluyla tespit edildi. Kısaca, HepG2 hücreleri (2x104/kuyu), bir 24-kuyu plakasına ekildi. Yüzde 80 birleşme noktasına ulaştıktan sonra, her kuyunun merkezi 20μL'lik bir pipet ucuyla bir kez çizildi. PBS ile yıkandıktan sonra hücreler, 37 derecede sisplatin (35ug/mL) veya farklı konsantrasyonlarda (0, 200, 400 ve 600ug/mL) CTPG ile muamele edildi. 24 saat sonra, her numunenin görüntüleri mikroskop altında alındı ​​(Nikon Eclipse Ti-E). Ortalama hücre göçü mesafeleri Image J ile analiz edildi. Yara iyileşmesi yüzdesi şu denklemle hesaplandı: yara iyileşmesi (yüzde )=(belirtilen zaman noktasında 1-çizik alanı/0 saatte çizik alanı)×100 yüzde . Hücre göçü ile ilgili proteinler MMP-2 ve VEGF'nin ekspresyon seviyeleri Western blot ile tespit edildi.

Splenositlerin Proliferasyonu ve Apoptozu

Proliferasyon analizi için, splenositler 3 C57BL/6 faresinden izole edildi ve CFSE (eBioscience) ile boyandı. CFSE etiketli hücreler, oyuk başına 1 mL ortam içinde 2 x 106 hücre yoğunluğunda 24-kuyucuklu plakalara aşılandı ve farklı konsantrasyonlarda CTPG (200, 400 ve 600 ug/mL) ile işlendi veya 35 ug ile birleştirildi. 72 saat süreyle /mL sisplatin. Akış sitometrisi analizi, CD3-APC ve CD19-PE (BD Biosciences) ile boyamadan sonra yapıldı. Apoptoz analizi için, splenositler, oyuk başına 1 mL ortam içinde 2 x 106 hücre yoğunluğunda 24-kuyucuklu plakalara aşılandı ve farklı konsantrasyonlarda CTPG (200, 400 ve 600 ug/mL) ile işlendi veya 24 saat sisplatin. 2.5 μL Annexin V-FITC ve 5 μL PI-PE Solüsyonu ile boyamadan sonra akış sitometri analizi yapıldı.

CTPG In Vivo'nun Güvenlik Değerlendirmesi ve İmmünostimülatör Aktiviteleri

CTPG'nin in vivo immünostimülatör aktivitelerini değerlendirmek için 6 ila 8 haftalık erkek Kunming fareleri rastgele 7 gruba (5 fare/grup) ayrıldı. Subkutan enjeksiyon (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitoneal enjeksiyon (ip, 200, 400 mg/kg) ve intragastrik uygulama (ig, 200, 400 mg/kg) 2 günde bir toplam 7 kez uygulandı. , kontrol grubuna ise herhangi bir tedavi uygulanmadı. Fareler gün aşırı tartılmış ve farelerin durumu her gün gözlemlenmiştir. CTPG tedavisinden sonra farelerin organları ayrıldı ve tartıldı. Organ indeksleri şu formüle göre hesaplanmıştır: organ indeksi=organ ağırlığı (mg)/vücut ağırlığı (g). Splenositler toplandı, sayıldı ve anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC veya anti-CD4-APC, anti-CD{{ ile boyandı. 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Örnekler akış sitometrisi (BD FACSCalibur) ile tespit edildi.

H22 Tümör Taşıyan Farelerde Sisplatin ile Kombine CTPG'nin Antitümör Etkinliği

Yaklaşık 6 ila 8 haftalık erkek BALB/c farelerine deri altından H22 hücreleri (100 uL PBS içinde fare başına 1.0 x 106) enjekte edildi. Tümör hacimleri yaklaşık 60 mm3'e ulaştığında, tümör taşıyan fareler rastgele 4 gruba (6 fare/grup) ayrıldı ve sisplatin (4mg/kg), CTPG (400mg/kg), sisplatin (4mg/kg) artı CTPG ile tedavi edildi ( 400mg/kg) veya tedavisiz (kontrol grubu). Tümör farelerine sırasıyla 5., 7., 9., 11. ve 13. günlerde CTPG intraperitoneal olarak enjekte edildi. Sisplatin 7. ve 11. günlerde intravenöz olarak enjekte edildi. Tümör hacmi ve vücut ağırlığı gün aşırı ölçüldü. Tümör hacmi şu şekilde hesaplandı: Tümör hacmi (V)=a × b2/2, burada a ve b, vernier kumpas ile ölçülen bir tümörün sırasıyla en uzun ve en kısa çapını temsil eder. 20. günde organlar ve tümörler izole edildi ve tartıldı. Splenositler toplandı, sayıldı ve anti-CD3-APC ve anti-CD19-PE veya anti-CD4-FITC ve anti-CD8-APC veya anti-CD11b-PE ve anti-Gr-1-APC veya anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC ve anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Daha sonra hücrelerin frekansları ve sayıları akış sitometrisi (BD FACSCalibur) ile analiz edildi.

İstatistiksel analiz

Tüm veriler, ortalamanın ortalama±standart hatası (SEM) olarak ifade edildi. İstatistiksel analiz, Prism5.0 yazılımı kullanılarak bir/iki yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak yapıldı. P<.05 was="" considered="" statistically="">

Sonuçlar

CTPG, HCC Hücrelerinin İn Vitro Proliferasyonunu Engelledi

CTPG'nin bileşenleri, Cistanche'den elde edilen feniletanoid glikozitlerin ana bileşenleri olan ekinakozit ve ateozit standartları (Ek Şekil 1A) kullanılarak HPLC ile nitelendi ve nicelendirildi. 18 Pik alıkonma sürelerine ve pik alanlarına göre, CTPG yüzde 28 ekinakozit ve yüzde 9.9 ateozit içeriyordu. Ayrıca, CTPG'deki polisakkarit içeriği, fenol-sülfürik asit yöntemiyle yüzde 34,8 idi.19 MTT tahlili, CTPG'nin BEL-7404 ve HepG2 hücrelerinin canlılığını doza ve zamana bağlı bir şekilde önemli ölçüde azalttığını gösterdi ( Şekil 1A). Tutarlı bir şekilde, BEL-7404 hücrelerinin çoğalması, Ki-67 boyaması ile analiz edilen CTPG tedavisi ile önemli ölçüde inhibe edildi (Şekil 1B). CTPG'nin in vitro splenositlerin proliferasyonu üzerindeki etkisi de MTT tahlili ile analiz edildi. CTPG'nin splenositlerin proliferasyonunu doza bağlı bir şekilde arttırdığını gözlemledik (Şekil 1C).

Mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) sinyal yolu, insan kanser hücrelerinin hayatta kalması, farklılaşması ve ilaç direncinde çok önemli bir rol oynar.20 MAPK sinyal yolunun CTPG'nin proliferasyon üzerindeki inhibitör etkisine dahil olup olmadığını araştırmak için HCC hücrelerinin, MAPK sinyal yolundan çeşitli proteinlerin fosforilasyon seviyeleri, farklı konsantrasyonlarda ve farklı zaman noktalarında CTPG ile muameleden sonra HepG2 hücrelerinde analiz edildi. JNK (P-JNK) ve p38'in (P-p38) fosforilasyonu, CTPG tedavisi ile doza bağlı olarak arttırıldı. ERK'nin fosforilasyonu (P-ERK) 200 ve 400ug/mL CTPG tedavisi ile aşağı regüle edilirken, P-ERK 600ug/mL CTPG tedavisi altında yukarı regüle edildi (Şekil 1D). Ayrıca, P-JNK, P-p38 ve P-ERK seviyeleri zamana bağlı bir şekilde yukarı regüle edildi (Şekil 1D). Bu sonuçlar, CTPG'nin MAPK sinyal yolu yoluyla HCC hücrelerinin çoğalmasını engelleyebileceğini öne sürdü.

S Fazında CTPG Kaynaklı HCC Hücre Döngüsü Tutuklaması

Ayrıca CTPG'nin hücre döngüsü durmasının indüklenmesi yoluyla HCC hücre proliferasyonunu inhibe edip etmediğini de analiz ettik. CTPG ile tedaviden sonra, doza bağlı bir şekilde S-fazında BEL-7404 hücrelerinin birikimi gözlendi. Benzer şekilde, CTPG ayrıca S-fazında HepG2 hücre döngüsü durmasını indükledi ve frekanslar kontrol grubunda yüzde 40.66'dan 600 ug/mL CTPG ile tedavi edilen grupta yüzde 61.90'a yükseldi (Şekil 2A). Siklinler ve sikline bağımlı kinazlar (CDK'ler), hücre bölünmesi kontrolünde ve gelişmesinde önemli roller oynarlar, bunların 21'i G2/M fazı ile ilişkilendirilmiştir.22 Siklin D1'in ekspresyon seviyesi, CTPG tedavisi ile doza bağlı olarak azaltılmıştır, ancak G1'in S fazı ilerlemesi. Siklin B1, CDK1 ve CDK2'nin ekspresyon seviyeleri de azaldı; bu proteinler G2/M fazı ile ilişkilendirilmiştir (Şekil 2B). Bu sonuçlar, CTPG'nin hücre döngüsü durmasını indükleyerek HCC hücre proliferasyonunu baskıladığını gösterdi.

HCC Hücrelerinde CTPG Aktive Mitokondriye Bağlı Apoptoz Yolu

Ayrıca CTPG'nin HCC hücrelerinde apoptozu tetikleyip tetiklemediğini tespit ettik ve CTPG'nin HepG2 ve BEL-7404 hücrelerinde doza bağlı bir şekilde apoptozu indüklediğini bulduk (Şekil 3A). Ek olarak, Bax ve Bcl-2 ekspresyon seviyeleri, sırasıyla doza bağlı bir şekilde CTPG tedavisi ile arttırıldı ve azaldı (Şekil 3B). HepG2 hücrelerinin apoptozu ayrıca 24 saat CTPG ile muameleden sonra Hoechst 33342 boyaması ile belirlendi. Nükleer morfoloji, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu ile gözlemlendi. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, kontrol HepG2 hücreleri homojen olarak boyanırken, CTPG ile tedavi edilen HepG2 hücreleri, sisplatin ile tedavi edilen HepG2 hücrelerine benzer şekilde, doza bağlı bir şekilde kromatin yoğunlaşması ve parçalanması gösterdi. Bu sonuçlar, CTPG'nin HCC hücrelerinin apoptozunu indüklediğini gösterdi.

Dış mitokondriyal zarın bütünlüğü, Bcl-2 ailesi tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir ve Δψm'nin azalması, apoptozu indüklemek için kaspaz kaskadı aktive eden sitokrom c'nin salınımını destekler.23,24 Δψm azaldığında, JC{{ 3}} polimer (kırmızı floresan) monomerlere ayrışır (yeşil floresan).25 Bu nedenle, HCC hücrelerinin Δψm'si, 24 saatlik CTPG işleminden sonra JC-1 boyaması ile saptandı. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, FL-1 kanalının yeşil floresan yoğunluğu CTPG tedavisi ile doza bağlı olarak artarken, FL-2 kanalının kırmızı floresan yoğunluğu her ikisinde de doza bağlı olarak azaldı. BEL-7404 ve HepG2 hücreleri. Ters floresan mikroskobu gözlemi, CTPG'nin HCC hücrelerinin Δψm'sini azalttığını gösteren benzer bir sonuç sergiledi (Şekil 4B). Daha sonra, CTPG işleminden sonra hem BEL{15}} hem de HepG2 hücrelerinde sitokrom c seviyelerinin arttığını gözlemledik (Şekil 4C), bu da CTPG ile tedavi edilen HCC hücrelerinde Δψm azalmasını doğruladı.

Sitokrom c'nin salınması, apoptozu indüklemek için başlatıcı kaspaz-9'ı aktive edebilir.26 Western blot testinin sonuçları, bölünmüş kaspaz-3, -7 ve{{4} seviyelerinin olduğunu gösterdi. } bölünmüş kaspaz -8 seviyesi değişmeden artırıldı (Şekil 5). Aktive edilmiş kaspaz-3, DNA onarımını önlemek ve DNA hasarını biriktirmek için poli (ADP-riboz) polimerazın (PARP) DNA onarım enzimini parçalayabilir.27 Ayrıca bölünmüş PARP'ın yukarı regüle edilmiş seviyelerini gözlemledik. CTPG tarafından indüklenen HCC hücre apoptozunda kaspaz kaskadının rolü ayrıca sırasıyla kaspaz inhibitörü (Z-VAD-FMK) ve kaspaz-3 inhibitörü (Ac-DEVD-CHO) kullanılarak belirlendi. Z-VAD-FMK, CTPG tarafından indüklenen BEL-7404 ve HepG2 hücrelerinin apoptozunu önemli ölçüde tersine çevirdi (Ek Şekil 1B). Benzer şekilde, Ac-DEVD-CHO, CTPG tarafından indüklenen HepG2 hücrelerinin apoptozunu da önemli ölçüde tersine çevirdi (Ek Şekil 1C). Sonuçlar, CTPG'nin, mitokondriyal bağımlı bir yol ile HCC hücrelerinin apoptozunu indüklediğini gösterdi.

CTPG Bastırılmış HCC Hücre Göçü İn Vitro

Kanser hücresi göçü, tümör metastazındaki kritik süreçlerden biri olarak kabul edilir. CTPG'nin HCC hücre göçünü etkileyip etkilemediğini belirlemek için HepG2 hücre hareketliliği, yara iyileştirme deneyi ile değerlendirildi. Şekil 6A ve B'de gösterildiği gibi, HepG2 hücre göçü, doza bağlı bir şekilde CTPG tedavisi ile önemli ölçüde inhibe edildi. MMP ailesi ve VEGF, tümör hücrelerinin göçünde kritik roller oynamaktadır.28 24 saat CTPG tedavisinden sonra, MMP-2 ve VEGF seviyeleri önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 6C), bu da CTPG'nin istila ve metastazı baskılayabileceğini düşündürür. HCC'nin.

CTPG Farelerin Bağışıklığını Güçlendirdi

Cistanche Deserticola polisakkaritlerinin, lenfosit proliferasyonunu teşvik etme ve makrofajları aktive etme dahil olmak üzere immünomodülatör işlevleri olduğu bildirilmiştir.29 T hücreleri ve B hücreleri, sırasıyla hücresel ve hümoral immün yanıtlara aracılık eden ana lenfositlerdir. CTPG, yüzde 34,8 polisakarit içeriği içeriyordu. Bu nedenle, CTPG'nin T hücrelerinin ve B hücrelerinin çoğalması üzerindeki etkilerini inceledik. Ek Şekil 2A'da gösterildiği gibi, CTPG, sisplatin varlığında bile, T hücrelerinin ve B hücrelerinin çoğalmasını doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde arttırdı. İlginç bir şekilde, CTPG, sisplatin tarafından indüklenen splenositlerin apoptozunu önemli ölçüde inhibe etti (Ek Şekil 2B), CTPG'nin sisplatinin farelerin bağışıklık sistemi üzerindeki yan etkilerini iyileştirebileceğini gösterir.

Ⅱ bölümü için okumaya devam edin...