BÖLÜM Ⅱ: Cistanche Tubulosa Ekstraktlarının Streptozotosin-Nikotinamid ile İndüklenen Diyabetik Sıçanlarda Erkek Üreme Fonksiyonu Üzerindeki Etkisi
Mar 04, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-Ling Kong® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He ve Shu-Chun Cheng
Gıda Bilimi Bölümü, Ulusal Tayvan Okyanus Üniversitesi, Pei-Ning Yolu, Keelung 20224, Tayvan; athirajohnson07@gmail.com (AJ); makeadrea@hotmail.com (F.-CK); k46255@gmail.com (J.-LH); riceroll826@gmail.com (S.-CC)
* Yazışma: kongzl@mail.ntou.edu.tw; Tel.: artı 886-2-2462-2192; Faks: artı 886-2-2463-4203
Soyut:Diyabet, insülin düzeylerinin azalması veya dokuların insülini etkili bir şekilde kullanamaması nedeniyle hiperglisemi ile karakterize kronik bir hastalıktır. İnfertilite diyabetin önemli bir sonucu olarak bilinir ve sperm bozukluğuna ve gonadal disfonksiyona neden olarak erkek üreme sistemini etkiler. Cistanche tubulosa, hafızayı, bağışıklığı ve cinsel yeteneği geliştirme, iktidarsızlığı azaltma ve kabızlığı en aza indirme kapasitesine sahip parazitik bir bitkidir. Bu çalışma, Cistanche tubulosa özündeki (CTE) ekinakozitin (ECH) diyabetik sıçanların erkek üreme sistemi üzerindeki anti-inflamatuar ve koruyucu etkilerinin araştırılmasına odaklanmıştır. CTE'nin antioksidan, antienflamatuar ve koruyucu etkileri hem in vitro hem de in vivo yöntemlerle değerlendirildi. İn vitro sonuçlar, ECH'nin reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini inhibe ettiğini ve StAR, CYP11A1, CYP17A1 ve HSD17p3 protein ekspresyonunu iyileştirdiğini göstermektedir. İn vivo analiz, CTE'de üç doz ekinakozit (ECH) (80, 160 ve 320 mg/kg) ile gerçekleştirilmiştir. Toplamda 0,571 mg/kg rosiglitazon (RSG) pozitif kontrol olarak uygulandı. Diyabet, yüksek yağlı bir diyetle (yüzde 45) kombinasyon halinde streptozotosin (STZ) (65 mg/kg) ve nikotinamid (230 mg/kg) tarafından indüklenmiştir. İn vivo çalışmalar, ECH'nin kan şekeri seviyelerini, insülin direncini, leptin direncini ve lipid peroksidasyonunu iyileştirdiğini doğruladı. Hipotalamusta kisspeptin 1 (KiSS1), G protein-bağlı reseptör GPR 54, sitokin sinyalleme 3'ün baskılayıcısı (SOCS-3) ve sirtuin 1 (SIRT1) haberci ribonükleik asit (mRNA) ekspresyonunu geri yükleyebilir ve cinsiyeti kurtarabilir hormon seviyesi. Bu nedenle, bu çalışma CTE'nin antioksidan, antiinflamatuar ve steroidogenez etkilerini doğruladı.
Anahtar Kelimeler:diyabet; kısırlık; Cistanche tubulosa özütü (CTE); ekinakozit (ECH); anti-inflamatuar aktivite; antioksidan aktivite; steroidogenez etkileri
Ekinakozitin (ECH) koruyucu etkileriCistanche tübüloza
3. Sonuçlar
3.1.In Vitro Analiz
3.1.1.ECH, CTE ve RES'in Antioksidan Aktivitelerinin Karşılaştırılması
Uzun süreli yüksek oksidatif stres ve kronik inflamasyon, diyabetik komplikasyonların ana nedenleridir [16]. CTE'ler, antioksidan aktivite potansiyeli olan ekinakozit (ECH) ve akteosit gibi çeşitli feniletanoid glikozitleri içerir [17]. ECH'nin antioksidan aktivitesini değerlendirmek için DPPH radikal süpürme deneyi yapıldı. Trolox ve resveratrol (3,5,4'-trihidroksistilben, RES) sırasıyla standart ve pozitif kontrol olarak alındı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, ECH daha iyi radikal süpürme aktivitesi gösterdi ve aktivite pozitif kontrolden (RES) önemli ölçüde daha yüksekti.
3.1.2.LC-540 ve TM3 Leydig Hücrelerinde ECH'nin Hücre Canlılığı
Farklı ECH konsantrasyonlarının hücre canlılığını değerlendirmek için MTT tahlili yapıldı. LC-540 Leydig hücreleri ve TM3 Leydig hücreleri, ECH ile tedavi edildikten sonra yüzde 80'den fazla canlılık gösterdi (Şekil 2). Diğer konsantrasyonlarla karşılaştırıldığında, ECtf'nin 100-|dM konsantrasyonu (yüzde 2 FBS'de 100 rM'lik seyreltmeler) ffM3 Leydig hücrelerinde daha iyi hücre canlılığı gösterdi. Sonuç, artan ECH konsantrasyonunun, hücreler için herhangi bir önemli toksisiteye katkıda bulunmadığını gösterdi.
3.1.3.LC-540 ve TM3 Leyd ig Hücrelerinde NBT Testi ile YAŞ-İndüklenmiş Süperoksit Üretimi Üzerinde ECH'nin Etkisi
AGE'ler, glikozun oksidasyonu ve O2-, hidroksil radikalleri ve karbonil grupları gibi serbest radikallerin oluşumu nedeniyle vücutta oksidatif hasara neden olur [18]. 50 Rg/mL AGE ile uyarıldıktan sonra, LC-540 (Şekil 3a) ve TM3 (Şekil 3b) hücreleri ECH ve RES (her biri 5 /M ve 10 çay kaşığı) ile işlendi. Sonuçlar, kontrol grubunda (uyarılmış AGO'lar) süperoksit anyon üretiminin arttığını, ancak ECH ve RES ile tedaviden sonra süperoksit anyon üretiminin azaldığını gösterdi. Şekil 3'ten ii, ECH ve RES'nin süperoksit üretim seviyesini azalttığı ve hücreleri oksidatif hasardan koruduğu anlaşılmıştır. LC-540 hücreleri durumunda, 10 ECH normal grupla hemen hemen benzer aktivite gösterdi. Her iki hücrede de süperoksit üretimi, hem ECH hem de RES konsantrasyonundaki artışla azaldı.
3.1.4. AGE-Stimüle Edilmiş LC-540 Leydig Hücrelerinde ECH'nin H2O2 Üretimi Üzerindeki Etkisi
Oksidatif türlerin varlığını tespit etmek için DCFH-DA testi yapıldı. Floresan boya DCFH-DA hücrelere girdikten sonra hücre içi H2O2 tarafından oksitlenir ve diklorofloresein (DCF) oluşturur. Şekil 4'te gösterildiği gibi, AGE ile uyarılan grupta (kontrol) hücre içi H2O2 üretiminde önemli bir artış olurken, 10 ECH ve RES eklenmesi hücrelerde H2O2 üretimini önemli ölçüde azalttı. 10 ECH'nin uygulanması, kontrol grubundan önemli ölçüde daha düşük olan H2O2 üretiminin yalnızca yaklaşık yüzde 47.1'i ile sonuçlandı.
3.1.5. ECH'nin AGE ile Uyarılmış LC-540 Leydig Hücrelerinde RAGE ve NF-kB Protein Ekspresyon Düzeyleri Üzerindeki Etkisi
LC-540 Leydig hücrelerinde RAGE varlığını doğrulamak için Western blot analizi yapıldı. ECH'nin AGE'ler ile uyarılan Leydig hücrelerinde RAGE (Şekil 5a) ve NF-kB (Şekil 5b) protein ekspresyon seviyeleri üzerindeki etkisi Şekil 5'te gösterilmiştir. Sonuçlar, 50 /mL AGE konsantrasyonunun daha yüksek RAGE ve NF-kB indüklediğini göstermiştir. LC-540 Leydig hücrelerinde ekspresyon ve 10 konsantrasyonda ECH ve RES, RAGE ve NF-kB ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmıştır. NF-kB'nin ekspresyonu, RES ve ECH'de RAGE antagonistlerinden önemli ölçüde daha düşüktü. Dolayısıyla sonuçlar, ECH'nin RAGE ve NF-kB seviyesini azaltarak inflamasyon seviyesini azalttığını doğruladı.
3.1.6. ECH'nin AGE-Stimulated LC-540 Leydig hücrelerinde Testosteron Sentezi yolu üzerindeki etkisi.
Spermatogenez ve erkek kısırlığı süreci, testosteronun varlığına bağlıdır. Şekil 6'da gösterildiği gibi, AGE ile uyarılan LC-540 Leydig hücrelerinde StAR (Şekil 6a), CYP11A1 (Şekil 6b), CYP17A1 (Şekil 6c) ve HSD17p3 (Şekil 6d) proteinlerinin ekspresyonları önemli ölçüde azalmıştır ( kontrol grubu). RAGE antagonisti, RES ve ECH eklendiğinde, StAR, CYP11A1, CYP17A1 ve HSD17p3 proteinlerinin ifadeleri önemli ölçüde arttı. StAR ve CYP11A1 proteinlerinin artan ekspresyonu, hem ECH hem de RES ile tedavi edilen gruplarda görüldü. CYP17A1'in ekspresyon seviyesi, RES ve ECH gruplarında hemen hemen benzerdi. ECH ile muamele edilmiş Leydig hücrelerinde HSD17&3 proteininin ifadeleri, RES ve RAGE antagonisti ile muamele edilmiş hücrelerinkinden çok daha yüksekti. StAR, CYP11A1, CYP17A1 ve HSD17p3 proteinlerinin artan ekspresyonu, normal testosteron üretimini gösterdi.
3.2.In Vivo Analizi
3.2.1. CTE'nin Vücut Ağırlığı ve Kalori Alımı Üzerindeki Etkileri
6 haftalık deneyden sonra, diyabetik grup (HFD-DM), kontrol grubundan daha yüksek vücut ağırlığı gösterdi. HFD-DME4 grubu, HFD-DM ve HFD-DMER gruplarına göre daha düşük vücut ağırlığı gösterdi (Şekil 7a). Kontrol grubunun kalori alımı diğer gruplara göre anlamlı derecede düşüktü. Diğer beş grubun kalori alımları arasında anlamlı bir fark yoktu (Şekil 7b).
3.2.2.Başarıyı Belirlemek İçin Oral Glikoz Tolerans Testi (OGTT) 1 Diyabet İndükleyicisi
Oral glukoz tolerans testi (OGTT), diyabetik Mellitus'u saptamak için umut verici bir araç olarak kullanılmaktadır. Kandaki artan glikoz seviyesi, diyabetik bir durumu gösterir. Şekil 8a'da gösterildiği gibi, CTE gruplarında plazma glukoz seviyesi 0, 30, 90 ve 120. dakikalarda DM grubuna göre daha düşüktü. Ayrıca, plazma glukoz konsantrasyonunun eğri altında kalan alanı (AUC), CTE ve RSG gruplarında olduğunu göstermiştir.3.2.3.Toplam Plazma Glikoz, Kolesterol ve Trigliserit İçeriği
Plazma açlık kan şekeri düzeyi diğerlerine göre DM grubunda daha yüksek, DME2 grubunda (kontrol hariç) daha düşüktü. DME4 grubu dışındaki gruplar arasında toplam kolesterol açısından anlamlı bir fark yoktu. DME4 grubunda kolesterol düzeyi diğerlerine göre daha düşüktü. Trigliserit düzeyi DM grubunda daha yüksek, DME4 grubunda daha düşüktü ve CTE konsantrasyonunun artmasıyla trigliserit içeriği azaldı (Tablo 2). Sonuçlar, DM grubunda plazma glukoz, kolesterol ve trigliserit düzeylerinin daha yüksek olduğunu ve CTE ile tedavide düzeyin önemli ölçüde azaldığını göstermektedir.
3.2.4.Plazma İnsülin Düzeyleri, Plazma Leptin Düzeyi ve Homeostasis Modeli Değerlendirme-İnsülin Direnci (HOMA-IR) Değerleri
Plazma insülin, leptin seviyeleri ve HOMA-IR değerleri Tablo 3'te gösterilmiştir. DM grubu, kontrol grubuna göre daha yüksek plazma insülin ve plazma leptin seviyelerine sahipti. HOMA-IR indeksi de DM grubunda anlamlı olarak daha yüksekti. Plazma insülin, leptin ve HOMA-IR değerleri CTE konsantrasyonundaki artışla azaldı. Plazma leptini, CTE gruplarında önemli ölçüde azaldı, ancak RSG ilaç grubu (DMR), DM grubundan anlamlı bir fark göstermedi.
3.2.5. Diyabetik Sıçanlarda CTE'nin Plazma LH ve Testosteron Düzeylerine Etkisi
Tablo 4'te gösterildiği gibi, diyabetik sıçanlarda (DM) testosteron konsantrasyonları önemli ölçüde azalırken, çeşitli CTE dozlarında testosteron konsantrasyonları önemli ölçüde arttı. Ayrıca sonuçlar, DMR, DME1, DME2 ve DME4'e kıyasla DM grubundaki LH seviyesinde hafif bir düşüş gösterdi. LH üretimi DME4 grubunda daha yüksekti.
3.2.6.CTE'nin Diyabetik Sıçanların Sperm Parametreleri Üzerine Etkisi
Deneysel sonuçlar, DM grubunda kontrol grubuna göre sperm sayısı ve motilitesinde anlamlı bir azalma olduğunu, buna karşın DM grubunda sperm anormallik oranının önemli ölçüde arttığını gösterdi. İlginç bir şekilde, DMR grubunun sperm sayısı, sperm hareketliliği ve sperm anormallik oranı düzeldi ancak sperm hareketliliği DME4'e kıyasla önemli bir seviyeye ulaşmadı. DME2, hepsinden daha iyi sperm sayısı gösterdi ve DME4 grubunda hareketlilik oranı önemli ölçüde arttı. RSG ve CTE ile tedavi edilen gruplar arasında anormal sperm sayıları arasında anlamlı bir fark yoktu (Tablo 5).
3.2.7.CTE'nin Diyabetik Sıçanlarda Seminifer Tübüllerin Morfolosu Üzerindeki Etkisi
Şekil 9, testis bölümünün H&E boyamasını göstermektedir. Siyah ok Leydig hücresini ve beyaz ok Sertoli hücresini gösterir. DM grubunda hem Leydig hücresi hem de Sertoli hücresi belirgin atrofi gösterdi ve lümende bir boşluk görüldü. Leydig hücrelerinin ve Sertoli'nin yapısı, CTE ve RSG ile tedavi edilen gruplarda restore edildi. Seminifer tübüllerin inceliği CTE ve RSG gruplarında DM grubuna göre daha yüksekti.
3.2.8. Diyabetik Sıçanların Hipotalamusunda CTE'nin KiSS1, GPR54, SOCS-3 ve SIRT1 mRNA'larına Etkisi
KiSS1 (Şekil 10a), GPR54 (Şekil 10b), SOCS-3 (Şekil 10d) ve SIRT1 (Şekil 10c) ifadesi Şekil 10'da gösterilmiştir. Diyabetik sıçanlarda KiSS1 ve reseptör GPR54'ün mRNA ifadesi kontrol grubuna göre anlamlı olarak daha düşüktür. DMR, DME1, DME2 ve DME4'te KiSS1 ve GPR 54 mRNA ekspresyon seviyesi önemli ölçüde arttı. Özellikle, GPR54 mRNA ifadesi, DME4'te önemli ölçüde arttı ve neredeyse kontrol grubuna benzerdi.
Bu deney, farelerin hipotalamusundaki SOCS-3 ve SIRT1 mRNA'larının miktarını daha da araştırdı. Diyabetik sıçanlarda SOCS-3 mRNA ekspresyonu, leptin empedansının daha ciddi olduğunu gösterecek şekilde önemli ölçüde arttı. DMR, DME1, DME2 ve DME4 grupları, diyabetik gruba kıyasla önemli gelişmeler gösterdi. DM grubundaki SIRT1 mRNA ifadesi azaldı
3.2.9.CTE'nin Diyabetik Sıçanların Plazma ve Testislerindeki Antioksidan Enzimler Üzerine Etkisi
Tablo 6 diyabetik sıçanların plazma SOD aktivitesinin, GPx aktivitesinin ve katalaz aktivitesinin önemli ölçüde azaldığını ve aktivitelerin CTE ve RSG ile tedavi edilen gruplarda arttığını göstermektedir. Buna ek olarak, DM E4, GPx aktivitesinde diğerlerine göre önemli gelişmeler gösterdi. Sonuçlar diyabetik sıçanlarda SOD ve katalaz aktivitelerinin altı hafta sonra önemli ölçüde azaldığını gösterdi. DMR grubunun SOD ve katalaz aktivitesi önemli bir düzeye ulaşmaz. CTE ile tedavi edilen gruplar, SOD ve katalaz aktivitesinde önemli gelişmeler gösterdi. KTE gruplarında artan katalaz ve SOD aktiviteleri testislerde de görüldü (Tablo 7). En yüksek SOD ve katalaz aktivitesi sırasıyla DME1 grubu ve DME2 gruplarında gözlendi.
3.2.10.KTE'nin Diyabetik Sıçanların Plazma ve Testislerindeki Oksidatif Stres ve Enflamasyon Üzerine Etkileri
Plazmada (Şekil 11a) ve testiste (Şekil lib) nitrik oksit (NO) üretimi Şekil'de gösterilmiştir. DM grubunda NO üretimi, kontrol grubuna kıyasla hem testis hem de plazmada önemli ölçüde artmıştır. DME1, DME2 ve DME4 gruplarında (plazmada) NO üretiminde kademeli bir azalma gözlendi. DMR grubu da NO üretiminde önemli bir azalma gösterdi. Testis durumunda, CTE gruplarında NO üretiminde hafif bir azalma gözlenirken, DMR grubu NO üretimini önemli ölçüde azaltmaz.
Şekil 12 ve 13'te gösterildiği gibi, diyabetik sıçanlarda (hem plazmada hem de testiste) TNF-a ve IL-6 düzeyi önemli ölçüde arttı, bu da iltihabın daha ciddi olduğunu gösterir. Plazmada, TNF-a seviyesi, CTE ve RSG ile tedavi edilen gruplarda benzerdir (Şekil 12a). CTE grupları (özellikle DME2), testisteki TNF-a seviyesini önemli ölçüde azalttı (Şekil 12b). IL-6 düzeyi, CTE ve RSG gruplarının plazmasında önemli ölçüde azaldı (Şekil 13a). Testiste IL-6 düzeyinde azalma eğilimi vardı ancak bu anlamlı bir düzeye ulaşmadı (Şekil 13b).
3.2.11.Yüksek Yağlı Diyetle İndüklenen Diyabetik Sıçanların Spermatozoalarında CTE'nin Oksidatif Stres ve Enflamasyon Üzerine Etkileri
Şekil 14, sıçan spermindeki süperoksit anyon içeriğini gösterir. Sonuçlar, diyabetik sıçanların spermindeki süperoksit anyon üretiminin önemli ölçüde arttığını ve DMR grubunda önemli bir gelişme olmadığını gösterdi. DME1 ve DME4 grupları, süperoksit anyonu üretiminin önemli ölçüde azaldığını gösterdi.
3.2.12. Yüksek Yağlı Diyetle İndüklenen Diyabetik Sıçanların Spermatozoalarında CTE'nin Lipid Peroksidasyonu Üzerine Etkileri
Çalışmalar, hem tip 1 hem de tip 2 diyabet hastalarında lipid peroksidasyonunun arttığını göstermiştir [19]. Plazma, sperm ve testisteki malondialdehit (MDA) düzeyi Tablo 8'de gösterildi. DM grubunun plazma, testis ve spermindeki MDA düzeyi anlamlı olarak daha yüksekti ve CTE ve RSG ile tedavi MDA üretimini azalttı. Plazmada DME4 ve DMEI gruplarında önemli bir azalma gözlendi. Bu çalışma, diyabetik sıçanların sadece plazmadaki lipid peroksidasyon derecesini değil, aynı zamanda testis ve spermde de arttığını buldu.
Cistanche tubulosa özütünün etkileri: Anti-oksidatif Stres ve Enflamasyon
4. Tartışma
Diyabet, kandaki yüksek şeker seviyesi ile ilişkili kronik bir hastalıktır. Antioksidan ve ROS seviyeleri arasındaki dengesizlik, oksidatif stres adı verilen duruma yol açacaktır. Süperoksit, hidroksil radikali, hidrojen peroksit, nitrik oksit ve singlet oksijen, oksidatif stres yoluyla diyabet durumuna katkıda bulunacak ROS örneklerinden bazılarıdır [20]. Cittanche tubulosa polisakkaritler, oligosakkaritler, feniletanoid glikozitler (ekinakozit, verbaskosit), palmitik asit, linoleik asit, iridoidler, alditoller ve lignanlar gibi aktif bileşenler içeren bir çöl bitkisidir. Bu bitki, anti-inflamatuar, nöroprotektif, antibakteriyel, antiviral, anti-oksidatif, anti-tümör ve immünomodülatör etkiler üretme yeteneğine sahiptir [21]. Literatür çalışmaları, Cistanche tubulosa'dan elde edilen feniletanoid glikozitlerin antioksidan aktivitenin başlıca nedeni olduğunu göstermektedir [22]. Resveratrol (RES) ve rosiglitazon (RSG), sırasıyla in vitro ve in vivo çalışmalar için pozitif kontrol olarak alınmıştır. RSG, güçlü bir insülin sensitizörüdür ve peroksizom proliferatörü ile aktive olan reseptörün (PPARc) izoformuna karşı bir afiniteye sahiptir. Diyabetik hastalarda hiperglisemiyi kontrol eder [23]. RES, doğal antioksidan aktiviteye sahiptir, bir vazodilatör görevi görür, lipoprotein metabolizmasını düzenler, trombosit agregasyonunu inhibe eder ve kanseri önler [24,25]. Araştırmamız, ECH'nin CTE ve RES'den daha iyi radikal temizleme aktivitesi gösterdiğini gösterdi (Şekil 1). ECH'nin LC-540 ve TM3 Leydig hücrelerinde önemli bir toksisiteye neden olmadığı da anlaşılmıştır (Şekil 2).
AGE'ler, Leydig hücrelerinde stres koşullarını indüklemek için kullanıldı. AGE'lerin üretimi, inflamasyon, oksidatif stres ve diyabet birbiriyle bağlantılıdır. Diyabetin hiperglisemik durumu, AGE'lerin üretimi ve oksidatif stres yoluyla hücre hasarını teşvik eder. AGE'ler, bağışıklık hücresi alımını ve hücre ölümünü daha da destekleyen p hücresi toksisitesini indükler. Yüksek bir AGE seviyesi, RAGE ve AGER1 olarak adlandırılan iki tip reseptörün ekspresyonunu destekler [26]. Oksidatif stres sırasında mitokondriyal solunum zincirinden bir elektronun damlaması ve ardından moleküler oksijene aktarılması, bir süperoksit anyonu oluşumu ile sonuçlanır. Sonuçlarımız, AGE'ler tarafından indüklenen süperoksit anyon üretiminin kontrol grubunda arttığını ve hem ECH hem de RES tedavilerinde daha fazla gelişme gözlemlendiğini göstermektedir. Çalışmamıza göre AGE'lerin neden olduğu süperoksit (Şekil 3) ve H2O2 (Şekil 4) üretiminin ECH ve RES varlığında azaldığı anlaşılmıştır.
NF-kB, diyabetle ilişkili inflamasyonun önemli aracısı olarak bilinir [27]. NF-kB'nin ekspresyonu, p hücre işlev bozukluğuna ve hücre ölümüne yol açar. NF-KB'nin oksidatif stres tarafından aktivasyonu, proinflamatuar yanıtı, endotelinin upregülasyonunu ve apoptozu uyarır [28]. AGE ile uyarılan gruplarda RAGE ve NF-kB ekspresyonu arttı ve ardından ECH ve RES ile tedavi edilen hücrelerde azalma gözlendi (Şekil 5).
Testosteron, kolesterolden sentezlenen bir anabolik steroid ve birincil erkek seks hormonudur. İşlem, kolesterol yan zincir bölünme geni (CYP11A) tarafından kolesterolün yan zincirinin oksidatif bölünmesiyle başlar. Bu gen mitokondriyal zarda lokalizedir ve kolesterolü pregnenolon'a dönüştürür. Daha sonra, endoplazmik retikulumdan gelen CYP17A1 geni fazladan iki karbon atomunu uzaklaştırır ve çoklu C19 steroidleri üretir. Buna ek olarak, pregnenolon hidroksisteroid dehidrojenaz (3-p-HSD) tarafından androstenedion/progesteron oluşturmak üzere oksitlenir. Son olarak testosteron, androstenedionun 17. karbon pozisyonundaki keto grubunun 17-beta-hidroksisteroid dehidrojenaz (17-p-HSD) tarafından indirgenmesiyle üretilir. Leydig hücreleri, testosteronun ana üretiminde yer alır. Kolesterolün iç mitokondriyal membrana transferi, steroidojenik akut düzenleyici proteinin (StAR) etkisini gerektirir. Mevcut çalışmalar, AGE ile tedavi edilen hücrelerde (kontrol) StAR, CYP11A1, CYP17A1 ve HSD17p3 ekspresyonunun azaldığını ve ECH ve RES ile tedavi edilen hücrelerde muazzam bir artış olduğunu göstermektedir (Şekil 6). Bu nedenle sonuçlar, ECH ve RES ile tedavi edilen gruplarda testosteron üretiminin arttığını göstermektedir.
Diyabetik bir durumda, glikozun organlara taşınması sınırlıdır ve sonuç olarak glikoz seviyeleri artar [29]. Bu nedenle, hiperglisemik durum, diyabetik tespit için önemli belirteçlerden biridir. Çalışmalarımız diyabetik gruplarda plazma glukoz düzeyinin arttığını ve DM grubunun EAA'sının diğer gruplara göre anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermektedir (Şekil 8). Plazma glukozu ile birlikte toplam kolesterol ve trigliserit içeriği DM grubunda önemli ölçüde arttı (Tablo 2). Artan kolesterol ve trigliserit düzeyi aterosklerozu kolaylaştırır [30]. Bununla birlikte, CTE ve RSG ile tedavi edilen gruplarda kolesterol ve trigliserit seviyesi düşmüştür. DME4 grubunun trigliserit içeriği, kontrol grubuna neredeyse benzer bir değere ulaştı.
İnsülin, pankreasın p hücreleri tarafından üretilen ve vücuttaki kan şekeri seviyesini kontrol etmek için işlevselleştirilmiş bir hormondur, leptin ise adipositler tarafından üretilen ve gıda alımını ve enerji kullanımını düzenleyebilen bir hormondur. Çalışmalar, leptinin obezitenin patofizyolojisinde yer aldığını ve leptin ile insülin arasında pozitif bir etkileşim olduğunu göstermiştir [31]. Çalışmalarımız DM grubunda plazma inülin ve leptin düzeylerinin daha yüksek olduğunu ve CTE konsantrasyonunun artmasıyla insülin düzeyinin düştüğünü göstermektedir. RSG grubu, DM grubundan anlamlı bir farklılık göstermemektedir. İnsülin direnci ve p hücre fonksiyonu şu şekilde değerlendirildi:
HOMA-IR yöntemi. HOMA-IR değeri DM grubunda arttı ve diğer gruplardan anlamlı olarak farklıydı (Tablo 3).
DM, HPG eksenindeki hormonal değişim yoluyla üreme fonksiyonunu etkiler ve yapılan çalışmalar, testisteki insülin ekspresyonunun diyabetten de etkilendiğini ortaya koymuştur. Sertoli hücre vakuolizasyonu, artan DNA fragmantasyonu, bozulmuş spermatogenez ve artan germ hücre tükenmesi ile karakterizedir. Oksidatif stres ayrıca üreme fonksiyonundaki anormalliklere de katkıda bulunur [32]. Erkek üreme organında (testislerde) sperm oluşum sürecine spermatogenez denir. Testis, seminifer tübüller adı verilen sıkıca sarılmış tübüllerden oluşur. Sertoli hücreleri seminifer tübül duvarlarında görülür ve olgunlaşmamış spermin beslenmesini sağlar. Sperm parametrelerinin incelenmesi DM grubunda sperm sayısı ve motilitesinin azaldığını ve anormalliklerin arttığını gösterdi (Tablo 5). CTE ve RSG ile tedavi edilen gruplarda ters bir etki gözlendi. DM grubunda hem Leydig hücresi hem de Sertoli hücreleri belirgin atrofi gösterdi ve lümende kavite görüldü. DM grubunda seminifer tübül kalınlığı da azaldı. CTE ve RSG ile tedavi edilen gruplarda iyileştirilmiş bir sonuç gözlendi (Şekil 9). Buna ek olarak, DM grubunda LH ve testosteron seviyesi düşerken, CTE ile tedavi edilen gruplarda seviyeleri arttı (Tablo 4). Erkeklerde, düşük serum testosteronu ve düşük LH nabız frekansı, sıklıkla obezite ve tip 2 diabetes mellitus ile ilişkilendirilmiştir [33].
KiSS1 geni tarafından kodlanan Kisspeptinler, HPG ekseninin güçlü uyarıcısı olarak bilinir ve kisspeptin genindeki herhangi bir mutasyon, düşük seviyelerde seks steroidleri ve gonadotropine yol açacaktır. Çalışmalar, STZ ile indüklenen diyabetik sıçanlarda Kiss1 mRNA seviyelerinin azaldığını göstermektedir [33]. Memeli kısırlığının başlatılması ve sürdürülmesi, G-protein kenetli reseptör 54 (GPR54) ile bağlantılıdır. GPR 54'teki mutasyon, cinsel olgunlaşmanın olmaması ve düşük seviyelerde gonadotropik hormonlar (LH ve FSH) ile karakterize edilir. IL-6 ve TNF-a gibi proinflamatuar sitokinler, karaciğer ve adipositlerde inflamasyon aracılı insülin direncinde rol oynayan sitokin sinyalleme 3'ün (SOCS3) baskılayıcısının ekspresyonunu yukarı doğru düzenler [34]. SIRT 1, çeşitli yaşlanma hastalıklarının düzenlenmesi ile ilişkili bir gendir. Bu gen, pankreasın p hücrelerinde belirgin bir şekilde eksprese edilir ve insülin sekresyonunu düzenler ve apoptozu önler. Mevcut çalışmalar, KiSS1, GPR54 ve SIRT1 ekspresyonunun DM grubunda azaldığını, ancak ekspresyonun CTE ile tedavi edilen gruplarda arttığını göstermiştir (Şekil 10). DM grubundaki SOCS-3 ifadelerindeki artış, inflamatuar durumu gösterdi. Obezite ve inflamasyon arasında tanımlanan ilk moleküler bağlantı TNF-a idi. Bu nedenle, artan bir TNF-a seviyesi, iltihaplanmanın bir göstergesidir. CTE ile tedavi edilen gruplarda TNF-a ve IL-6 gibi proinflamatuar sitokinlerin seviyesinde azalma görüldü (Şekil 12 ve 13).
ROS ve antioksidanlar arasındaki dengesizlik diyabetik duruma yol açar. Süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GPX), optimum ROS seviyesinin korunmasından sorumlu birincil antioksidanlar olarak bilinir [35]. Sonuçlardan, antioksidanların aktivitesinin DM grubunda önemli ölçüde düşük olduğu bulundu. CT ile tedavi edilen gruplar, antioksidanların üretiminde gelişmeler gösterdi. RSG ile tedavi edilen grup, antioksidan aktivitede önemli bir gelişme göstermedi (Tablo 6 ve 7).
Nitrik oksit (NO), iltihaplanmaya katkıda bulunan önemli bir ROS olarak bilinir. Çalışmalarımız, CTE ile tedavi edilen gruplarda NO seviyesinin düştüğüne işaret etmektedir (Şekil 11). Sonuçlar, diyabetik sıçanların spermindeki süperoksit anyon içeriğinin önemli ölçüde arttığını ve RSG uygulamasından sonra önemli bir gelişme olmadığını gösterdi. CTE gruplarında süperoksit üretimi azaldı.
MDA'nın belirlenmesi, lipid peroksidasyonunu değerlendirmek için çok yararlıdır. Lipid peroksidasyonu, lipidlerde oksidasyon sürecidir ve sonunda hücre hasarı ile sonuçlanır. MDA, çoklu doymamış yağ asitlerinin lipid peroksidasyonu sonucu üretilir. Çalışmalar, MDA seviyesinin yaş ve açlık kan şekeri seviyesi ile korele olduğunu göstermektedir [36]. Mevcut çalışma, CTE'nin plazma, testis ve spermde lipid peroksidasyonunu iyileştirdiğini göstermiştir (Tablo 8).
Cistanche tubulosa özü
5. Sonuçlar
Diyabetik durumlar sırasındaki oksidatif stres, sperm bozukluğu ve gonadal disfonksiyon yoluyla erkek üreme sistemini bozar. Cistanche tubulosa, farmakolojik etkileri nedeniyle Çin tıbbında yaygın olarak kabul edilen bir çöl bitkisidir. Ekinakozit (ECH), antioksidan ve antienflamatuar aktivitelerden sorumlu CTE'nin ana bileşenidir. İn vitro sonuçlarımız, ECH'nin testosteron sentez yolunu restore ettiğini ve NF-kB ve RAGE protein ekspresyonu seviyesini düşürdüğünü gösterdi. ECH, Leydig hücrelerinde süperoksit anyonu ve H2O2 üretimini etkili bir şekilde inhibe etti. İn vivo çalışmalar, ECH'nin kolesterol, trigliseritler, TNF-a ve IL-6 düzeylerini düşürdüğünü ortaya koydu. Buna ek olarak diyabetik ratların hipotalamusundaki mRNA ekspresyonları da önemli ölçüde düzeldi. Ayrıca, ECH'nin diyabetik erkek sıçanlarda lipid peroksidasyonunu azalttığı ve insülin direncini iyileştirdiği de not edilmelidir. Antioksidan aktiviteleri hem plazmada hem de testiste arttı. Bu nedenle, çalışmalarımız ECH'nin STZ ile indüklenen diyabetik erkek sıçanlarda üreme işlev bozukluğuna karşı etkili koruma sağladığını ileri sürdü.
Yazar Katkıları:F.-CK araştırma, resmi analiz ve yazılım analizi gerçekleştirdi. AJ ve J.-LH, veri küratörlüğüne katıldı ve makalenin taslağını hazırladı. Z.-LK ve AJ, el yazması incelemesini tasarladı ve düzenledi. Z.-LK metodolojiyi formüle etti ve tüm deneyi denetledi. S.-CC resmi analiz, araştırma ve doğrulamaya katıldı. Tüm yazarlar veri analizine, makalenin taslağının hazırlanmasına ve makalenin eleştirel bir şekilde gözden geçirilmesine katkıda bulundu, yayınlanacak versiyonun nihai onayını verdi ve çalışmanın tüm yönlerinden sorumlu olmayı kabul etti.
Finansman:Bu çalışma, Tayvan Eğitim Bakanlığı (MOE) tarafından Yüksek Öğrenim Filiz Projesi çerçevesinde Öne Çıkan Alanlar Araştırma Merkezi Programından Ulusal Tayvan Okyanus Üniversitesi Okyanuslar Mükemmeliyet Merkezi tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
Çıkar çatışmaları:Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemiştir.
Referanslar
1. Dünya Sağlık Örgütü. Diyabet Üzerine Küresel Raporlar. 2017. Çevrimiçi olarak erişilebilir: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/diabetes (erişim tarihi 25 Ağustos 2018).
2. Haynes, NE; Corbett, WL; Bizzarro, FT; Guertin, KR; Hilliard, DW; Hollanda, GW; Kester, RF; Mahaney, PE; Qi, L.; Spence, CL; et al. Glukokinaz aktivatörünün (2R)-3-siklopentil-2-(4-metan-sülfonil fenil)-N-tiazol-2-il- keşfi, yapı-aktivite ilişkileri, farmakokinetiği ve etkinliği propionamid (RO0281675). J. Med. Kimya 2010, 53, 3618-3625. [CrossRef] [PubMed]
3. Agbaje, IM; Rogers, DA; McVicar, CM; McClure, N.; Atkinson, AB; Mallidis, C.; Lewis, SE İnsüline bağımlı diabetes mellitus: Erkek üreme fonksiyonu için çıkarımlar. Hımm. Yeniden ürün. 2007, 22,1871-1877. [CrossRef] [PubMed]
4. Fouchecourt, S.; Metayer, S.; Locatelli, A.; Dacheux, F.; Dacheux, JL Stallion epididimal sıvı proteomu: Kalitatif ve kantitatif karakterizasyon; Majör proteinlerin salgılanması ve dinamik değişiklikleri1. Biol. tekrar. 2000, 62,1790-1803. [CrossRef] [PubMed]
5.Vernet, P.; Aitken, RJ; Drevet, JR Epididimde Antioksidan stratejileri. Mol. Hücre. endokrinol. 2004,216, 31-39. [CrossRef] [PubMed]
6.Szkudelski, sıçanda T. Streptozotocin-nikotinamid kaynaklı diyabet. Deneysel modelin özellikleri. Tecrübe. Biol. Med. 2012,237, 481-490. [CrossRef] [PubMed]
7.Zheng, S.; Jiang, X.; Wu, L.; Wang, Z.; Huang, L. Cistanches bitkisinin UPLC-QTOF/MS ve DNA barkoduna dayalı kimyasal ve genetik ayrımı. PLoS BİR 2014, 9, e98061. [CrossRef] [PubMed]
8. Li, J.; Li, J.; Aspire, A.; Gao, L.; Huo, S.; Luo, J.; Zhang, F. Cistanche tubulosa kaynaklı feniletanoid glikozitler, mitokondriye bağımlı Yol yoluyla apoptozun indüklenmesiyle hem in vitro hem de in vivo olarak B16-F10 Hücrelerinin büyümesini engeller. J. Yengeç 2016, 7,1877-1887. [CrossRef] [PubMed]
9. Zhao, Q.; Gao, J.; Cai, D. Parkinson hastalığının subakut MPTP fare modelinde ekinakozidin nörotrofik ve nöro-kurtarma etkileri. Beyin Araş. 2010,1346, 224-236. [CrossRef] [PubMed]
10. Yoshikawa, M.; Matsuda, H.; Morikawa, T.; Xie, H.; Nakamura, S.; Muraoka, O. Feniletanoid aminoglikozitler ve Cistanche tubulosa'dan vazorelaksan aktiviteye sahip açillenmiş oligoşekerler. Bioorg. Med. Kimya 2006, 14, 7468-7475. [CrossRef] [PubMed]
11. Jiang, Z.; Wang, J.; Li, X.; Zhang, X. Echinacoside ve Cistanche tubulosa (Schenk) R. wight, gonad ekseni düzenlenmiş steroidojenik enzimler yoluyla sıçanlarda bisfenol A kaynaklı testis ve sperm hasarını iyileştirir. J. Etnofarmakol. 2016,193, 321-328. [CrossRef] [PubMed]
12. Yerleştirici, ZA; Cushman, LL; Johnson, BC Biyokimyasal sistemlerde lipid peroksidasyonu (malonil dialdehit) ürününün tahmini. Anal. Biyokimya. 1966,16, 359-364. [Çapraz Referans]
13. Younglai, EV; Holt, D.; Brown, P.; Jurisicova, A.; Casper, RF Sperm yüzdürme teknikleri ve DNA parçalanması. Hımm. tekrar. 2001,16,1950-1953. [CrossRef] [PubMed]
14. Yokoi, K.; Uthus, EO; Nielsen, FH Nikel eksikliği sıçanlarda sperm miktarını ve hareketini azaltır. Biol. İz Elem. Araş. 2003, 93,141-153. [Çapraz Referans]
15.Aebi, H. Katalaz in vitro. Yöntemler Enz^mol. 1984,105,121-126. [CrossRef] [PubMed]
16. Brownlee, M. Biyokimya ve diyabetik komplikasyonların moleküler hücre biyolojisi. Nature 2001, 414, 813. [CrossRef] [PubMed]
17.Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH Geleneksel Çin Ham Tıbbı Cistanche tubulosa Ekstresinin Farelerde Hipokolesterolemik Etkileri. Ben. J.Çin. Med. 2009, 37, 1125-1138. [CrossRef] [PubMed]
18. Baynes, JW; Thorpe, SR Diyabetik komplikasyonlarda oksidatif stresin rolü: Eski bir paradigma üzerine yeni bir bakış açısı. Diyabet 1999, 48,1-9. [CrossRef] [PubMed]
19. Akkuş, İ.; Kalak, S.; Vural, H.; Çağlayan, Ö.; Menekşe, E.; Can, G.; Durmus, B. Tip II diyabetli hastaların lökosit lipid peroksidasyonu, süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz ve serum ve lökosit C vitamini düzeyleri. Klinik. Chim. Açta 1996, 244, 221-227. [Çapraz Referans]
20. Matough, FA; Budin, SB; Hamid, ZA; Alwahaibi, N.; Mohamed, J. Diyabetik komplikasyonlarda oksidatif stres ve antioksidanların rolü. Sultan. Kabus Üniv. Med. J. 2012, 12, 5-18. [CrossRef] [PubMed]
21. Gu, C.; Yang, X.; Huang, L. Cistanches herba: Bir nörofarmakoloji incelemesi. Ön. farmakol. 2016, 7,1-10. [CrossRef] [PubMed]
22. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; Güneş, HX; Liu, X. Tip 2 diyabetik db/db farelerde Cistanche tubulosa'nın anti-hiperglisemik ve hipolipidemik etkileri. J. Etnofarmakol. 2013,150, 935-945. [CrossRef] [PubMed]
Cistanche tubulosa takviyeleri
