Böbrek Renal Berrak Hücreli Karsinomun Tümör Mikroçevresindeki Genetik Düzensizliğin PartⅠMetabolik Anlayışı

Soyut

Metabolik düzensizlik, özellikle metabolik genlerdeki değişikliklerin neden olduğu KIRC dahil kanserlerin ayırt edici özelliğidir. Şu anda, tümör mikro ortamındaki metabolik imzalar arasında bir fikir birliği eksikliği var. Bu çalışmada, KIRC ile ilgili normal numuneler arasında diferansiyel olarak eksprese edilen metabolik genlerin (DEmG'ler) anlamlı korelasyonlarını gözlemledik. Kısaca, KIRC'nin RNA-seq verileri ve TCGA'dan normal dokular yoluyla metabolik gen kümeleri topladık, ardından KIRC ile ilgili DEmG'leri tanımladık. Daha sonra, hastalar üç kümeye ayrıldı ve WGCNA kullanılarak farklı kümeler arasında hayatta kalmaya dahil olan metabolik genleri belirledik.

Ayrıca, kümelerde immün infiltrasyon ile birlikte hayatta kalma ve klinik parametreleri araştırdık. Aynı zamanda, bu DEmG'lere dayalı bir tahmin modeli oluşturduk ve doğruladık. Bu analizler, yüksek DEmG ekspresyonuna sahip hastaların hayatta kalma oranının düşük olduğunu gösterirken, daha az bağışıklığa sahip hücrelerin infiltrasyonunun KIRC metastazı ile ilişkili olduğunu ortaya çıkardı. Sonunda, NUDT1'i, KIRC numunelerinde önemli ölçüde yüksek ekspresyon gösterdiği ve hastaların hayatta kalması ve prognozu ile ilişkili olduğu için bir merkez geni olarak tanımladık. Daha fazla analiz, NUDT1'in 786-O ve ACHN hücrelerinde onkojenik rolünü ortaya çıkardı. Bu nedenle, NUDT1'in KIRC için potansiyel bir teşhis ve prognostik belirteç olabileceği sonucuna vardık.

anahtar kelimeler

Metabolik düzensizlik; Diferansiyel olarak ifade edilen metabolik genler (DEmG'ler); Hayatta kalma oranı; NUDT1;Cistanche faydaları.

Bilmek için buraya tıklayınCistanche'ın etkileri

giriiş

Böbrek renal berrak hücreli karsinom (KIRC), vakaların yüzde 70-80'ini oluşturan yaygın kanserlerden biri olarak kabul edilen [1], kansere bağlı ölümlerin en yaygın 16. nedeni olarak sıralanan bir renal hücreli karsinom (RCC) türüdür. dünya çapında [2]. Renal hücreli karsinom (RCC), en yaygın böbrek kanseri türüdür ve böbrek kanseri vakalarının yüzde 90'ını oluşturur [3]. Son zamanlarda, kanserlerdeki potansiyel belirteçlerin biyoinformatik tabanlı tanımlaması yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak KIRC'nin yalnızca birkaç güvenilir biyobelirteçleri tanımlanmıştır veya belirteçlerin çoğu şimdiye kadar tam olarak doğrulanmamıştır. Bu nedenle, KIRC'nin biyogenezinin ve ilerlemesinin potansiyel mekanizmasını aydınlatmak için deneysel doğrulamalarla birleştirilmiş biyoinformatik analizler gereklidir [4]. Tümör mikro ortamının derinlemesine araştırılması ve immünoterapinin gelişimi, tümörler ve bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimi incelemeyi mümkün kılmıştır [5]. Yine de, tanımlanmış biyobelirteçlerin çoğu, KIRC'deki hücresel fenotip ve ilgili altta yatan moleküler mekanizmalar üzerindeki etkileri açısından incelenmemiştir [6]. Bununla birlikte, KIRC hastalarının prognozu tam olarak anlaşılamamıştır ve ilk teşhisten sonra genel 5-yıllık sağkalım yüzde 10'dan azdır [7, 8]. Genel olarak, normal dokular ağırlıklı olarak yüksek seviyelerde antianjiyojenik faktörler içerir. Bu faktörlerin seviyesindeki bozulma, tümör oluşumuna yol açan anormal bir oranda hücrelerin bölünmesini daha da artıran proanjiyojenik faktörleri aktive edebilir [9]. Bu süreçte tümör hücreleri yüksek düzeyde proanjiyojenik büyüme faktörü ifade eder ve bu etki tümörlerde yeni kan damarlarının gelişimini destekler [10]; böylece tümörün gelişimi başlar. Bu nedenle, immün hücrelerin infiltrasyonu ve çeşitli metabolik genlerin ekspresyonu dahil olmak üzere tümörijenezde birçok başka faktör yer alır. Tümör mikroçevresinde farklı tipte bağışıklık hücrelerinin varlığının, tümörün ilerlemesini ve immünoterapiyi büyük ölçüde etkilediği iyi bilinmektedir; bu nedenle, bağışıklıkla ilişkili genlerdeki değişiklikler, tümör mikroçevresindeki bağışıklık hücrelerinin oranını ve işlevini de etkiler [11]. Örneğin, tümör mikroçevresindeki immün hücrelerin infiltrasyonu, glioma gelişimini önemli ölçüde etkiler [12]. Kanserleri etkileyen metabolik genlere yönelik ilgi eksikliğine rağmen, mevcut çalışmalar kanserin metabolik bir bozukluk olduğu konusundaki farkındalığı tazelemiştir [13, 14]. Bu çalışmalar, malign transformasyonun yeni bir özelliği olarak metabolik yeniden programlamanın dahil edilmesi için bir temel sağlar [15]. Ancak tümörler ve normal dokular dahil olmak üzere farklı dokular arasındaki tüm metabolik genlerin veya yolakların ekspresyonu birbirinden farklıdır ve özellikle KIRC'de büyük ölçüde keşfedilmemiştir.

Genel olarak, KIRC'de prognoz ve immünoterapötik yanıtların tahmini için daha az sayıda güvenilir biyobelirteç vardır; bu nedenle, tam bir klinik başarıya sahip olmak zordur. Bu nedenle, deneysel doğrulamalarla birleştirilmiş kapsamlı biyoinformatik çalışmalar, KIRC'nin biyogenezinin ve ilerlemesinin potansiyel mekanizmalarını aydınlatabilir. Bu nedenle, mevcut çalışma, metabolik yolların KIRC'deki metabolik transkripsiyonel profiller üzerindeki etkilerini, eşleşen normal dokularla karşılaştırıldığında kapsamlı bir şekilde değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Burada, sadece aynı hastalığın farklı hastalık bölgelerini veya farklı moleküler alt tiplerini başarılı bir şekilde ayırmakla kalmadık, aynı zamanda metabolizma hedefli tedaviye yanıtı da tahmin ettik. Bu, malignitede metabolik yolların bozulduğu bir mekanizmayı tanımlamanın yeni bir yolunu temsil eder ve klinik müdahaleler için yeni hedefler sunar.

Standart Cistanche

Araç ve yöntemler

1. Veri Toplama.

KIRC ile ilgili RNA sıralama verileri (FPKM) doğrudan Kanser Genom Atlası'ndan (TCGA) indirildi. Daha sonra, veriler istenen alt uygulamalara göre işlendi. Ek olarak, cinsiyet, ırk, yaş, tümör yerleşimi, histoloji sınıflandırması, farklılaşma derecesi, tümör evresi ve sağkalım bilgileri dahil olmak üzere ilgili KIRC hastaları için klinikopatolojik veriler UCSC Cancer Browser'dan elde edildi. KIRC hastalarının metabolik heterojenliği hakkında fikir edinmek için, önceki yayınlardan [16, 17] metabolik gen setleri alınmıştır. Bu çalışmanın grafik özeti Ek Şekil 1'de gösterilmektedir ve veri toplama ve sonraki süreç çalışmasının ayrıntılı iş akışı Ek Şekil 2'de gösterilmektedir.

2. Farklı Şekilde İfade Edilen Metabolik Genlerin (DEmG'ler) Tanımlanması.

Metabolik gen setleri, iki veri setinin kesişmesiyle tanımlandı ve tümör ile normal numuneler arasında DEG analizi için kullanıldı. Daha sonra, WGCNA kullanarak DEmG'leri de belirledik ve hayatta kalma modlarına göre hastalar bunları üç kümeye ayırdı. Kısaca hastalar küme C1, küme C2 ve küme C3 olmak üzere üç kümeye ayrıldı. DEG'leri belirlemek için, R paketi limması kullanılarak doğrusal modeller kullanıldı. Log2 kat değişimi, logFC > 1 ve logFC < −1'in eş zamanlı mutlak değeri ile birlikte bir yanlış keşif oranı (FDR) ayarlı p-değeri < 0.05, DEG tanımlaması için eşik olarak ayarlanmıştır. Volkan grafikleri ggplot2 kullanılarak yapılmıştır. LogFC> 1 olan genlerin yukarı regüle edildiği kabul edildi ve logFC <-1 olan genler, aşağı regüle edilmiş genler olarak atandı.

3. Fonksiyonel Zenginleştirme Analizleri ve Protein-Protein Etkileşimi.

GO ve KEGG terimlerine göre zenginleştirme analizleri, R paket Cluster profili aracılığıyla gerçekleştirildi. GO terimleri, moleküler fonksiyonlar (MF), hücresel bileşenler (CC) ve biyolojik süreçler (BP) dahil olmak üzere üç kategoriye ayrıldı. DEmG'lerin tümör ve normal dokular arasındaki önemli farklılıklarını ve korelasyonlarını belirlemek için hesaplama yazılımı GSEA (gen seti zenginleştirme analizi) kullandık. Potansiyel yolları ve işlevleri belirlemek için DEG'lerin KEGG ve GO (Gen Ontology) zenginleştirme analizleri yapıldı. Ayrıca, DEmG'lerin protein-protein etkileşimi (PPI) ağını oluşturmak için sistoskop uygulaması kullanıldı. İlk PPI, STRING veri tabanından elde edildi. En yüksek güven sınırı 0.9 olarak ayarlandı.

4. Hayatta Kalma Analizi.

Renal kanser hastalarında diferansiyel olarak eksprese edilen genler, limma paketi aracılığıyla tanımlandı ve farklı şekilde eksprese edilen genler, toplam 6 modülü tanımlayan bir birlikte ekspresyon ağı oluşturmak üzere birlikte ekspresyonu gerçekleştirmek için WGCNA paketi kullanılarak analiz edildi.=5 ve ağ ölçeksiz bir ağdır. Hayatta kalma modunda WGCNA tarafından tanımlanan DEmG'lerin prognostik önemi, log-rank testi ile Kaplan-Meier (KM) grafikleri ile belirlendi.

Cistanche hapları

5. Bağışıklık Sızma Analizi.

Bağışıklık ve stromal hücreler R paketi kullanılarak hesaplandı, "xCELL;" p < 0:05 olan numuneler ileri analiz için seçildi. Ayrıca biyolojik belirteçler içeren bağışıklık hücreleri, R paketi GSVA ile analiz edildi. Ayrıca, tümörün saflığını analiz etmek için, bir dizi KIRC dokusunun stromal ve immün puanlarını tahmin etmek için ESTIMATE algoritmasını kullandık.

6. Tahmin Modelinin Oluşturulması.

Diferansiyel olarak eksprese edilen metabolik genler, KIRC tümörlerinin hayatta kalma bilgileriyle birlikte RNA dizileme verilerinden elde edildi ve hastalar, R paketi "caret" kullanılarak rastgele eğitim ve test kohortlarına ayrıldı; daha sonra, DEmG'ler üzerinde tek değişkenli hayatta kalma analizi yapıldı. Ayrıca LASSO analizi "glmnet;" R paketi ile gerçekleştirilmiştir. ve tahmin modelinin optimizasyonu için adım adım orantılı tehlikeler modeli kullanıldı.

7. Hücre Kültürü.

İnsan böbrek kanseri hücre dizileri 786-O ve ACHN, American Type Culture Collection'dan (ATCC) (Manassas, VA, ABD) satın alınmıştır. 786-O hücre hatları, yüzde 10 fetal sığır serumu (kat. no. 04-001- 1ACS, Biyolojik Endüstriler, İsrail). ACHN hücre çizgileri, yüzde 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş MEM ortamında (kat. no. 41500034, Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kültürlendi. Tüm kültürler 37 derece C'de ve yüzde 5 CO2'de inkübe edildi₂nemlendirilmiş bir inkübatörde.

8. Gerçek Zamanlı Kantitatif PCR.

KIRC hücre hatlarından ve dokularından toplam RNA, üreticinin protokollerine göre TRIzol (kat. no. 9109; TaKaRa, Tokyo, Japonya) kullanılarak izole edildi. RT-qPCR, QuantiNova SYBR Green PCR Kit (kat. no. 208054, QIAGEN, Duesseldorf, Almanya) kullanılarak yapıldı. Bağıl gen ifadesi 2 ile hesaplandı^−ΔΔCtyöntem. Astar dizileri Ek Tablo 1'de listelenmiştir.

9. Hücre Canlılığı Deneyi.

786-O ve ACHN'de NUDT1 siRNA transfeksiyonundan sonraki sitotoksisite, bir Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) tahlili (kat. no. C0038, Beyotime Biotechnology Co. Ltd., Çin). NUDT1 siRNA dizileri, Ek Tablo 1'de verilmiştir. GenePharma'dan (Şangay, Çin) sentezlendiler. Kısaca, logaritmik büyüme fazında (siRNA transfeksiyonundan 24 saat sonra) hem 786-O hem de ACHN hücre hatları toplandı ve 96- gözlü hücre kültür plakalarına (1000 hücre/kuyu) dağıtıldı. Ertesi gün, her kuyucuğa 10 ul CCK-8 eklendi. 37 derece C'de 2 saat daha inkübasyondan sonra, 450 nm'deki hücrelerin optik yoğunluğu (OD), bir mikroplaka okuyucu (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, ABD) aracılığıyla tespit edildi.

10. Hücre Göçü, İstilası ve Apoptoz Testi.

KIRC hücreleri {{0}}O ve ACHN, NUDT1'in siRNA aracılı yıkımı için transfekte edildi. Transfeksiyondan 24 saat sonra hücreler, yara iyileştirme analizi için 6-kuyu plakalarına ekildi. Hücreler yüzde 100 birleşme sağladıktan sonra, plastik bir pipet ucu kullanılarak hücrelerde tek tabaka halinde yaralar oluşturuldu. Hücreler daha sonra PBS ile durulandı ve 48 saat daha kültürlendi. Yara kapanma mesafesi bir mikroskopla görselleştirildi ve NUDT1 yıkımının KIRC 786-O ve ACHN hücreleri üzerindeki etkisini ölçmek için fotoğraflandı. Hücre göçü ve istilası, transwell 24-kuyu plakaları (Corning, New York, NY) kullanılarak gerçekleştirildi. Kısacası, eşit sayıda hücre, üst bölmedeki FBS'siz ortamda kültürlendi ve hücrelerin migrasyonu, ortamın yüzde 10 FBS ile desteklendiği transwell'in alt bölmesinde gözlendi. Transwell odaları dikkatlice yıkandı ve yüzde 0.2 kristal menekşe ile boyandı, görselleştirildi ve fotoğrafları çekildi; daha sonra, negatif kontrol ile NUDT1 devrilme arasındaki taşınan hücreler arasındaki farklar, basitçe hücre sayımı ile belirlendi. Apoptoz tahlili, transfeksiyondan 72 saat sonra yapıldı, hücreler toplandı, yıkandı ve buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspanse edildi. Hücreler daha sonra üreticinin talimatlarına göre Apoptosis Detection Kit (kat. no. KGA1013, KeyGen BioTech, Nanjing, Çin) ile tespit edildi ve akış sitometrisi (FACScan; BD Biosciences) ile incelendi. Tüm deneyler üç kopya halinde gerçekleştirildi.

11. İstatistiksel Analiz.

Tüm istatistiksel analizler GraphPad prizmasında (V7.0) ve R'de (3.6.4) yapıldı, normal ve tümör dokularında bağışıklık hücrelerinin sızmasını karşılaştırmak için Wilcox testi ve ki-kare testi kullanıldı. immün hücre infiltrasyonu ile patolojik parametreler arasındaki ilişkiyi incelemek için yapıldı. Üç küme arasında bağışıklık skorunu, stromal skoru ve tümör saflığını karşılaştırmak için varyans analizi kullanıldı. Sağkalım analizi için p-değeri, log-rank testi kullanılarak hesaplandı. bir p-değeri<0.05 was considered statistically significant.

Cistanche takviyeleri

Referanslar

[1] V. Nerich, M. Hugues, T. Nai, ve diğ., "Metastatik şeffaf hücreli renal hücreli karsinomalı hastalarda hedefe yönelik tedavilerin klinik etkisi", Oncotargets and Therapy, cilt. 7, s. 365–374, 2014.

[2] A. Znaor, J. Lortet-Tieulent, M. Laversanne, A. Jemal ve F. Bray, "Renal hücreli karsinom insidansı ve mortalitesinde uluslararası varyasyonlar ve eğilimler", Avrupa Ürolojisi, cilt. 67, hayır. 3, s. 519–530, 2015.

[3] B. Ljungberg, L. Albiges, Y. Abu-Ghanem, ve diğerleri, "Avrupa Üroloji Derneği Renal Hücreli Karsinoma Yönergeleri: 2019 Güncellemesi", Avrupa Ürolojisi, cilt. 75, hayır. 5, s. 799–810, 2019.

[4] W. Zheng, S. Zhang, H. Guo, ve diğ., "Böbrek şeffaf hücreli karsinomda tümör anjiyogenez özelliklerinin ve potansiyel epigenetik düzenleme mekanizmalarının çoklu omik analizi," Hücre İletişimi ve Sinyalleme: CCS, cilt. 19, hayır. 1, s. 39, 2021.

[5] J. Galon ve D. Bruni, "İmmün sıcak, değişmiş ve soğuk tümörlerin kombine immünoterapilerle tedavi edilmesine yönelik yaklaşımlar", Nature Review Drug Discovery, cilt. 18, hayır. 3, s. 197–218, 2019.

[6] W. du, L. Zhang, A. Brett-Morris ve diğerleri, "HIF, yağ asidi metabolizmasının baskılanması yoluyla ccRCC'de lipid birikimini ve kanseri yönlendirir" Nature Communications, vol. 8, hayır. 1, s. 1769, 2017.

[7] A. Jemal, R. Siegel, E. Ward, et al., "Cancer istatistikleri, 2008," CA: A Cancer Journal for Clinicians, vol. 58, hayır. 2, s. 71–96, 2008.

[8] I. Lucca, T. Klatte, H. Fajkovic, M. de Martino ve SF Shariat, "Erratum: Cinsiyet farklılıkları insidans ve ürotelyal ve böbrek kanserinin sonuçları," Nature Review Urology, cilt. 12, hayır. 12, s. 653, 2015.

[9] IJ Fidler, "Anjiyogenez ve kanser metastazı", Cancer Journal, cilt. 6, Ek 2, s. S134–S141, 2000.

[10] C. Kut, F. Mac Gabhann ve AS Popel, "Vücutta VEGF nerede? Kanserde VEGF dağılımının bir meta-analizi," British Journal of Cancer, vol. 97, hayır. 7, s. 978–985, 2007.

[11] F. Ren, Q. Zhao, M. Zhao, ve diğerleri, "Mide kanserinde immün infiltrasyon profili ve bunların klinik etkileri," Cancer Science, cilt. 112, hayır. 9, s. 3569–3584, 2021.

[12] X. Ge, Z. Wang, R. Jiang ve ark., "SCAMP4 yeni bir prognostik belirteçtir ve gliomada tümör ilerlemesi ve immün infiltrasyon ile ilişkilidir," The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol. 139, 2021.

[13] MG Vander Heiden ve RJ DeBerardinis, "Metabolizma ve kanser biyolojisi arasındaki kesişme noktalarını anlamak", Cell, cilt. 168, hayır. 4, s. 657–669, 2017.

[14] DS Wishart, "Kanser genetik bir hastalık mı yoksa metabolik bir hastalık mı?" biyotıp, cilt. 2, hayır. 6, s. 478-479, 2015.

[15] D. Hanahan ve RA Weinberg, "Kanserin ayırt edici özellikleri: gelecek nesil," Cell, cilt. 144, hayır. 5, s. 646–674, 2011.

[16] X. Peng, Z. Chen, F. Farshidfar, ve diğerleri, "İnsan kanserlerinde metabolik ekspresyon alt tiplerinin moleküler karakterizasyonu ve klinik önemi", Cell Reports, vol. 23, hayır. 1, s. 255–269.e4, 2018.

[17] S. Haider, A. McIntyre, RG van Stiphout, et al., "Genomik değişiklikler, tümör hipoksisi ile ilişkili bir pan-kanser metabolik kaymasının temelini oluşturur", Genome Biology, vol. 17, hayır. 1, s. 140, 2016.

Junwei Xie,1,2,3,4,5 Lingang Cui,6 Shaokang Pan,1,2,3,4,5 Dongwei Liu,1,2,3,4,5 Fengxun Liu,1,2,3,4 ,5 ve Zhangsuo Liu 1,2,3,4,5

1 Nefroloji Bölümü, Zhengzhou Üniversitesi'nin İlk Bağlı Hastanesi, Zhengzhou 450052, Çin

2 Nefroloji Araştırma Enstitüsü, Zhengzhou Üniversitesi, Zhengzhou 450052, Çin

3 Böbrek Hastalığı Araştırma Merkezi, Zhengzhou, 450052 Henan, Çin

Henan Eyaletinde, Zhengzhou 450052, Çin'de Kronik Böbrek Hastalığı için Hassas Teşhis ve Tedaviye Yönelik 4 Temel Laboratuvar

5 Böbrek Hastalığı Ulusal Klinik Tıbbi Araştırma Merkezi Çekirdek Birimi, Zhengzhou 450052, Çin

6 Üroloji Bölümü, Zhengzhou Üniversitesi'nin İlk Bağlı Hastanesi, Zhengzhou 450052, Çin