Mikroalbüminüri Varlığı Olan ve Olmayan Köpek Diyabetinde Birinci Bölüm Üriner Proteom Farkları

Basit Özet

Köpek diyabeti, çok sayıda komplikasyona yol açabilen ciddi bir hastalıktır. Köpeklerde idrar proteomikleri hakkında sınırlı veri vardır ve diyabetin idrar proteomu üzerindeki etkisinin hiçbiri yoktur. Bu çalışmada sağlıklı hayvanlardan toplanan idrarın protein bileşimini analiz etmeyi ve iki diyabetik grupla (normoalbüminürik ve mikroalbüminürik) karşılaştırmayı amaçladık. Bu üç grup arasında önemli farklılıklar vardır ve tanımlanan proteinlerin daha sonra klinik pratikte ve hastalığın daha iyi anlaşılması için kullanılabilecek potansiyel bir teşhis aracı olarak umut vaat ettiğine inanıyoruz.

Soyut

Bu çalışmada, sağlıklı hayvanlardan toplanan idrarın protein bileşimini analiz etmeyi ve iki diyabetik grupla (DM I normoalbüminürik diyabetik köpekler; mikroalbüminürili DM II diyabetik köpekler) karşılaştırmayı amaçladık. Mikroalbuminüri ortaya çıkmadan önce diyabetik hastalarda yukarı veya aşağı regüle olabilen potansiyel idrar proteinlerini belirlemeye çalıştık. Yöntemler: İdrar elde edildikten sonra, iki boyutlu elektroforez ve ardından istatistiksel olarak anlamlı diferansiyel olarak eksprese edilmiş proteinler olan MALDI-TOF spektrometrisi ile seçim ve tanımlamaya izin veren Delta2D yazılım analizi gerçekleştirdik. Çalışmamız, diyabetik ve kontrol grubundan 2D jeller üzerinde 286 ortak protein lekesi ortaya çıkardı. Bu proteinlerden beşi, MALDI-TOF MS tarafından pozitif olarak tanımlandı. Beş farklılaşan proteini daha fazla değerlendirmek için, onları uygun biyolojik işlemlere atamak için Panther programı kullanıldı. Sonuç: Önemli sayıda tanımlanmış protein, hücre içi sinyalleşmede (vezikül oluşumu, bağlanma ve zarlar yoluyla taşınma) rol oynar. Bu, böbrek diyabetik hücresel bozukluğun ilk belirtilerinin, herhangi bir klinik belirti ortaya çıkmadan önce idrar bileşiminde görülebileceğini düşündürebilir.

anahtar kelimeler

böbrek hasarı; diyabetik nefropati; köpek diyabeti; idrar belirteçleri; proteomik.

Cistanche avantajlarından yararlanmak için buraya tıklayın

giriiş

Diabetes mellitus (DM), çoğunlukla orta yaşlı ve yaşlı köpeklerde görülen nispeten yaygın bir endokrinopatidir [1,2]. Vaskülopati, sistemik hipertansiyon ve nefropati gibi çok sayıda komplikasyona neden olabilir [1]. Ömürlerinin kısa olması nedeniyle, bu komplikasyonlar küçük hayvanlarda nadiren ortaya çıkar, ancak önemli hastalıklara neden olabilir [3,4]. Spontan DM'li köpeklerde idrar albümin konsantrasyonu ile ilgili bilgi eksikliği de vardır. Önceki bir çalışmada, diyabetik köpeklerin yüzde 20'sinin idrar protein-kreatinin oranı (UPC) > 1 temelinde proteinürik olduğu ve yüzde 46'sının hipertansif olduğu bulunmuştur [5]. Mazzi ve ark. diyabetik köpeklerin yüzde 55'inde albümin konsantrasyonunun yükseldiğini ve bunların yarısından fazlasının İdrar Proteininin Kreatinin Oranına (UPC) eş zamanlı olarak yükseldiğini bildirmiştir [6]. Başka bir çalışmada, diyabetik hastalarda mikroalbüminüri prevalansı aynı seviyedeydi, ek olarak, ilk değerlendirmede mikroalbuminüri ve normal UPC'si olan üç köpekten ikisinde uzunlamasına çalışma sırasında yüksek bir UPC gelişti [4].

Urinary proteins are a promising target for detecting kidney injury. Only a minimal amount of proteins is present in normal urine, due to the mechanical barrier of the glomerulus, and the reabsorption in the proximal tubules. Urinary total protein (UTP) contains proteins originating from filtered plasma, lower urinary tract, and kidney-derived proteins. High urinary protein concentration can be a result of nephron dysfunction, as a healthy glomerular filtration barrier excludes proteins larger than 69 kDa, the molecular weight of albumin. Also, it is worth noticing that positively charged proteins pass the glomerular barrier easier than negatively charged ones. In conditions of disease, the glomerular barrier gradually collapses, allowing large amounts of proteins of high, or intermediate weight to pass into the ultrafiltrate. Proteins of small molecular weight (>69 kDa) glomerulusta serbestçe filtre edilir ancak daha sonra böbrek proksimal tübülleri tarafından yeniden emilir, bu nedenle hem birincil hem de ikincil tübüler disfonksiyon proteinüriye neden olabilir [7].

Proteomik ve metabolomik çalışmadaki ilerlemeler, idrardaki binlerce proteini ve peptidi tek bir analizde belirleme yeteneğimizi geliştirdi; bunlardan bazıları yeni belirteç görevi görebilir. Proteinlerin bu büyük ölçekli çalışmasına proteomik adı verilirken, endojen proteaz aktivitesi tarafından üretilen doğal olarak oluşan peptitlerin çalışmasına peptidomik denir. Proteomik analiz, veterinerlik araştırmalarında da önemli bir araç haline gelmiştir [8-12]. Sağlıklı köpeklerde köpek üriner proteomunun karakterizasyonu halihazırda araştırılmıştır [13]. Üriner proteomik ve peptidomikler, altta yatan biyolojinin araştırılmasına farklı boyutlar katmaktadır [14]. İdrarın invazif olmayan yöntemlerle toplanabilmesi ve doğrudan böbrekler tarafından üretilebilmesi nedeniyle, idrardaki uygulamalarının diyabetik böbrek hastalığı için önemli klinik etkileri vardır. Bu nedenle, üriner proteinlerin ve peptitlerin nispi bolluğundaki değişiklikler, diyabetik böbrekte protein ekspresyonu, birikimi veya döngüsündeki değişiklikleri yansıtabilir [15]. Diyabetik köpeklerle ilgili iyi gelişmiş veterinerlik araştırmalarına rağmen, idrarın moleküler çalışmalarına ilişkin raporlar seyrektir [11,13,14,16,17].

Bu çalışma, sağlıklı hayvanların idrarındaki proteinleri tanımlamayı ve bunu iki diyabetik grupla (normoalbüminürik köpekler ve mikroalbüminürili köpekler) karşılaştırmayı amaçladı. Mikroalbuminüri ortaya çıkmadan önce diyabetik hastalarda yukarı veya aşağı regüle olabilen potansiyel idrar proteinlerini belirlemeye çalıştık.

Cistanche takviyeleri ve Cistanche özü

Malzemeler ve yöntemler

Ayakta tedavi gören bir popülasyondaki tüm köpekler, 2018-2020 arasındaki iki yıl boyunca Lublin'deki Yenilikçi Hayvan Patolojisi ve Tedavisi Merkezi Veterinerlik Fakültesi'ne art arda kaydedildi. Tüm numuneler, standart veteriner teşhis prosedürleri sırasında alınmıştır; bu nedenle, Polonya yasalarına göre, tıbbi, istilacı teşhisler veya katılımcılar için psikolojik veya sosyal rahatsızlığa neden olan prosedürler dahil olmak üzere herhangi bir tedavi olmadığı için Hayvan Deneylerinde Yerel Etik Komisyonu'nun onayı gerekli değildi. Deneyler, Avrupa Birliği mevzuat direktifi 2010/63/EU temel alınarak yapılmıştır. Çalışma ARRIVE yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Köpek sahiplerine çalışmanın yöntemi ve amacı hakkında bilgi verildi ve yazılı onamları alındı. Çalışma üç köpek grubu üzerinde yürütüldü: 7 normoalbüminürik diyabetik köpekten oluşan DM I grubu (4 erkek, 3 dişi, ortalama yaş: 7); Mikroalbüminürili 7 diyabetik köpekten oluşan DM II grubu (3 erkek, 4 dişi, ortalama yaş: 8); H grubu 7 sağlıklı köpekten oluşmaktadır (4 erkek, 3 dişi, ortalama yaş: 7).

DM tanısı köpeklerde hastalıkla uyumlu klinik belirtiler (poliüri, polidipsi, kilo kaybı) olan kalıcı belirgin hiperglisemi (plazma glukozu > 200 mg/dL; 11 mmol/L) ve glukozüri bulunmasıyla konulmuştur.

Ek olarak, sahipler, evcil hayvanlarının normaline göre su ve yiyecek tüketimi, idrara çıkma sıklığı ve aktivitedeki değişiklikleri belgelemek için standart bir anket doldurdu.

Bir çalışma grubu olarak, sahibi tarafından sunulan toplam 30 diyabetik melez köpekten 14'ü dahil edilmeye uygun bulundu. Dahil etme gereklilikleri şunlardı: (1) önceden diabetes mellitus tanısı almış olmak; (2) en az üç ay süreyle verilen insülin tedavisi; (3) klinik olarak stabil diyabet. Hariç tutma kriterleri şunlardı: proteinüri (İdrar Proteini: Kreatinin Oranı > 0.5), aktif idrar sedimenti, pankreatit, adrenal bez hiperaktivitesi, uterusta pürülan inflamasyon ve böbrek veya idrar kesesinin bakteriyel inflamasyonu. Kontrol grubu olarak farklı ırklardan 7 sağlıklı köpek alındı. Fizik muayene, tam kan hücresi sayımı, plazma biyokimya profili ve idrar tahliline göre sağlıklı kabul edildiler. Kontrol grubu, çalışma grubu ile yaş uyumlu olacak şekilde seçildi.

Her köpek için kan basıncı ölçümü, rutin biyokimyasal ve hematolojik kan testleri ve idrar tahlili ile klinik muayene yapıldı. Her kan örneği, kapalı bir vakum sistemi kullanılarak EDTA içeren bir test tüpüne alındı ​​ve bir Exigo Vet analiz cihazında (Boule, Spånga, İsveç) hematolojik analize tabi tutuldu. 3000 rpm'de 15 dakika 4°C'de santrifüjlemeden sonra elde edilen plazma, bir BS-130 otomatik biyokimyasal analiz cihazında (Mindray, Shenzhen, Çin) analiz edildi. Kimya panelinde alanin transferaz, aspartat aminotransferaz, toplam bilirubin, üre, kreatinin, alkalin fosfataz, glikoz, albümin, toplam protein, amilaz, -glutamiltransferaz yer aldı. Enzimle güçlendirilmiş kemilüminesan deney (Immulite 1000 analiz cihazı) kullanılarak serum kortizol konsantrasyonu da belirlendi. Diyabetik köpekler için glisemik kontrol, serum fruktozamin konsantrasyonu kullanılarak tahmin edildi. İptal edilen orta akım idrar örnekleri sabah toplandı ve her örnek, alındığı gün 500x g'de 10 dakika 4 ◦C'de santrifüjlendi. Süpernatanlar çıkarıldı ve proteaz inhibitörleri eklendi (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma, P8340, Spruce Street, Saint Louis, MO, ABD.) Otomatik bir kimya analiz cihazında (Mindray BS{111) ticari kitler kullanılarak idrar toplam proteinleri ve kreatinin belirlendi. }}). UPC, aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı: UPC=idrar proteini (mg/dL)/idrar kreatinin (mg/dL). Taze idrar örneklerinde mikroskobik sediment analizi ile temel idrar tahlili yapıldı. İdrar özgül ağırlık (USG) bir refraktometre kullanılarak ölçüldü. Mikroalbüminüri, ticari olarak temin edilebilen bir ELISA test kiti (Canine Microalbuminuria Elisa Kit, My Biosource, San Diego, CA, ABD) kullanılarak ölçüldü. Mikroalbüminüri testi, üreticinin talimatlarına göre yapıldı. Albüminüri, taze spot idrar örneğinde idrar albüminin kreatinin oranı (UACR) ile değerlendirildi. Kalan idrar ileri analiz için -80 ◦C'de donduruldu.

Standart Cistanche

İdrarın Proteomik Analizi

Proteomik analiz için, grup I'den (DM I) 7 ayrı idrar örneği, grup II'den (DM II) 7 ayrı idrar örneği ve sağlıklı gruptan (H) 7 ayrı idrar örneği toplandı.

Her idrar numunesi, Amicon Ultra-0.5 3 kDa santrifüj filtre birimleri (Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) tarafından saflaştırıldı, tuzu giderildi ve konsantre edildi. Protein konsantrasyonları, bir mikro hacimli spektrofotometre (MaestroNano, Maestrogen, Xinzhu, Tayvan) ile ölçüldü ve ardından idrar örnekleri hazırlandı ve 2D elektroforeze tabi tutuldu. Grafiksel ve istatistiksel analizden sonra ilgili proteinler, MALDI-TOF MS (Matriks Destekli Lazer Desorpsiyon İyonizasyonu – Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi) tekniği ile kütle spektrometrisi ile daha fazla tanımlama için jelden kesildi.

1. 2D Elektroforez

İki boyutlu elektroforez, idrar protein ayrımı ile sonuçlanan araştırmanın ilk aşamasıydı. Kısaca, 17 cm şerit başına 200 µg protein, bir çöktürme kiti (Ready-Prep™ 2-D Temizleme Kiti, Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) aracılığıyla alındı . Protein topakları rehidrasyon tamponunda (ReadyPrep 2-D Rehidrasyon/Numune Tamponu 1, BioRad, Hercules, CA, ABD) eritildi ve elde edilen solüsyonlar, 17 cm sabitlenmiş pH gradyanı (IPG) ile kaplı bir rehidrasyon plakasına uygulandı. ) izoelektrik odaklama için lineer şeritler (ReadyStrip IPG Strips, pH 3–10, Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) ve mineral yağ (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD). 12 saatlik rehidrasyondan sonra, ıslatılmış proteinlere sahip şeritler, birinci boyutta elektroforez yapmak için IEF-100 Hoefer aparatına (Hoefer IEF100, Hoefer, Inc., Holliston, MA, ABD) aktarıldı (işlem koşulları: 250 V /30 dak; 10,000 V/3 sa; 60 kV/sa, 50 µA/şerit akım sınırı ile). Daha sonra şeritler, 1,4-ditiyotreitol ve iyodoasetamid üre/TRIS/SDS solüsyonlarında sırayla dengelendi. Her dengeleme adımı 15 dakika sürmüştür. Dengelenmiş şeritler daha sonra, aşağıdaki akım parametreleri ile yüzde 12.5 poliakrilamid jeller içindeki proteinleri moleküler kütlelerine göre ayırmak için ikinci elektroforez boyutuna tabi tutuldu: bir elektroforetik bölmede (PROTEAN® II xi, Bio-Rad) 600 V/30 mA/100 W , Herkül, CA, ABD). Elde edilen jeller, formaldehit varlığında gümüş nitrat ile standart bir gümüş boyama prosedürüne tabi tutuldu. Boyamadan sonra, jeller Image Scanner III (GE Healthcare, Chicago, IL, ABD) kullanılarak tarandı ve Delta2D yazılımı (sürüm 4.7, DECODON, Greifswald, Almanya) ile işlendi. Yanlış pozitif ve yanlış negatif noktalar manuel olarak dışlandıktan sonra istatistiksel analiz yapıldı. Taranan görüntüler, Delta2D yazılımındaki SmartVectors teknolojisi tarafından büküldü, bu da aynı proteinin noktalarının projedeki tüm jellerde aynı konuma sahip olduğu anlamına geliyor. Jel görüntüsü çarpıtmanın kullanılması, jel görüntüleri arasındaki farkların ortadan kaldırılmasını ve bunların hizalanmasını sağladı. Ardından, kaynaşmış görüntüler oluşturmak için çarpık görüntüler kullanıldı. Kaynaşmış bir görüntü, tüm deneyde elde edilen her protein noktasını içeren proteom haritasına yanıt verir. İfade oranları oluşturuldu ve istatistikler, tek yönlü ANOVA (p değeri 0.05'ten küçük veya ona eşit) ve bir post hoc Tukey karşılaştırma testi ile normalize edilmiş hacimler üzerinden yapıldı. Belirlenen protein lekeleri jellerden kesildi, boyaları alındı, indirgendi ve ditiyotreitol ve iyodoasetamid çözeltileri kullanılarak alkile edildi. Protein içeren jel parçaları, peptit fragmanları elde etmek için triptik sindirime tabi tutuldu. Tripsin sindirimi 50 mM amonyum bikarbonat tamponunda 37 ◦C'de 12 saat gerçekleştirildi (Promega, Tripsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Teknik Bülten). Daha sonra peptitler, jel parçalarından üçlü ekstraksiyon yoluyla bir su/asetonitril/TFA solüsyonu (v:v 45:50:5) ile elüte edildi ve alınan ekstraktlar, vakum koşullarında (Labconco, Kansas City, MO, ABD) konsantre edildi. Elde edilen peptit peletleri yüzde 0,1 trifloroasetik asitte eritildi ve C18 Zip-TIP pipet uçları ile üreticinin talimatlarına göre (Merck Chemicals, Billerica, MA, ABD, PR 02358, Teknik Not) temizlendi ve kütle spektrometresi analizine hazırlandı.

Cistanche hapları

2. Kütle Spektrometresi

Bir Anchor Chip MALDI plakasında (Bruker, Bremen, Almanya) bir uL hazırlanmış peptit solüsyonu lekelendi. Protein numuneleri kurutulduğunda, yüzeyleri 1 uL -siyano-4-hidroksisinnamik asit matrisi (HCCA, Bruker, Bremen, Almanya) ile kaplandı. Peptid standart solüsyonu (Peptide Calibration Standard II, Bruker, Bremen, Almanya) da lekelendi ve kalibrasyon noktalarında matris tarafından kaplandı. Kütle spektrumları, bir Ultraflextreme MALDI TOF/TOF (Bruker, Bremen, Almanya) spektrometre kullanılarak 700–4{20}}00 m/z aralığında aktif pozitif reflektör modunda kaydedildi ve flexControl 3.3 (Bruker, Bremen, Almanya) yazılımı. Toplanan spektrumlar düzeltildi ve taban çizgisi düzeltildi. flexAnalysis 3.0 yazılımında (Bruker, Bremen, Almanya) oluşturulan > 3 sinyal-gürültü oranı için zirve listesi BioTools 3.2'ye (Bruker, Bremen, Almanya) aktarıldı ve Mascot 2.2 yazılımıyla (Matrix Science, Boston, MA, ABD) maksimum hata 0.3 Da olan "memeliler" taksonomisi ve zorunlu modifikasyon olarak sisteinin karbamidometilasyonu ile sınırlandırılmış Swiss-Prot veritabanı kullanılarak. Maskot puanı 61'in üzerinde olan sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (p 0,05'ten küçük veya eşittir); aksi halde seçilen peptitlerin fragman iyon spektrumları, LIFT modu kullanılarak elde edildi ve MALDI TOF/TOF tanımlaması amacıyla birleştirildi.

Referanslar

1. Hoenig, M. Köpeklerde ve Kedilerde Diabetes Mellitus'un Karşılaştırmalı Yönleri. Mol. Hücre. endokrinol. 2002, 197, 221–229.

2. Davison, LJ; Miras, ME; Catchpole, B. Birleşik Krallık'ta Diabetes Mellitus'lu 253 Köpek Çalışması. Veteriner. Rec. 2005, 156, 467–471.

3. Ringa balığı, İP; Panciera, DL; Werre, SR Spontan Diabetes Mellitus'lu Köpeklerde Hipertansiyon, Proteinüri ve Retinopatinin Uzun Süreli Prevalansı. Vet. Stajyer. Med. 2014, 28, 488–495.

4. Muñana, KR Diabetes Mellitus'un Uzun Vadeli Komplikasyonları, Bölüm I: Retinopati, Nefropati, Nöropati. Veteriner. klinik N. Am. Küçük Animasyon Pratik 1995, 25, 715–730.

5. Struble, AL; Feldman, AK; Nelson, RW; Kass, PH Diyabetli Köpeklerde Sistemik Hipertansiyon ve Proteinüri. J. Am. Veteriner. Med. Doç. 1998, 213, 822–825.

6. Mazzi, A.; Fracassi, F.; Dondi, F.; Gentilini, F.; Famigli Bergamini, P. Diabetes Mellitus ve Hiperadrenokortisizmli Köpeklerde Üriner Proteinin Kreatinin'e ve Albüminin Kreatinin'e Oranı. Veteriner. Res. komün. 2008, 32 (Ek S1), S299–S301.

7. D'Amico, G.; Bazzi, C. Proteinürinin Patofizyolojisi. böbrek uluslararası 2003, 63, 809–825.

8. Banach, T.; Adaszek, Ł.; Wyłupek, D.; Winiarczyk, M.; Winiarczyk, S. Kütle Spektrometresi MALDI-TOF Kullanılarak İdrarın Proteomik Analizinde 2D Jel Elektroforezi ve Sıvı Kromatografinin Uygulanabilirliği. Pol. Vet. bilim 2013, 16, 587–592.

9. de Freitas Campos, C.; Cole, N.; Dyk, DV; Walsh, BJ; Diakos, P.; Almeida, D.; Torrecilhas, A.; Laus, JL; Willcox, Potansiyel Kanser Belirteçleri için Köpek Gözyaşlarının MDP Proteomik Analizi. Res. Veteriner. bilim 2008, 85, 349–352.

10. Winiarczyk, D.; Winiarczyk, M.; Winiarczyk, S.; Michalak, K.; Adazek, Ş. Diyabetik Köpeklerden Elde Edilen Gözyaşı Filminin Proteomik Analizi. Hayvanlar 2020, 10, 2416.

11. Winiarczyk, D.; Michalak, K.; Adazek, L.; Winiarczyk, M.; Winiarczyk, S. Babesiosis Sırasında Böbrek Yaralanması Olan Köpeklerin Üriner Proteomu. BMC Vet. Res. 2019, 15, 439.

12. Franco-Martínez, L.; Gelemenoviç, A.; Horvatiç, A.; Contreras-Aguilar, MD; Mrljak, V.; Cerón, JJ; Martínez-Subiela, S.; Tvarijonaviciute, A. Diabetes Mellitus'lu Köpeklerin Serum ve Tükürük Proteomu. Animasyon Açık Erişim J. MDPI 2020, 10, 2261.

13. Brandt, LE; Ehrhart, EJ; Scherman, H.; Olver, CS; Bohn, AA; Prenni, Köpek Üriner Proteomunun JE Karakterizasyonu. Veteriner. klinik Pathol. 2014, 43, 193–205. [CrossRef] [PubMed]

14. Ferlizza, E.; Isani, G.; Dondi, F.; Andreani, G.; Vasilyeva, K.; Bellei, E.; Almeida, AM; Matzapetakis, M. Köpeklerde Üriner Proteom ve Metabolom (Canis Lupus Familiaris): Kronik Böbrek Hastalığının Etkisi. J. Proteom. 2020, 222, 103795.

15. Van, JAD; Scholey, JW; Konvalinka, A. Üriner Proteomik ve Biyoinformatik Kullanarak Diyabetik Böbrek Hastalığına Bakış. J. Am. Sos. Nefrol. 2017, 28, 1050–1061.

16. Nabit, MB; Lees, GE; Dangott, LJ; Cianciolo, R.; Suchodolski, JS; Steiner, Progresif Glomerüler Hastalığın Köpek Modelinde Tubulointerstisyel Yaralanmanın Erken Aşamaları Sırasında Erkek Köpeklerden Alınan İdrarın JM Proteomik Analizi. Veteriner. klinik Pathol. 2011, 40, 222–236.

17. Pelander, L.; Brunchault, V.; Buffin-Meyer, B.; Klein, J.; Breuil, B.; Zürbig, P.; Magalhaes, P.; Mullen, W.; Elliott, J.; Syme, H.; et al. Köpeklerde Kronik Böbrek Hastalığı Tanısında Üriner Peptidom Analizleri. Veteriner. J.2019, 249, 73–79.

Dagmara Winiarczyk 1, Mateusz Winiarczyk 2 , Katarzyna Michalak 3 , Stanisław Winiarczyk 3 ve Łukasz Adaszek 3

1 Küçük Hayvanların İç Hastalıkları Bölümü, Lublin Yaşam Bilimleri Üniversitesi, 20-400 Lublin, Polonya

2 Department of Vitreoretinal Surgery, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland; winiarm86@gmail.com

3 Epizootiyoloji Bölümü, Lublin Yaşam Bilimleri Üniversitesi, 20-400 Lublin, Polonya; artica@wp.pl (KM); genp53@interia.pl (SW); ukaszek0@wp.pl (Ł.A.)