Bölüm Ⅱ Smad3 Eksikliği, E2F3-bağımlı Mekanizma Yoluyla Hücre Çoğalmasını Destekleyerek Diyabet ve Diyabetik Böbrek Hasarı İçin Adacık Tabanlı Tedaviyi İyileştiriyor
May 25, 2023
Yöntemler
1. Hayvanlar
Smad3-null (Smad3KO) fareleri, Prof. Chuxia Deng'in nazik bir hediyesidir ve C57BL/6 arka planında heterozigotlarda (Smad3 plus /- ) tutulur [20]. Smad3KO fareleri, Smad3 artı /- farelerinin çaprazlanmasıyla üretildi. C57BLKS arka planında Lepr (Leptin reseptörü) mutasyonuna sahip db/db fareleri, Hong Kong Çin Üniversitesi Hayvan Deney Merkezinden (CUHK) satın alınmıştır. Tüm hayvanlar, 12/12 saatlik bir gündüz/gece döngüsünde yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olan belirli bir patojen içermeyen (SPF) tesiste tutuldu. Bu çalışmadaki tüm hayvan manipülasyonları, CUHK Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından Ref. Hayır. 18-177-ÖBS.
2. Streptozosin (STZ) kaynaklı diyabetik fare modeli
8-10 haftalık erkek C57BL/6 farelerine, 5 sürekli gün boyunca günde 50 mg/kg/gün STZ intraperitoneal olarak enjekte edildi. Son STZ enjeksiyonundan 5 gün sonra, ardışık 2 gün boyunca 16 mM'den daha fazla stabil rastgele kan glukozuna sahip fareler, başarılı diyabet oluşumu olarak kabul edildi ve adacık nakli için alıcı fareler olarak kullanıldı.
3. Adacık izolasyonu, nakli ve diyabetik fenotipin değerlendirilmesi
Adacıklar, daha önce tarif edildiği gibi 8-10 haftalık erkek veya dişi Smad3 nakavt (KO) veya vahşi tip (WT) farelerden izole edildi [21]. Adacık transplantasyonunu gerçekleştirmek için, birkaç adacığın, Szot ve diğerleri tarafından açıklanan protokol izlenerek son STZ enjeksiyonundan sonraki 7. günde 4. haftada erkek db/db farelerinin veya STZ ile indüklenen diyabetik farelerin böbrek kapsülü altına nakledildiğini gösterdi [ 22]. Kısaca, alıcı fareye anestezi Kombosu (yüzde 1,5 ketamin ve 0, yüzde 15 ksilazin, 6 uL/g vücut ağırlığı) ile anestezi uygulandı. Bilinç kaybının ardından sol böbreği kaplayan ciltte 1 cm'lik kesi yapıldı. Böbreği nazikçe dışarı çekin ve ameliyat sırasında steril salinle nemli tutun. 25G iğne ile, bir çentik oluşturmak için kapsül üzerinde küçük bir çizik yapın. Belirtilen sayıda adacık, bir PE50 tüpü ile renal kapsüle iletildi. Sonuçta, adacıklar nakledildi, çentiği düşük ısıda dağlayarak kapatın. Böbreği değiştirin ve peritonu dikişlerle kapatın. Cildi zımba ile kapatın. Enfeksiyonu önlemek için intraperitoneal olarak 100 uL Penisilin-streptomisin solüsyonu (Gibco, kat# 15140122, ABD) enjekte edildi. Ağrıyı gidermek için 100 μL Tegmic kas içine enjekte edildi. Hayvan tamamen iyileşene kadar sıcak bir ortama alındı. Aynı operasyon prosedürü, sahte kontrol farelerinde, ancak adacık infüzyonu olmadan da gerçekleştirildi. Kuyruk ucu kanının hem rastgele hem de 6 saatlik açlık kan şekeri (RBG ve FBG) seviyeleri, taşınabilir bir şeker ölçer (Roche, ACCU-CHEK® Performa) ile haftalık olarak kontrol edildi. İnsülin direnç testi (IPITT), glikoz tolerans testi (IPGTT), HbA1c seviyeleri ve serum insülini daha önce tarif edildiği gibi [9] ölçüldü.
Almak için buraya tıklayınCistanche faydaları
4. Toplam üriner protein ve serum kreatinin
24 saatlik idrar metabolik bir kafeste toplandı. 24 saatlik toplam üriner protein, Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, cat# 5000201, ABD) ile nicelendirilen idrar hacmi ve idrar protein konsantrasyonu çarpılarak hesaplandı. Serum kreatinin, kreatinin niceleme kiti (Stanbio Laboratuvarı, kat# 0430-120, ABD) ile belirlendi.
5. Histopatoloji
Renal histopatolojik değişiklikler, daha önce tarif edildiği gibi Periyodik Asit-Schiff's (PAS) reaktifi ile paraformaldehitle sabitlenmiş, parafine gömülü kesitlerde (4 µm) incelenmiştir [23]. Mesangial matris genişlemesi, daha önce açıklandığı gibi nicel görüntü programı (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics) kullanılarak puanlandı [23].
6. İmmünohistokimya
Adacık taşıyan böbrek veya pankreas, yüzde 4 paraformaldehit içinde sabitlendi, parafine gömüldü ve 4 um'de kesildi. Rehidrasyondan sonra kesitler, 10 dakika boyunca 0.01 M sitrat (pH 6.0) içinde mikrodalga aracılı antijen geri kazanımı ile ve 1 saat boyunca yüzde 5 BSA içinde bloke etme ile işlendi . Birincil antikor inkübasyonu, gece boyunca 4 derecede gerçekleştirildi. Floresan boyama için, oda sıcaklığında (RT) 1 saat süreyle bir floresan sekonder antikor uygulandı. DAB aracılı termojenez için, antijen alımından önce 15 dakika boyunca yüzde 3 H2O2 bloke eden ek bir adım dahil edildi. Birincil antikor inkübasyonundan sonra HRP-konjuge polimer (Envision plus System, Dako, ABD) eklendi. E2F3'ün boyanması için EDTA-Tris solüsyonunda (pH 9.0) antijen geri kazanımı yapıldı. İmmünohistokimyada kullanılan antikorlar Tablo S2'de detaylandırılmıştır. Pozitif boyama alanı, Image J yazılımı (v1.47, NIH, ABD) ile ölçüldü.
Cistanche özü
7. Adacık taşıyan böbrekte aşılanmış hücre kütlesinin ölçümü
Adacık greftindeki hücre kütlesini yarı kantitatif olarak ölçmek için bölüm başına ortalama hücre alanı indeksi kullanıldı. Kısaca, adacıklar taşıyan böbrek (parafine gömülü), sagittal eksen boyunca art arda 4 um'de kesildi. 160 um aralıklarla sürekli kesitler, insülin için floresanla immüno-lekelendi. Her farede bölüm başına hücre alanının hesaplanması için insülin-pozitif lekeli en az 6 bölüm kullanıldı. Her bölümdeki insülin pozitif hücre alanı, Image J yazılımı (v1.47, NIH, ABD) ile ölçüldü. Her farede bölüm başına ortalama hücre alanı indeksi, toplam insülin pozitif alanın tüm bölümlere insülin pozitif bölümlerin sayısına bölünmesiyle hesaplandı.
8. Adacık hücrelerinin birincil kültürü
İzole edilmiş adacıklar, tek hücrelere ayrıldı ve 200 uL RPMI 1640 (Gibco, ABD) artı yüzde 10 FBS (Gibco, ABD) artı yüzde 1 Penisilin-streptomisin (Gibco, ABD) içinde 96-kuyu plakasına ekildi. 20 mM glikoz ile desteklenmiştir. Adacık hücreleri, belirtilen süre boyunca 37 derece, yüzde 5 CO2 ve yüzde 100 nem ayarlı bir inkübatörde kültürlendi. E2F3'ün adenovirüs aracılı yıkımı için, ayrışmış adacık hücreleri, fare E2F3'ü (shE2F3) hedefleyen adenovirüs aşırı eksprese eden kısa firkete RNA (shRNA) veya kontrol spesifik olmayan shRNA'yı (gösterilmiştir) içeren bir ortamda 2 için hücre başına 10 pfu'luk bir titrede kültürlendi. günler, ardından orta değiştirme. shE2F3 dubleksinin gövde dizisi, 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3' idi. 50 adacıktan dağılmış hücreler, immün boyama ve RT-PCR için oyuk başına ve daha önce tarif edildiği gibi yürütülen Western blot için oyuk başına 100 adacık tohumlandı [9].
9. İn vivo ve in vitro BrdU etiketlemesi
İn vivo BrdU işaretlemesi gerçekleştirmek için, farelere adacık transplantasyonundan sonraki 2. günden itibaren 7 gün boyunca 50 mg/kg/gün BrdU (PBS içinde) intraperitoneal olarak enjekte edildi ve son enjeksiyondan 2 saat sonra öldürüldü. İn vitro BrdU etiketlemesi için, dağılmış adacık hücreleri 48 saat kültürlendi, ardından 10 uM BrdU içeren taze ortamla değiştirildi ve 24 saat daha kültürlendi. Dokuda ve kültürlenmiş hücrelerde BrdU'ya karşı floresan immün boyama daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [9].
Cistanche tozu
10. RNA-Seq
Adacıklar, Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m ve Smad3KO-db/m farelerinden izole edildi. Her genotip için, 5'ten fazla fareden alınan adacıklar, RNA izolasyonu için havuzlandı. RNA, miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Almanya) ile hazırlandı. RNA-seq ve akış aşağı veri analizi daha önce tarif edilmişti [9]. Belirli bir genin ekspresyon seviyesi, milyon haritalanmış okuma (FPKM) başına transkript kilobazı başına fragmanlar olarak sunuldu. Diferansiyel olarak eksprese edilen gen (DEG), iki grup arasındaki FPKM'nin 2 katına eşit veya daha büyük olarak tanımlandı. Yukarı regüle edilmiş ve aşağı regüle edilmiş DEG'ler birleştirildi ve varsayılan ayarlarla çevrimiçi DAVID biyoinformatik kaynakları (v6.8) ile Gene Ontology (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yolu zenginleştirme analizi için kullanıldı. GOTERM_BP_DIRECT alt kategorisi, GO analizi için kullanıldı.
11. İmmünopresipitasyon
Fare adacıklarında immünopresipitasyon gerçekleştirmek için, yaklaşık 500 yeni izole edilmiş adacık, 500 mL RIPA tamponunda parçalandı. Bir tavşan anti-Smad3 antikoru (2 ug) veya tavşan IgG izotipi ilave edildi ve 4 derecede hafif döndürme ile gece boyunca inkübe edildi. Daha sonra 20 μL protein A agaroz boncukları (Beyotime, kat# P2051, Çin) eklendi ve 2 saat 4 derecede inkübe edildi. Taze RIPA tamponu ile sağlam bir şekilde yıkandıktan sonra, bağlı protein, 1xSDS yükleme tamponunda denatüre edilerek serbest bırakıldı ve Western blot analizine tabi tutuldu. IgG ağır zincirinin etkisinden kaçınmak için, çökeltilmiş Smad3 proteinini tanımak için hafif zincire özgü bir fare anti-tavşan IgG'si (HRP konjuge, Abmart, kat# M21006, Çin) kullanıldı.
12. Kromatin immünopresipitasyon-ChIP
Fare adacıklarında ChIP gerçekleştirmek için, 8-10 haftalık C57BL/6 farelerinden yaklaşık 2000 adacık toplandı ve bir ChIP preparasyonu olarak kullanıldı. Yeni izole edilmiş adacıklar, RPMI 1640 artı yüzde 1 FBS artı yüzde 1 Penisilin-streptomisin içinde 15 dakika boyunca 10 ng/mL TGF- 1 (Gibco, ABD) ile uyarıldı. ChIP, önerilen talimat izlenerek SimpleChIP® Plus Enzimatik Kromatin IP Kiti (CST, ABD) ile gerçekleştirildi. ChIP tahlilinde kullanılan antikorlar ve primerler Tablo S1 ve S2'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Standart Cistanche
13. Çift lusiferaz raportör testi
Fare E2F3 promotörü (-1000 ila artı 451 bp), pGL3-temel vektörüne (pGL3-E2F3.Pro) klonlandı. Eşzamanlı olarak, pGL3- E2F3.Pro'yu oluşturmak için Smad3 bağlanma sahasının nokta mutasyonu gerçekleştirildi. Mut. Çift lusiferaz raportör tahlilini gerçekleştirmek için, HEK293T hücreleri kuyucuk plakasına 5 x 104 hücre/kuyu yoğunlukta ekildi. Ertesi gün hücreler, pcDNA3 ile birleştirilmiş 500 ng pGL3-Basic veya pGL3-E2F3.pro veya pGL3-E2F3.pro.mut ile transfekte edildi.1-Smad3, fosfat kalsiyum yöntemiyle fare Smad3'ü aşırı eksprese eden veya etmeyen (Şekil 10F'de gösterildiği gibi). Her tedavide transfeksiyon dozunu dengelemek için pEGFP-C1 vektörü desteklendi. Renilla luciferase'ı ifade eden 10 ng pGL4.73.huc/SV40 vektörü, transfeksiyon etkinliğini normalleştirmek için her tedaviye dahil edildi. Transfeksiyondan 6 saat sonra ortam değiştirildi, ardından 48 saat daha inkübasyon yapıldı. Hücreler parçalandı ve lusiferaz aktivitesi, Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, ABD) ile belirlendi ve bir luminometrede (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, ABD) ölçüldü. Klonlanmış E2F3 promotörünün transkripsiyonel aktivitesi, ateşböceği lusiferazının renilla lusiferazına değer oranı olarak sunuldu. Her tedavi üç kopya halinde gerçekleştirildi.
14. İstatistikler
Veriler ortalama ± SD olarak sunuldu ve SPSS yazılımı (16.0) ile analiz edildi. Verilerin normalliği One-Sample Kolmogorov-Smirnov testi ile kontrol edildi. Gruplar arasındaki varyansların homojenliği Levene istatistiği ile test edildi. İki grup arasındaki karşılaştırma için Student t testi kullanıldı. Çoklu gruplar arasında karşılaştırma için, eşit bir varyans varsayılırsa LSD testi ile tek yönlü ANOVA kullanıldı. Varsayılmayan eşit varyans için, alternatif bir Welch testi istatistiği ve ardından Tamhane'nin T2 testi ile çoklu karşılaştırmalar kullanıldı. P < 0.05, istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Cistanche takviyeleri
Sonuçlar
Smad3 eksikliği, hem T1DM hem de T2DM için adacık replasman tedavisini büyük ölçüde iyileştirir ve diyabetik böbrek hasarına karşı korur. Geliştirilmiş E2F3-bağımlı hücre proliferasyonu, hem T1DM hem de T2DM'de Smad3KO adacık tedavisinin temel bir mekanizması olabilir. Bu nedenle Smad3KO hücre replasman tedavisi, klinik olarak diyabet için daha iyi bir terapötik strateji olabilir.
Referanslar
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinik pankreas adacık nakli. Nat Rev Endokrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Diyabet tedavileri için fonksiyonel pankreas hücrelerine insan pluripotent kök hücre farklılaşması: Yenilikler, zorluklar ve gelecekteki yönler. J Biol Müh. 2017; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Klinik adacık nakli sonrası histolojik greft değerlendirmesi. Transplantasyon. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Renal fibroz ve inflamasyonda TGF-beta/Smad'lerin çeşitli rolleri. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. Renal fibrozda TGF-beta/Smad sinyali. Ön Fizik. 2015; 6: 82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Küçük bir sinyalleşme ağı, adacık hücre çoğalmasını düzenler. Diyabet. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. TGF-beta Sinyalinin İnhibisyonu İnsan Pankreatik beta-Hücre Çoğalmasını Teşvik Eder. Diyabet. 2016; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. DYRK1A, SMAD ve Trithorax Yollarının Kombine İnhibisyonu, Yetişkin İnsan Beta Hücrelerinde Güçlü Çoğalmayı Teşvik Etmek İçin Sinerji Oluşturur. Hücre Metab. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH ve diğerleri. Smad3 eksikliği, Pax6 ekspresyonunu geri yükleyerek db/db farelerde beta hücre çoğalmasını ve işlevini destekler. teranostik. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Murin adacık izolasyonu ve subkapsüler böbrek nakli için bir yöntem. J Vis Uzm. 2011.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Adacık izogreft nakli, tip 2 diyabetli bir murin modelinde insülin duyarlılığını artırır. Endokrin. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. p16ink4a ve p19ARF'nin TGFbeta1 tarafından uyarılması, fare keratinositlerinde büyümenin durmasına ve yaşlanma tepkisine katkıda bulunur. Mol Karsinog. 2009; 48: 181-6.
13. Boyacı MA, Cepko CL. Retina gelişimi sırasında proliferasyonu düzenlemek. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. E2F'nin pRB ailesi proteinleri tarafından düzenlenmesi. Gene Dev. 1998; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. TGFbeta Reseptör Sinyalinin Geçici Olarak Bastırılması, İnsan Adacık Transplantasyonunu Kolaylaştırır. Endokrinoloji. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Fare pankreatik beta hücrelerinde SMAD2 bozulması, ATP'ye duyarlı K artı kanal aktivitesinin zayıflamasına bağlı olarak adacık hiperplazisine ve bozulmuş insülin sekresyonuna yol açar. diyabetoloji. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. E2F3'ün aşırı ekspresyonu, apoptozu indüklemeden fonksiyonel insan beta hücrelerinin çoğalmasını teşvik eder. Hücre döngüsü. 2013; 12: 2691-702.
18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. Hücre Çoğalmasının ve Hayatta Kalmasının Kontrolünde TGF-beta Ailesi Sinyali. Soğuk Kaynak Harb Perspektif Biol. 2017; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetes mellitus--insan beta hücresi çoğalmasındaki ilerlemeler ve zorluklar. Nat Rev Endokrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. SMAD3'ün hedeflenen bozulması, bozulmuş mukozal bağışıklığa ve T-hücresinin TGF-beta'ya verdiği yanıtın azalmasına neden olur. EMBO J.1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Fare pankreasından adacık izolasyonu için bir protokol. Nat Protokolü 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Pankreas adacıklarının diyabetik farelerin böbrek kapsülüne nakli. J Vis Uzm. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q ve diğerleri. Smad3'ün silinmesi, tip 2 diyabetik nefropatide renal fibrozu ve enflamasyonu önler. Metabolizma. 2020; 103: 154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 ve Hui-Yao Lan2,7
1 Entegre Tıp Araştırma Merkezi ve Nefroloji Bölümü, Güneybatı Tıp Üniversitesi Bağlı Geleneksel Çin Tıbbı Hastanesi, Luzhou, Sichuan, 646000, Çin.
2. Tıp ve Tedavi Departmanı ve Li Ka Shing Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Hong Kong Çin Üniversitesi, Hong Kong, 999077, Çin.
3. Guangdong-Hong Kong Ortak İmmünolojik ve Genetik Böbrek Hastalıkları Laboratuvarı, Guangdong İl Halk Hastanesi, Guangdong Tıp Bilimleri Akademisi, Guangzhou, Guangdong, 510080, Çin.
4. Eyalet Anahtar Biyoelektronik Laboratuvarı, Jiangsu Biyomateryaller ve Cihazlar için Temel Laboratuvar, Biyolojik Bilimler ve Tıp Mühendisliği Okulu, Güneydoğu Üniversitesi, Nanjing, Çin.
5. Zhanjiang Şehri Kronik Böbrek Hastalığının Önlenmesi ve Yönetimine İlişkin Temel Laboratuvar, Nefroloji Enstitüsü, Guangdong Tıp Üniversitesi Bağlı Hastanesi, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Çin.
6. Ulusal Geleneksel Çin Tıbbı Klinik Araştırma Üssü, Güneybatı Tıp Üniversitesine Bağlı Geleneksel Çin Tıbbı Hastanesi, Luzhou, Sichuan, 646000, Çin.
7. CUHK-Guangdong İl Halk Hastanesi İmmünolojik ve Genetik Böbrek Hastalıkları Ortak Araştırma Laboratuvarı, Hong Kong Çin Üniversitesi, Hong Kong, 999077, Çin.