Bölüm 1: Euphorbiae Ebracteolatae Radix'ten Total Diterpenoidlerin Anti-Malign Asit Etkisi, Böbrekte PKC Aktivitesini İnhibe Ederek Aquaporinlerin Değişikliklerine Atfedilebilir
May 18, 2022
Daha fazla bilgi için. temastina.xiang@wecistanche.com
Soyut: Bu çalışmada Euphorbiae ebracteolate Radix'ten (TDEE) ekstrakte edilen total diterpenoidlerin malign asit fareler üzerindeki anti-asit etkisi değerlendirilmiş ve altta yatan mekanizma aydınlatılmıştır. TDEE diklorometan ile ekstrakte edildi ve kolon kromatografisine tabi tutuldu. TDEE'den izole edilen altı diterpenoidin saflığı HPLC tarafından %77.18 olarak belirlenmiştir. TDEE (3 ve 0.6 g çiğ otlar / kg, p.o.) asit azalttı ve idrar çıkışını arttırdı. Bu arada, tümör hücresi canlılığı, döngüsü ve apoptozunun analizi, TDEE'nin olmadığını göstermiştir.AntitümörEtkinlik. Ek olarak, aquaporinlerin (AQP'ler) ekspresyon seviyeleri ve protein kinaz C (PKC) membran translokasyon seviyeleri α ve PKCβböbreklerve hücreler ölçüldü. TDEE, AQP1-4 seviyelerini azalttı ve membran fraksiyonunda PKCβ ekspresyonunu inhibe etti. Bileşik 2 hariç dört ana diterpenoid, insan böbrek-2 hücrelerinde AQP1 seviyelerini düşürdü. Bileşik 4 ve 5, murin iç medüller toplayıcı kanal hücrelerinde AQP2-4 ekspresyonunu inhibe etti. AQP1-4 ekspresyonunun diterpenoid kaynaklı inhibisyonu forbol-12-miristat-13-asetat (PMA; PKC'nin agonisti) tarafından bloke edildi. TDEE'den diterpenoidler ana anti-asit bileşenleridir. Diterpenoidlerin anti-asit etkisi, diürezi teşvik etmek için böbreklerdeki AOP'lerdeki değişikliklerle ilişkili olabilir. AOP1-4 ekspresyonunun TDEE tarafından inhibisyonu, PKCβ aktivasyonunun inhibisyonu ile ilgilidir.
Anahtar kelime -ler: Euphorbia ebracteolate Hayata; diürez; biyoaktif bileşenler; terpenoidler; böbrek hücreleri; PKC inhibitörü
Cistanche otunun faydalarını öğrenmek için tıklayın
1. Giriş
Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH), Euphorbiaceae familyasındaki Euphorbia cinsinin bir üyesidir ve geleneksel Çin tıbbında (TCM) abdominal distansiyon ve ödem, paraziter enfeksiyon, tüberküloz ve diğer hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır [1]. EEH (EER) kökü, etkili bileşenler olarak kabul edilen çeşitli terpenoidler içerir. Terpenoidler üzerinde yapılan son çalışmalar, terpenoidlerini belirlemek için yapılmıştır.anti-enflamatuar,Antiviral,anti-tüberküloz ve diğer etkileri in vitro [2-5]. Bununla birlikte, EER'nin abdominal distansiyon ve ödem tedavisinde geleneksel etkileri üzerine temel araştırma araştırmaları sınırlıdır. TCM teorisine göre EER, idrara çıkma ve ishali teşvik ederek abdominal distansiyon ve ödemi hızla ortadan kaldırabilir [6]. Önceki çalışmalarımız, EER'den (TDEE) total diterpenoidlerin, aquaporin (AQP)-1 ve AQP3 ekspresyonunu düzenleyerek ishale neden olabileceğini göstermiştir [7]. Bununla birlikte, bugüne kadar, EER'deki anti-asitlerin etkili maddeleri belirsizliğini korumaktadır.
Abdominal distansiyon ve ödem modern tıpta asit olarak tanımlanmaktadır. Asit, periton sıvısının patolojik birikimidir [8]. Siroz, tümör, kalp yetmezliği ve nefrotik sendrom gibi asit oluşumunun birçok nedeni vardır [9]. Asit oluşumu, splanknik arteriyel vazodilatasyona, etkili dolaşım hacminde azalmaya, endojen vazokonstriktör sistemlerin aktivasyonuna ve böbreklerde hevesli su tutulmasına yol açan portal hipertansiyon ile ilişkilidir [10]. AQP'ler, epitel ve endotel bariyerlerini geçmek için suyun hızlı membran taşıyıcılarıdır ve bu nedenle su dengesinin korunmasında temel bir rol oynarlar [11]. Çok sayıda çalışma, AQP'lerin asit oluşumunda ve bozukluğunda kilit bir rol oynadığını göstermiştir [12-15]. Böbreklerde AQP1, AQP2, AQP3 ve AQP4 [16] gibi birçok AQP türü vardır. TDEE, bağırsaktaki AQP'lerin ekspresyonunu düzenleyebildiğinden [7], TDEE'nin böbreklerdeki AQP'leri düzenleyerek asit tedavisinde kullanılabileceğini öneriyoruz.
AQP'ler idrar oluşumunda kritik bir rol oynamaktadır, ancak böbreklerde AQP ekspresyonunu düzenleme mekanizmaları açıklığa kavuşturulmamıştır. Şu anda, sadece sınırlı sayıda rapor, AQP'lerin protein kinaz C (PKC) ve protein kinaz A (PKA) yolları ile düzenlendiğini göstermektedir [17-20]. Euphorbia'dan izole edilen bazı terpenoidler (örneğin, destek ve ingenol 3-angelat) PKC üzerinde düzenleyici etkilere sahiptir. TDEE, böbreklerdeki AQP ekspresyonunu PKC yolu ile düzenleyebilir.
Bu çalışmada, TDEE'yi çıkardık ve asit önleyici farelerin böbreklerindeki analize AQP ekspresyonu, PKC ve PKA aktivitelerinin yanı sıra anti-asit etkisini değerlendirdik. Daha sonra, iki tür AQP proteini ve mRNA ekspresyon seviyeleri üzerindeki etkilerini araştırmak için TDEE'den ana diterpenoidleri izole ettik ve saflaştırdık.böbrek hücreleri(insan böbrek-2 hücreleri (HK-2) ve murin iç medüller toplayıcı kanal hücreleri (mIMCD3)). Son olarak, böbreklerdeki AQP'lerin ekspresyonunun PKC yolu tarafından düzenlenip düzenlenmediğini belirlemek için PKC yolunu aktive etmek için forbol-12-miristat-13-asetat (PMA; PKC'nin agonisti) kullanan bir diterpenoid bileşik (öphebracteolatin A) seçiyoruz. Bu çalışmada TDEE'nin EER'de anti-asit etkisinin belirlenmesi ve EER'nin klinik olarak uygulanması ile diürez ve anti-asit etkileri için aday ilaçların belirlenmesi için bir temel oluşturulması amaçlanmıştır.
2. Sonuçlar
2.1.TDEE'nin Assitik Sıvı Ağırlığı, İdrar Ağırlığı ve Fekal Su İçeriği Üzerine Etkileri
Asit farelerin toplam EER (TEER) ve TDEE ekstresi (3 ve 0.6 g çiğ otlar / kg, p.o.) ve furosemid (pozitif ilaç) ile tedavisi, model grubuna kıyasla asit sıvı ağırlığındaki artışı önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 1A). Şekil 1C'de idrar ağırlıklarının anlamlı olduğu görüldü (p<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">
2.2. Assitik Farelerde TDEE'nin Serum Albümin Düzeylerine Etkileri
Serum albümin, omurgalı plazmasında en bol bulunan proteindir ve kanın ozmotik basıncını koruyabilir ve su taşınımını düzenleyebilir. Şekil 1B, model farelerde asit üretiminin serum albümininde normal gruba göre anlamlı bir azalmaya neden olduğunu göstermiştir. Furosemid, TEER ve TDEE (3 ve 0.6 g çiğ otlar / kg, po) ile tedaviden sonra, serum albümin seviyeleri model gruba kıyasla etkili bir şekilde geri kazanıldı. NTDEE gruplarında bu indekste iyileşme gözlenmedi.
2.3.TDEE'nin Assitik Farelerde Tümör Hücresi Canlılığı, Döngüsü ve Apoptozu Üzerine Etkileri
Malign asitlerde, tümör hücreleri asit sıvısında yüzer. Asitteki azalmanın TEER ve TDEE'nin antikanser aktivitesi ile ilişkili olup olmadığını değerlendirdik. Sonuçlar, bu ilaçların tümör hücresi canlılığını inhibe etmediğini (Şekil 2A) ve hücre döngüsü durmasına (Şekil 2B) ve apoptoza (Şekil 2C, D) yol açmadığını göstermiştir.
2.4.TDEE'nin Asit Farelerin Böbreklerinde AQP Ekspresyonu Üzerine Etkileri
Böbrek, su emilimi ve idrar konsantrasyonu için önemli bir organdır. AQP su kanalları böbreklerdeki suyun hızlı taşınmasına aracılık eder. Bu nedenle, böbreklerdeki AQP'lerin ekspresyonunu inceledik. Şekil 3, asitin artmasının böbreklerdeki AQP ekspresyonu üzerinde normal gruba kıyasla çok az etkisi olduğunu göstermiştir. TEER ve TDEE ile tedavi edildiğinde, AQP1, AQP2, AQP3 ve AQP4 proteinlerinin ekspresyonu, çoğu dozda model grubundan belirgin şekilde daha düşüktü. TEER, 3.0 ve 0.6g çiğ otlar / kg dozlarında AQP2, AQP3 ve AQP4 ekspresyonunda önemli bir azalmaya neden olurken, AQP1 ekspresyonu sadece düşük dozda (0.6g çiğ otlar / kg) azaltılmıştır. Özellikle, TDEE, iki dozda TEER ile AQP3 ve AQP4 ekspresyonu üzerinde aynı inhibitör etkilere sahipti. TDEE ve TEER arasındaki fark, TDEE'nin AQP1 ve AQP2'nin ekspresyonunu sadece yüksek dozda (3g çiğ otlar / kg) inhibe etmesidir. NTDEE'nin böbreklerdeki AQP seviyeleri üzerinde zayıf etkileri vardı ve sadece 3g çiğ otlar / kg'lık bir dozda AQP4 proteininin ekspresyonunu düzenledi.
2.5.TDEE'nin Asit Farelerin Böbreklerinde PKC ve PKA Aktivasyonu Üzerine Etkileri
Önceki çalışmalar, AQP ekspresyonunun PKC ve PKA aktivasyonu ile düzenlenebileceğini göstermiştir. TDEE'nin PKC-a, PKC-β ve PKA aktivasyonu üzerindeki etkilerini inceledik. PKC aktivasyonu, sitosolden hücre zarına translokasyonu ile ölçüldü. Şekil 4A ve B'de gösterildiği gibi, membran fraksiyonundaki PKC-β protein ekspresyon seviyesi TDEE gruplarında anlamlı olarak azalırken, PKC-α membran proteininin ekspresyon seviyesi üzerinde anlamlı bir etkisi yoktu. Fosfolipaz C (PLC), PKC'nin aktivasyonuna aracılık eden önemli bir yukarı akış sinyal molekülüdür. TDEE tedavisinin fosforile ve total PLC düzeyleri üzerinde herhangi bir etkisi yoktu (Şekil 4D). PKA, iki düzenleyici alt birime bağlı iki katalitik alt birimden oluşan bir heterotetramerdir. Katalitik alt birimlerin serbest bırakılması, PKA aktivasyonunun ayırt edici bir özelliğidir. Şekil 4C'de TDEE, PKA katalitik alt birimlerinin ekspresyonunu etkilemedi.
2.6.TDEE'deki Altı Diterpenoidin İçeriğinin Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile Belirlenmesi
Hayvan deneylerinin sonuçları, TDEE'nin EER'nin ana etkili fraksiyonu olduğunu göstermiştir. TDEE'den altı diterpenoidi (1 ila 6 arasındaki bileşiklerin yapıları Şekil 5'te gösterilmiştir; spektral veriler Ek Materyale eklenmiştir) izole ettik ve bu bileşikleri TDEE'deki diterpenoidlerin içeriğini belirlemek için standart olarak kullandık. TDEE için HPLC kromatogramları ve altı diterpenoid standardı Şekil 6'da sunulmuştur. 1'den 6'ya kadar olan bileşiklerin içeriği sırasıyla% 1.07,% 12.00,% 12.69,% 9.15,% 39.26 ve% 3.02 idi ve TDEE'nin% 77.18'ini oluşturuyordu.
2.7.TDEE'den Diterpenoidlerin Böbrek Hücrelerinde AQP Ekspresyonu Üzerine Etkileri
TDEE, böbreklerde AQP1, AQP2, AQP3 ve AQP4 ekspresyonunu azaltarak asitleri inhibe eden EER'nin aktif fraksiyonuydu. Aynı zamanda, TDEE ayrıca insan böbrek-2 hücrelerinde (HK-2) ve murin iç medüller toplama kanalı hücrelerinde (mIMCD3) AQP1, AQP2, AQP3 ve AQP4'ün protein ve mRNA ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 7). TDEE'nin ana bileşenleri diterpenoidlerdir. TDEE ve diterpenoidler karışımı arasındaki etkileri karşılaştırdık (TDEE'deki içeriklerine göre altı izole diterpenoid karıştırıldı). Sonuçlar, diterpenoid karışımı ve TDEE'nin AQP1, AQP2, AQP3 ve AQP4 ekspresyonu üzerindeki inhibitör etkilerinin benzer olduğunu göstermiştir (Şekil 7). TDEE'den dört ana diterpenoidin aktiviteleri in vitro olarak değerlendirildi. Şekil 8 ve 9, HK-2 hücrelerinde AQP1'in protein ve mRNA ekspresyon seviyelerinin, 3,4 ve 5 numaralı bileşikler tarafından önemli ölçüde azaldığını göstermiştir. Bileşik 2 ile tedavi, protein ve mRNA seviyelerinde AOP1'de kayda değer bir azalmaya neden olmamıştır. Bu bileşikler için, bileşik 3 (bir ent-abietan tipi diterpenoid) diğer bileşiklerden daha aktifti. mlMCD3 hücrelerinde, dört diterpenoid bileşik, AQP2, AQP3 ve AQP4 ekspresyonunun farklı derecelerde inhibisyonunu indükledi. Protein ve gen ekspresyonunun sonuçları Şekil 8 ve 9'da sunulmuştur. Bileşik 4 ve 5, gen ve protein seviyelerindeki kontrol grubuyla karşılaştırıldığında güçlü AQP2, AQP3 ve AQP4 inhibitör etkilerine sahipti. Bileşik 2 ve 3 sadece Aqp2, Aqp3 ve Aqp4 mRNA ekspresyonu üzerinde farklı etkiler göstermiştir.
2.8.PKC Aktivatörünün AQP'lerin Diterpenoid Kaynaklı İnhibisyonu Üzerine Etkileri
Hayvan deneyinden elde edilen sonuçlar, TDEE'nin aynı anda H22 tümör hücresi taşıyan farelerin böbreklerinde PKCβ aktivitesini ve AQP ekspresyonunu inhibe ettiğini göstermiştir. PKC'nin böbrek hücrelerinde AQP'lerin ekspresyonunu düzenleyip düzenlemediğini daha da açıklığa kavuşturmak için, PKC agonisti (PMA), HK-2 ve mIMCD3 hücrelerinde diterpenoid (Euphebracteolatin A) stimülasyonundan önce 1.5 saatte ön işlem gördü. Membran PKCβ, AOP1, AOP2, AOP3 ve AOP4 ekspresyonunda değişiklik tespit edildi. Western Bolt sonuçları, öfefrakteolatin A'nın membran PKCβ, AOP1, AOP2, AOP3 ve AOP4'ün protein ekspresyonunu azaltabileceğini ve etkilerin PMA ön işlemi ile azaltılabileceğini göstermiştir (Şekil 10).
