2. Bölüm: Böbrek Hasarı Molekülü-1 SARS-CoV için Potansiyel Bir Alıcıdır-2

Daha fazla bilgi için. İletişimtina.xiang@wecistanche.com

Koronavirüsün klinik belirtileri

1. Kuluçka süresi uzundur ve ana semptomlar ateş, yorgunluk, boğaz ağrısı ve öksürüktür. Ateş, yüksek ateş, orta ateş veya düşük ateş olabilir;

2. Bebekler ve yaşlılar tipik değildir ve sıklıkla hırıltı ve nefes darlığı eşlik eder. Ciddi durumlarda, çoklu sistem hasarı meydana gelebilir;

3. Erken evredeki kuru öksürük, uykuyu ve aktiviteleri etkileyen boğmacaya benzer şekilde çoğunlukla paroksismal ve şiddetlidir; sonraki aşamada öksürük balgamdır, balgam kısırdır, bazen az miktarda kan içerir ve bazılarına hırıltı eşlik eder;

4. Bazı hastalarda hafif semptomlar vardır ve ateşi olmayabilir. Çoğu hasta iyi bir prognoza sahiptir ve az sayıda hasta kritik derecede hastadır ve hatta ölmektedir;

5. Akut solunum sıkıntısı sendromu, septik şok, dirençli metabolik asidoz ve pıhtılaşma bozukluğu.

Yeni koronavirüs nasıl önlenir, kişinin kendi bağışıklığını geliştirmesi, insanların virüsle savaşmasının en etkili yoludur. Antik çağlardan beri besleyici bir hazine olarak kullanılan Cistanche, "çölginseng" ve bağışıklığı güçlendirmenin kralıdır. Cistanche - Bağışıklığı Güçlendirmenin Kralı

Modern tıbbi araştırmalar, vücudu besleme ve güçlendirme işlevlerine ek olarak, Cistanche'nin tümörleri önlemede, yaşlanmayı geciktirmede, aritmiyi önlemede, apoptozu önlemede ve bağışıklığı iyileştirmede önemli iyileştirici etkileri olduğunu kanıtlamıştır. iyilik.

buCistanche'nin toplam glikozitleriSadece normal insanlar için değil, aynı zamanda düşük bağışıklık fonksiyonu olan insanlar için de bağışıklık fonksiyonunu iyileştirebilen bağışıklık fonksiyonunu düzenleyen ginseng'in aktif bileşenleridir.

Klinik gözlem, Cistanche'nin kötü huylu tümörler üzerinde belirli bir iyileştirici etkiye sahip olduğunu ve lökositleri artırmanın bariz etkisine sahip olduğunu doğrulamıştır. Radyoterapi ve kemoterapi sırasında ginseng almak, radyoterapi ve kemoterapinin toksik ve yan etkilerini azaltabilir, hasarlı dokunun onarımını hızlandırabilir ve lökopeniyi önleyebilir;

Tartışma

karşı savaşmak içinCOVID-19 salgını, nasıl derin bir anlayışSARS-CoV-2insan hücrelerini istila etmesi garantilidir. Çalışmalar, SARS-CoV'nin-2 doğrudan bulaştığını göstermiştir.böbrekakciğere ek olarak (Braun ve diğerleri, 2020; Farkash ve diğerleri, 2020). Bununla birlikte, ACE2, bu istilaya aracılık edebilen iyi tanınan tek reseptör olmaya devam etmektedir. Ayrıca, SARS-CoV-2 ve ilişkili böbrek tropizmiböbrek hasarıviral istila üzerine nispeten azalmış ACE2 seviyesi ile açıklanamaz görünmektedir (Kuba ve diğerleri, 2005). Burada, çalışmamız böbrek hasarı için büyük ölçüde düzenlenmiş bir biyobelirteç olan KIM1'in (Yang ve diğerleri, 2015), bir reseptör olarak SARS-CoV-2 böbrek istilasına aracılık ettiğini ileri sürmektedir.

Ayrıca SARS-CoV-2-RBD'nin KIM1'e SARS-CoV-RBD ve MERS-COV-RBD'den daha yüksek bir afiniteyle bağlandığını ve muhtemelen SARS-CoV'un daha güçlü bulaşmasının temelini oluşturduğunu da bulduk-2 (Rabaan ve diğerleri, 2020); bu nedenle böbrek enfeksiyonu ve KIM1'in bu ağır solunum yolu hastalıklarındaki rolleri tekrar gözden geçirilmeye değerdir. Özellikle, sonuçlarımız viral RBD üzerinde KIM1 ve ACE2'nin farklı bağlanma bölgeleri olduğunu göstermektedir, bu nedenle KIM1 ve ACE2'nin bu organlarda SARS-CoV-2 istilasına aracılık edip etmediğini ve nasıl aracılık ettiğini araştırmaya değer. Ek olarak, KIM1, klatrin bağımlı yollar yoluyla endositozlandığından (Zhao ve diğerleri, 2016), hücre zarına viral bağlanmadan sonra KIM'e 1-bağımlı süreci daha fazla araştırmak da ilginç olacaktır.

ACE2, SARS-CoV-2 için en iyi çalışılmış reseptördür, ancak birden fazla organda yaygın olarak ifade edildiğinden ve kan basıncını düzenlemede önemli roller oynadığından, COVID-19 için ideal bir terapötik hedef değildir. ve kalp/böbrek hasarını önleme (Imai ve diğerleri, 2005; Li ve diğerleri, 2020d). Buna karşılık, KIM1'in böbrek fonksiyonu ile daha güçlü bir ilişkisi vardır ve yalnızcaböbrek hasarı(Kondratowicz ve diğerleri, 2011; Yuan ve diğerleri, 2015; Costafreda ve Kaplan, 2018), bu da onu böbrek hastalığı olan COVID-19 hastaları için daha spesifik ve belki de daha güvenli bir terapötik hedef haline getirir.

Özetle, verilerimiz, SARS-CoV-2 için potansiyel bir reseptör olarak SARS-CoV-2 renal tropizmde KIM1'in çok önemli bir rolü olduğunu göstermektedir. Burada, COVID-19 hastalarında SARS-CoV-2'un renal tropizmini açıklayabilen KIM1 ve ACE2'nin aracılık ettiği bir 'kısır döngü' modeli (Şekil 5G) öneriyoruz. SARS-CoV-2 istilasının ilk aşamasında, daha yüksek fizyolojik seviye (Ek Şekil S1) ve bağlanma afinitesi (Ek Tablo S1), ACE2'yi böbreğe özgü olmayan birincil hedef yapar. Bununla birlikte, virüs kaynaklı AKl'nin başlangıcından sonra, ortaya çıkan büyük ölçüde yukarı regüle edilmiş KIM1, daha böbreğe özgü olan ve sonuç olarak bir kısır döngüde böbrek hasarını şiddetlendiren KIM1 ve ACE2'nin aracılık ettiği ikincil bir viral enfeksiyonu hızla teşvik eder (Şekil 5G). Anti-KIM1 antikorları, küçük molekül inhibitörleri ve KIM1-türevi antagonist peptitler dahil olmak üzere SARS-CoV-2 ve KIM1 arasındaki etkileşimi kırabilecek yaklaşımlar, COVID-19'a ışık tutabilir. tedavi.

Malzemeler ve yöntemler

Malzemeler

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >Yüzde 95), Genscript ile kimyasal olarak sentezlendi. Anti-fare-lgG antikoru (p/n 18-8816-33) ve anti-tavşan-lgG antikoru (p/n 18-8817-33) Rockland'dan elde edildi. SureBeads ile IgG" Protein G manyetik boncukları (J2112LB-02) Bio-Rad'dan satın alındı. DAPI (D9542) Sigma'dan alındı. Alex Flour 594 etiketli phalloidin (C2205S) Beyotimes'tandı. KIM1'e karşı antikorlar (NBP{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) ve ACE2 (2115-1-AP, Proteintech) kullanıldı.

KIM1 ve ACE2'nin ifade profillerinin elde edilmesi ve analizi

İnsan dokuları için KIM1 ve ACE2'nin kapsamlı transkriptom ve protein profillerini elde etmek için, İnsan Protein Atlası'ndan (HPA, https://www.proteinatlas.org) transkriptom verilerini ve immünohistokimya bazlı protein profillerini topladık ve analiz ettik. 37 normal dokudan RNA'nın (RNA-seq) derin dizilimine ve 44 doku tipini içeren doku mikrodizilerinde immünohistokimyaya dayalı olarak dokular ve organlar arasında insan proteinlerinin ekspresyonu ve lokalizasyonu (Uhlen ve diğerleri, 2015). Protein kodlayan genin HPA RNA-seq dokusu, her dokudan alınan numunelerin ortalama değerlerine karşılık gelen, milyonda ortalama protein kodlayan transkriptler (pTPM) olarak kaydedildi. Histolojiye dayalı protein ekspresyon seviyeleri manuel olarak dört seviyede (tespit edilmedi, düşük, orta ve yüksek) analiz edildi. Ek Şekil S1'de, KIM1 ve ACE2'nin ilk 10 dokusal transkripsiyonel seviyesi ve histoloji bazlı protein ekspresyon seviyeleri sırasıyla listelenir ve KIM1 ve ACE2'nin örtüşen ekspresyon profili özetlenir.

Moleküler yerleştirme ve dinamik simülasyonları

Yerleştirme işlemleri Z-Dock (http://zdock. umassmed.edu/) üzerinden gerçekleştirildi. SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2(PDB ID 1R42) ve KIM1 Ig'nin kristal yapıları Potansiyel bağlanma modellerini aramak için V alanı (PDB ID 5DZO) kullanıldı. Desmond sunucusu tarafından yürütülen ve Pymol2.3 ve Maestro11.8.012 tarafından analiz edilen aşağıdaki moleküler dinamik simülasyonları için en iyi puanlanan protein kompleksleri seçildi. Protein komplekslerinin dinamik parametrelerini incelemek için 50 ns dinamik simülasyon diyagramı uygulandı. . MM-GBSA bağlanma serbest enerjisi HawkDock tarafından hesaplandı (Misini lgnjatovic ve diğerleri, 2016).

Ortalama kare sapma (RMSD) ve ortalama kare dalgalanma (RMSF) kökü

RMSD, açıklandığı gibi belirli bir çerçeve için bir dizi atomun yer değiştirmesindeki ortalama değişikliği tahmin etmek için kullanıldı (Li ve diğerleri, 2011). RMSF, protein zincirindeki yer değiştirme değişikliklerini incelemek için yapıldı (Li ve diğerleri, 2011) .

AKI fare modelleri ve qPCR

I/R hasarı, daha önce tarif ettiğimiz gibi C57BL/6 farelerinde gerçekleştirildi (Chen ve diğerleri, 2015, 2017). Sisplatin ile indüklenen AKI için, 30 mg/kg vücut ağırlığı sisplatin, 8-haftalık erkek farelere intraperitoneal olarak enjekte edildi ve fareler 3 gün sonra kurban edildi. Her deney hayvanı grubu için n=4 ile daha ileri analizler için kan ve böbrek örnekleri toplandı. Toplam RNA, RNAiso Plus (TaKaRa) ile böbreklerden izole edildi ve M-MLV birinci iplik sentez sistemi (Invitrogen) kullanılarak cDNA'ya ters kopyalandı. Spesifik gen transkriptlerinin bolluğu qPCR ile değerlendirildi. Çalışmada kullanılan primerler verilmiştir (Ek Tablo S4).

yapılar

İnsan KIM1, KIM1 Ig V (KIM1 kalıntıları aa 20-127), KIM1 △lg V(aa kalıntısı olmayan budanmış KIM1, aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg için memeli ekspresyon plazmitleri V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S kalıntıları aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP ve TIM4-YFP oluşturuldu. Karşılık gelen cDNA fragmanlarının PCR amplifikasyon ürünleri, HA veya FLAG etiketi içeren bir pRK promotör bazlı vektöre klonlandı. SARS-CoV-2-ile ilgili plazmitler, Shandong Üniversitesi'nden Dr. PHWang'ın nazik hediyeleriydi.

Hücre kültürü ve transfeksiyon

İnsan böbrek tübüler hücre dizisi HK-2 (Çin Tip Kültür Koleksiyonu Merkezi'nden elde edilmiştir), 17.5 mM glikoz ve yüzde 10 fetal sığır serumu içeren DMEM/F12 ortamında (Hyclone) kültürlendi. SARS-CoV-2'nın hücreler üzerindeki etkisini değerlendirmek için HK-2 hücreleri, SARS-CoV-2-S ve SARS-CoV-2-RBD plazmitleri ile transfekte edildi ve daha sonra daha fazla tespit.

ortak IP

Belirtilen HK-2/HEK293T hücreleri (1x10), 1 ml ön liziz tamponu (25 mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl, yüzde 1 NP-40, 1mM EDTA, 5 Pulldown ve IP deneyleri için formüle edilmiş ve boncuklar için bir yıkama tamponu olarak formüle edilmiş yüzde gliserol). IP için hücre lizatı, belirtilen antikor veya ilgili gG ile SureBeadsTM Protein G manyetik boncukları ile gece boyunca 4°C'de immüno-çökeltildi. 500 mM NaCl içeren bir ön liziz tamponu ile yıkandıktan sonra, boncuklar bir yükleme tamponunda kaynatıldı ve immünoblotlamaya tabi tutuldu (Wan ve diğerleri, 2017).

FRET testi

KIM1 ve SARS-CoV-2-RBD arasındaki hücre içi etkileşim, KIM1-CFP ve SARS-CoV-2-RBD-YFP kullanılarak standart bir FRET tabanlı testle (Karpova ve McNally,2006) tespit edildi . Kısaca, KIM1-CFP veya KIM1 Alg V-CFP ifade eden memeli ekspresyon plazmitleri, SARS-CoV-2-RBD-YFP ile-293T hücrelerine birlikte transfekte edildi. Floresan spektrofotometre tabanlı saptama için, hücreler toplandı ve transfeksiyondan 24 saat sonra parçalandı ve lizat, bir F-2700 Floresan Spektrofotometresi (Hitachi) ile dalga boyu taraması(500-600nm) ve zaman taraması (435) ile tespit edildi. /527 nm, uyarma/emisyon). Konfokal bazlı tespit için hücreler, yüksek güçlü objektif lens (40x) altında bir Leica TCS SP8 konfokal mikroskobu ile görüntülendi (CFP kanalı: 435/485 nm, uyarma/emisyon; YFP kanalı :485/527nm, uyarım/emisyon; FRET kanalı:435/527 nm, uyarım/emisyon) (Li ve diğerleri,2020b). Konjuge olmayan CFP ve YFP'nin birlikte transfeksiyonu, tarif edildiği gibi bir negatif kontrol olarak dahil edildi (Karpova ve McNally, 2006). KIM1 ve ligandı TIM4 arasındaki etkileşim, FRET tahlili ile bir pozitif kontrol olarak saptandı (Rong ve diğerleri, 2011).

CRISPR-Cas,9-KIM1'in nakavtına aracılık etti

Genom mühendisliği için CRISPR-Cas9-tabanlı protokoller, açıklandığı gibi kullanıldı (Zhang ve diğerleri, 2017). KIM1 için kılavuz RNA hedef dizileri sağlanmıştır (Ek Tablo S4).

FITC etiketleme ve konfokal mikroskopi

FITC etiketi daha önce tarif ettiğimiz gibi yapıldı (Li ve diğerleri, 2020b; Zhang ve diğerleri, 2020). Kısaca, SARS-CoV-2-RBD, gece boyunca FITC (molar oran 1:5) ile inkübe edildi ve ardından reaksiyonu durdurmak ve reaksiyona girmemiş FITC'yi söndürmek için 5 mM NHCl ilave edildi. Çözelti iki kez diyalize tabi tutuldu ve daha sonra kullanılmak üzere liyofilize edildi.

HEK293T hücreleri (5×109) veya HK-2 hücreleri (1×107), 2 için serbest FITC veya FITC-SARS-CoV-2-RBD （100ug/ml ile inkübe edildi. Peptid bazlı içselleştirme testleri için, AP1 veya AP2（50μM）, FITC-SARS-CoV-2-RBD （100 ug/m） ile birlikte eklenmiştir. Yüzde 4 (a/h) formaldehit ile sabitlendikten sonra, hücre zarları Alex Flour 594 etiketli phalloidin （2ug/ml） ile boyandı ve çekirdekler DAPI（1ug/m） ile boyandı ve ardından bir Leica TCS ile görüntülendi SP8 konfokal mikroskop. Her grup için, yüksek güçlü bir objektif lens (64x) altındaki beş alandan en az 100 hücre değerlendirmeye dahil edildi. Temsili görüntüler sunuldu. Görüntülerin miktar tayini ImageJ1.8.0 ile yapılmıştır.

Hücre canlılığı deneyleri

Hücreler, 96-kuyulu plakalarda oyuk başına 3000-4000 hücre olacak şekilde kaplandı. Yüzde 80 birleşmede, SARS-CoV-2-RBD （100 ug/ml） ile inkübe edilen hücreler, AP1 veya AP2（10,50,100 uM） ile veya bunlar olmadan tedavi edildi. Daha sonra her birine 10ul MTT （5 mg/ml eklendi.

4 saat kuyucuk, ortam çıkarıldı ve DMSO eklendi. 490 nm'de ölçülen absorbans, ilgili kontrol grubuna normalleştirildi.

istatistiksel analiz

Veriler ortalama±SD olarak ifade edildi. İki kuyruklu Student testi ile önemli farklılıklar değerlendirildi. İki taraflı bir P değeri<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">