PGC-1, Böbrek Fibrozisini Korumak İçin Mitokondriyal Canlılığı Koruyarak NLRP3 İnflamatuarını Engeller
Dec 15, 2023
GİRİİŞ
Kronik böbrek hastalığı(KBH) küresel bir sağlık sorunudur ve prevalansı dünya çapında artmaktadır [1-3].KBH'li hastalarson dönem böbrek hastalığına ilerleme ve ölüm riski yüksektir [4, 5]. Bu nedenle, hastalığın önlenmesi için etkili terapötik hedeflerin bulunması önemlidir.KBH'nin ilerlemesi. Böbrek tübülointerstisyelinflamasyon ve fibrozisönemli patolojik belirtilerdir.KBH'nin ilerlemesi[6–8]. Renal tübüler epitel hücreleri(RTEC'ler) sıvı ve elektrolit homeostazisinin korunması için gereklidir ve böbrek kütlesinin %90'ını oluşturur. RTEC'ler bol miktarda mitokondriyi güvence altına alır ve metabolik ve fonksiyonel enerji taleplerini karşılamak için yüksek düzeyde peroksizomal proliferatörle aktifleştirilen reseptör (PPAR) ve peroksizomal proliferatör-koaktivatör-1 (PGC-1) içerir [9]. Artan kanıtlar, sayının azalması ve kristaların depolarizasyonu, şişmesi ve bozulması ile karakterize edilen mitokondriyal fonksiyon bozukluğunun böbrek fibrozuna büyük ölçüde katkıda bulunduğunu göstermektedir [10, 11]. Hasarlı mitokondri, etkili bir şekilde adenosin trifosfat (ATP) üretemez ve aşırı miktarda salınır.Reaktif oksijen türleri(ROS) ve mitokondriyal DNA (mtDNA), sonuç olarak aşağı yöndeki inflamatuar yanıtları tetikler ve hücre ölümüne ve tübüler hasara yol açar.
NOD benzeri reseptör ailesi-pirin alanı içeren 3 (NLRP3), mikrobiyal ve mikrobiyal olmayan uyaranlara karşı çeşitli konakçı doğuştan gelen immün tepkilerinde rol oynar [12, 13]. Hasar görmüş ve ölmekte olan hücrelerden salınan çeşitli patojenler ve endojen tehlike sinyalleri, NLRP3'ü aktive eder ve "inflamatuar" olarak adlandırılan bir protein kompleksinin oluşmasına yol açar [14]. NLRP3 inflamatuarı daha sonra kaspaz-1'ın otomatik işlenmesini ve aktivasyonunu başlatır; bu da pro-sitokinlerin olgun IL-1 ve IL-18'ye bölünmesiyle sonuçlanır. Son zamanlarda, NLRP3 inflamatuarının böbrek hasarı ve fibrozun patogenezinde rol oynadığı gösterilmiştir [15-17]. Böbrek hastalığının çeşitli hayvan modellerinde, NLRP3 inflamatuar yolu aktive edilir ve bunun son ürünleri olan IL-1 ve IL-18, böbrek tübül hasarına neden olabilir [16-19]. İlginç bir şekilde, RTEC'ler ve podositler gibi renal intrinsik hücreler NLRP3'ü eksprese eder, bu da NLRP3 inflamatuar sinyal iletiminin hücresel hasar üzerindeki potansiyel rolünü ortaya koyar [20, 21]. Üstelik son çalışmalar, renal tübüler hasar modellerinde mitokondriyal fonksiyon bozukluğu ile NLRP3 inflamatuar aktivasyonu arasındaki potansiyel etkileşimi göstermiştir [22-24]. Bununla birlikte, önemli bir mitokondriyal biyogenez düzenleyicisi olan PGC-1'nin, mitokondriyal dinamikleri modüle ederek NLRP3 yolunu düzenleyip düzenleyemeyeceği bilinmemektedir.
Bu nedenle, RTEC'lerde NLRP3 inflamatuar aktivasyonunun düzenlenmesinde PGC-1'nin rolünü araştırdık. Özellikle, PGC-1'nin aktivasyonu veya baskılanmasının neden olduğu değişen mitokondriyal canlılık ve dinamiklerin NLRP3 inflamatuar yolunu düzenleyip düzenleyemediğini inceledik ve dolayısıylaböbrek hasarını etkiler.
Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:
E-posta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
BÖBREK ENFEKSİYONU İÇİN %25 EKİNAKOSİT VE %9 AKTEOSİT İÇEREN DOĞAL ORGANİK CISTANCHE EKSTRESİ ALIN
YÖNTEMLER
Hücre kültürleri, TGF- 1, PGC-1 aktivatörünün tedavisi ve birincil RTEC'lere transfeksiyon RTEC'ler, C57BL/6 farelerinden izole edildi. Ek Yöntemlerde kısa bir yöntem açıklanmaktadır. Alt birleşen RTEC'ler 24 saat boyunca FBS ile sınırlandırıldı ve daha sonra ortam, kontrol grubu için %1 FBS DMEM ortamıyla ve aynı ortam TGF- 1 (5 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) ile değiştirildi , ABD) TGF- 1 grubu için. RTEC'ler, ortam değişikliklerinden 48 saat sonra RNA ve protein analizleri için toplandı. PGC-1 aktivatörü metformin (1 mM) hem kontrol hem de TGF- 1 grupları için tedavi edildi. İlaç dozları önceki testlerimize göre belirlendi. Ayrıca hücreler ayrıca Lipofectamine 2000 ve Plus reaktifleri (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak Ppargc1a plazmidi (1 ug) (Addgene, Cambridge, MA, ABD) ve Ppargc1a küçük girişimci RNA (siRNA) ile transfekte edildi. Daha sonra transfeksiyondan 6 saat sonra ortam serumsuz ortamla değiştirildi ve hücreler 48 saat daha inkübe edildi. Drp1 ekspresyonunu engellemek için, RTEC'leri enfekte etmek üzere kısa saç tokası RNA'yı (shRNA) hedefleyen Drp1 içeren lentivirüs ile Drp1 genini yok ediyoruz (Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Dr. Yu J'den nazikçe hediye edilmiştir) [25]. NLRP3 inflamatuar ve mitokondriyal hasar arasındaki ilişkiyi daha fazla araştırmak için, Nlrp3 nakavt farelerden de RTEC'ler elde ettik (Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Dr. Yu J'den nazikçe hediye edilmiştir).
Hayvan çalışması ve tedavisi
Erkek C57BL/6 fareleri (6 haftalık, başlangıç ağırlığı 20 g) The Jackson Laboratory'den (Bar Harbor, ME, ABD) satın alındı. Hayvanlar, sıcaklığı kontrol edilen bir odada (22 derece) 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsünde tutuldu. Bütün hayvanlar rastgele atandı. Varıştan bir hafta sonra hayvanlar iki gruba ayrıldı ve 4 haftaya kadar normal diyet (ND; n=10) veya %0,2 adenin diyeti (Ade; n=10) ile beslendiler. Hem ND hem de Ade gruplarına diyetin başlamasından bir hafta önce günlük olarak intraperitoneal metformin (250 mg/kg) enjeksiyonu uygulandı. 4 hafta ND veya Ade'den sonra hayvanlar öldürüldü ve böbrekler, Zoletil (10 mg/kg) (Virbac, Carros, Fransa) ile anestezi uygulanarak çıkarıldı. Tek taraflı üreter tıkanıklığı (UUO) farelerinin hazırlanmasına yönelik kısa bir yöntem, Ek Yöntemlerde açıklanmaktadır. Böbrek örnekleri daha sonra hemen sıvı nitrojende donduruldu ve kullanılıncaya kadar -80 derecede saklandı.
Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu, western blot analizleri
Ppargc1a, NLRP3 inflamatuar yolu, mitokondriyal dinamikler, tümör nekroz faktörünün indüklediği protein 3 (TNFAIP3), oksidatif stres belirteci ve profibrotik belirteçleri içeren genlerin transkript seviyeleri, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile karşılaştırıldı. Bu çalışmada kullanılan primer dizileri Ek Tablo 1'de açıklanmıştır. Daha ayrıntılı yöntemler Ek Yöntemler'de açıklanmaktadır. PGC-1, NLRP3 inflamatuar yolu, TNFAIP3, oksidatif stres belirteci ve profibrotik belirteçlerin protein ekspresyon seviyeleri Western blot analizleriyle incelendi. Antikorlarla ilgili ayrıntılı yöntemler ve bilgiler Ek Yöntemlerde ayrı olarak açıklanmaktadır.
NLRP3 inflamatuar düzeneğinin tahlili
Bir kaspaz alım alanı (ASC) içeren apoptozla ilişkili benek benzeri proteinin oligomerizasyonunu belirlemek için, bir disüksinimidil suberat (DSS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) aracılı çapraz bağlama tahlili, tarif edildiği gibi gerçekleştirildi. daha önce [26]. Kısaca, RTECS ve böbrek dokusu numunelerinden alınan hücreler, santrifüjleme yoluyla topaklandı ve 20 mM Hepes KOH, pH7,5, 150 mM KCl, %1 NP40 içeren 0,5 ml liziz tamponunda parçalandı, 0,1 mM PMSF ve buz üzerinde proteaz inhibitörü kokteyli. Hücre lizatları 6000 rpm'de 4 derecede 10 dakika boyunca santrifüjlendi. Peletler iki kez PBS ile yıkandı ve daha sonra 500 ul PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. Yeniden süspanse edilen peletler, 30 dakika boyunca taze DSS (2 mM) ile çapraz bağlandı ve daha sonra 10 dakika boyunca 6000 rpm'de santrifüjleme yoluyla peletlendi. Çapraz bağlı peletler, 30 ul SDS numune tamponunda yeniden süspanse edildi ve %12 SDS poliakrilamid jel üzerinde fraksiyonlara ayrıldı, ardından ASC antikoru (Cell Signaling Technology, MA, ABD) ile immünoblotlama yapıldı.
Oksidatif stres seviyelerinin ölçümü
RTEC'lerde ve böbrek dokularında oksidatif stres (malondialdehit [MDA]) seviyeleri, bir MDA tahlil kiti (Abcam, Cambridge, MA, ABD) kullanılarak ölçüldü. 10 mg RTEC, 300 ul MDA lizis tamponu (Abcam, Cambridge, MA, ABD) içerisinde buz üzerinde homojenleştirildi, ardından çözünmeyen materyalleri çıkarmak için santrifüjlendi (13,000 x g, 10 dakika). 10 ml plazma, 500 ul 42 mM H2S04 ve 125 ul fosfotungstik asit çözeltisi ile oda sıcaklığında 5 dakika süreyle karıştırıldı. Santrifüjden sonra (13,000 x g, 3 dakika), pellet 100 ul çift damıtılmış H2O ile buz üzerinde yeniden süspanse edildi. Daha sonra, 200 ul çözelti ve 600 ul 2-tiyobarbitürik asit çözeltisi, 10 dakika süreyle buz banyosunda oda sıcaklığına soğutulmadan önce 95 derecede 60 dakika süreyle inkübe edildi. 532 nm'deki absorbans yoğunluğu MDA düzeyiyle orantılıydı.
Mitokondri izolasyonu
RTEC'ler, üreticinin protokolüne göre bir Mitokondri izolasyon kiti (BioVision, Inc. CA, ABD) kullanılarak sitozol ve mitokondriye bölündü. Kısacası hücreler toplandı ve 10 ml buz soğukluğunda PBS ile yıkandı. Hücreler 600 x g'de 5 dakika süreyle 4 derecede santrifüjlendi ve 1,0 ml 1x Sitosol Ekstraksiyon Tamponu içerisinde yeniden süspanse edildi. Homojenizasyon buz üzerinde gerçekleştirildi ve çekirdekleri ve sağlam hücreleri çıkarmak için 1200 x g'de 10 dakika boyunca 4 derecede santrifüj edildi. Toplanan süpernatan 10,000 x g'de 30 dakika boyunca 4 derecede santrifüjlendi. Ortaya çıkan peletler, 1,0 ml 1x Sitosol Ekstraksiyon Tamponu içerisinde yeniden süspanse edildi ve mitokondri elde etmek için 10,000 x g'de 4 derecede 30 dakika boyunca santrifüjlendi. Elde edilen mitokondri, 30 ul Mitokondriyal Parçalama Tamponu içerisinde parçalandı ve 100 ul mutlak etanol ile 100 ul enzim karışımına (izolasyon kitinde yer alan) ilave edildi. Santrifüjden sonra elde edilen pellet mtDNA'dır. Sitozolik mtDNA, etanol ile çökeltildikten sonra süpernatandan elde edildi. MtDNA konsantrasyonu qPCR tahlili ile belirlendi.
Mitokondriyal dinamikler ve fonksiyon için değerlendirme
Mitokondri dinamiklerinin görselleştirilmesi için mitokondri için immünofloresan boyama, MitoTracker Deep Red (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanıldı. RTEC'ler %4 paraformaldehid içinde sabitlendi ve %5 normal tavşan serumu ve 0.1% Tween- 20 içeren DPBS içinde bloke edildi. Hücreler daha sonra anti-fare NLRP3, MitoTracker ve ardından AlexaFluor594-konjuge keçi anti-tavşan antikorları (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) ile boyandı ve son olarak slaytlar DAPI ile monte edildi ve görüntülendi. Daha sonra mitokondriyal yapıyı standart transmisyon elektron mikroskobu ile inceledik. Birincil RTEC'ler, gece boyunca %2 paraformaldehit ve %2,5 glutaraldehit karışımıyla sabitlendi, yıkandı, kurutuldu ve standart prosedürlere göre bir reçineye gömüldü. Mitokondri, JEOL 1011 mikroskobu (JEOL, Tokyo, Japonya) altında incelendi. Mitokondriyal solunum hızını değerlendirmek için bir Seahorse Bioscience ×24 hücre dışı akı analizörü kullanıldı (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, ABD). Mitokondriyal ROS üretiminin ölçümü için hücreler, uygun işlemlerden sonra Hank Dengeli Tuz Çözeltisinde yeniden süspanse edildi ve 20 dakika boyunca 37 derecede MitoSOX (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ile boyandı. Hücrelerin floresansı bir akış sitometresi (FACSVerse, BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) ile ölçüldü. Mitokondriyal membran potansiyelini test etmek için bir tetrametilrodamin etil ester (TMRE) Mitokondriyal Membran Potansiyeli Test Kiti (Abcam, Cambridge, MA, ABD) kullanıldı.
SONUÇLAR
Böbrek hasarı sırasında PGC-1, mitokondriyal dinamikler ve NLRP3 inflamatuar yolundaki değişiklikler İlk olarak, TGF- 1 ile tedavi edilen RTEC'lerde PGC-1, mitokondriyal dinamikler ve NLRP3 yolunun ifadesini inceledik. . Bu hücrelerde TGF- 1 tedavisi, Ppargc1a'nın transkript ve protein seviyelerini azalttı (Şekil 1A, B ve Ek Şekil 1A). Buna göre, mitokondriyal füzyonla ilişkili bir gen olan mitofusinin (Mfn) ve mitokondriyal kütleyi temsil eden mitokondriyal transkripsiyon faktörü A'nın (Tfam) mRNA ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde azalırken, mitokondriyal bir füzyonla ilişkili gen olan dinaminle ilişkili protein 1'in (Drp1) mRNA ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde azaldı. fisyonla ilişkili gen, kontrol ile karşılaştırıldığında arttırıldı (Şekil 1C). Ek olarak, TGF- 1 tedavisi, NLRP3 iltihap yolu ile ilişkili genlerin ve proteinlerin ekspresyon seviyelerinin artmasıyla kanıtlanan NLRP3 iltihap sinyalini aktive etti (Şekil 1D, E ve Ek Şekil 1B). NLRP3 yolunun son ürünleri olan IL-1 ve IL-18'nin, ELISA ile ölçülen TGF- 1- ile muamele edilmiş hücre lizatlarındaki konsantrasyonları arttı (Şekil 1F). Ayrıca, fibronektin ve kollajen 1 dahil fibrotik belirteçlerin ekspresyon seviyeleri ve Bax/bcl-2 oranı ve bölünmüş kaspaz-3 apoptotik hücre ölüm indeksi de arttı (Şekil 1G, H ve Ek Şekil 1C). ). Bu bulgular adenin kaynaklı böbrek hasarı modelinde benzerdi (Şekil 2A-H ve Ek Şekil 1D-F). Dolayısıyla böbrek hasarı sırasında, NLRP3 inflamatuar yolağının aktivasyonuyla birlikte PGC-1 ekspresyonunda ve mitokondriyal dinamiklerde önemli değişiklikler olur.
Şekil 1 TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lerde PGC-1, mitokondri dinamikleri ve NLRP3 inflamatuar yolundaki değişiklikler. PGC-1'nin mRNA ve B proteini ekspresyon seviyeleri, TGF- 1- ile muamele edilmiş RTEC'lerde azaldı. Mfn, Tfam ve Drp1 dahil mitokondriyal dinamikle ilgili genlerin C mRNA ifadesi, TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lerde değiştirildi. NLRP3 inflamatuar yolunun D mRNA ve E protein ekspresyon seviyeleri, TGF{{10}} ile tedavi edilen RTEC'lerde arttı. F ELISA tarafından değerlendirilen IL-1 ve IL-18 konsantrasyonları, TGF- 1- ile işlenmiş RTEC'lerde arttı. Fibronektin ve kollajen 1 dahil fibrotik belirteçlerin G mRNA ve H protein ekspresyon seviyeleri ile Bax/bcl-2 ve bölünmüş kaspaz-3'ın apoptotik hücre ölümü belirteçleri, TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lerde arttı. Not: *P < 0,05, kontrole karşı. PGC-1 peroksizomal proliferatör-koaktivatör-1 ; NLRP3 NOD benzeri reseptör ailesi, pirin alanı içeren 3; ASC, bir kaspaz alım alanı içeren apoptozla ilişkili benek benzeri protein; RTEC renal tübüler epitel hücresi; Mfn mitofusin; Tfam mitokondriyal transkripsiyonel faktör A; Drp1 dinamin ile ilgili protein 1; ELISA enzimine bağlı immünosorbent tahlili.
PGC-1, böbrek hasarı sırasında bozulan mitokondri dinamiklerini ve morfolojisini onarır
Daha sonra, mitokondriyal biyogenezin önemli bir düzenleyicisi olan PGC-1'nin böbrek hasarı sırasında mitokondriyal dinamikleri zayıflatıp zayıflatamayacağını inceledik. Ppargc1 ekspresyonunu modüle etmek için ayrıca Ppargc1a plazmidini, Ppargc1'e karşı siRNA'yı (siPGC-1) ve PGC-1'nin dolaylı bir aktivatörü olan metformini kullandık. Beklendiği gibi, bozulmuş mitokondriyal dinamiğe bağlı genler, Ppargc1'in aşırı ekspresyonuyla restore edildi. Buna karşılık, Ppargc1a'nın siPGC-1 ile yıkılması, Mfn ve Tfam ifadesini azalttı, ancak Drp1 ifadesini arttırdı (Şekil 3A–C ve Ek Şekil 2A, B). Bu bulgular metformin ile yapılan ek deneylerle desteklenmiştir (Şekil 3D-F ve Ek Şekil 2C, D). Bu tür gelişmeler mitokondriyal fonksiyonun iyileşmesine yol açtı. PGC-1'nin Ppargc1a plazmidi ve metformin ile restorasyonu, TGF- 1 ile tedavi edilen RTEC'lerde azalan mitokondriyal membran potansiyelini ve azalan oksijen tüketim oranını önemli ölçüde iyileştirdi (Ek Şekil 3A-D). PGC-1'deki değişikliklerle uyumlu olarak, fosfo-AMP ile aktifleştirilen protein kinazın (p-AMPK) ekspresyonu, TGF- - ile tedavi edilen hücrelerde azalırken, metformin tedavisi bu ekspresyonları geri kazandı (Şekil 3F ve Ek Şekil 2E). Ancak metformin, Ppargc1a'yı susturarak RTEC'lerde PGC-1'nin mRNA ve protein ekspresyon seviyelerini artırmadı. Bu bulgular, AMPK'nin metforminin etkisine aracılık ettiğini ve PGC-1'nin AMPK'nin aşağı yönlü bir efektörü olduğunu göstermektedir (Ek Şekil 2F, G, J). Metforminin mitokondriyal dinamikler üzerindeki faydalı etkileri de Ppargc1a'nın susturulmasıyla ortadan kaldırıldı (Ek Şekil 2H – J). İn vivo olarak metformin ile tedavi aynı zamanda Ppargc1'in transkript seviyesini de eski haline getirdi ve adeninle beslenen ve UUO farelerde mitokondriyal dinamikle ilişkili genlerin değiştirilmiş ifadesini tersine çevirdi (Şekil 3G-I ve Ek Şekil 2K, L, 4A-E). Metformin ile AMPK aktivitesi ayrıca adeninle beslenen modelde in vitro olarak doğrulandı (Şekil 3I ve Ek Şekil 2M). Elektron mikroskobu incelemesi ayrıca adeninle beslenen ve UUO farelerin RTEC'lerinde mitokondri bütünlüğünün kaybını doğruladı. Ancak bunlar metformin ile önemli ölçüde iyileştirildi (Şekil 3J ve Ek Şekil 4F). Bu bulgular, PGC-1'nin böbrek hasarı sırasında mitokondride bozulan dinamikleri, morfolojiyi ve işlevleri onardığını göstermektedir.
Mitokondriyal hasar böbrek hücresi ölümüne ve fibrozise yol açabilir. TGF- 1 tedavisinden sonra RTEC'lerde fibronektin ve kollajen 1 dahil olmak üzere fibrotik belirteçlerin ekspresyon seviyelerinin yükseldiğini ve Bax/bcl-2 oranının apoptotik hücre ölümü indeksini ve RTEC'lerde bölünmüş kaspaz-3 gözlemledik. Hücre ölümü belirteçlerinin bu artan ifadeleri, PGC-1 ve metforminin aşırı ekspresyonuyla zayıflatılmış, oysa siPGC-1 ile daha da şiddetlendirilmiştir (Şekil 4A–D ve Ek Şekil 5A, B). Bu bulgulara uygun olarak, adeninle beslenen ve UUO farelerde fibrotik belirteçlerin ekspresyon seviyeleri ve apoptotik hücre ölümü indeksi önemli ölçüde arttı. Buna karşılık metformin tüm bu ifadeleri tersine çevirdi (Şekil 4E, F ve Ek Şekil 5C, 6A, B). Masson'un trikrom boyaması ayrıca metformin ile iyileşen fibrozisi de doğruladı (Şekil 4G). Özellikle, TGF- ile muamele edilmiş RTEC'lerdeki artırılmış hücre ölümü belirteçleri ve NLRP3 sinyali, bir pan-kaspaz olan Z-Asp-2,6- diklorobenzoiloksimetilketon (Enzo Life Science, Farmingdale, NY, ABD) ile tersine çevrildi. inhibitörüdür; bu da TGF- - ile indüklenen hasara mitokondriyal hasar ve erken apoptozun aracılık ettiğini düşündürmektedir (Ek Şekil 7A-D). Bu bulgular birlikte PGC-1 aktivasyonunun mitokondriyal hasarı azalttığını ve hücre ölümü ile böbrek fibrozisini azalttığını göstermektedir.
PGC-1 modüle edilir
NLRP3 iltihaplı sinyal yolu Daha sonra, böbrek hasarına aracılık etmede PGC-1 ile NLRP3 iltihaplı sinyal yolu arasındaki ilişkiyi daha da araştırdık. PGC-1'nin aşırı ekspresyonu, Ppargc1a plazmid transfeksiyonu kullanılarak indüklendiğinde, NLRP3, ASC, IL-1 ve IL-18'nin ekspresyon seviyeleri, TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lerde azaldı ( Şekil 5A, B ve Ek Şekil 8A). ELISA ile ölçülen TGF- 1- ile muamele edilmiş hücre lizatlarındaki IL-1 ve IL-18 konsantrasyonları da Ppargc1a plazmit transfeksiyonundan sonra azalmıştır (Şekil 5C). Metformin ile tedavi de benzer bir bulgu verdi (Şekil 5D, E ve Ek Şekil 8B). Bununla birlikte, Ppargc1a'nın yıkılması, NLRP3 inflamatuar yol ile ilişkili genlerin ve proteinlerin ekspresyon seviyelerinin yükselmesine neden oldu (Şekil 5A, B ve Ek Şekil 8A). Ayrıca, adeninle beslenen ve UUO farelerde NLRP3 inflamatuar sinyal yolunun aktivasyonu, metformin ile eşzamanlı olarak azaltıldı (Şekil 5F, G ve Ek Şekil 6C, D, 8C). RTEC'lerdeki ve böbrek dokusu lizatlarındaki IL-1 ve IL-18 konsantrasyonları, ELISA ile ölçülen metformin tedavisiyle önemli ölçüde azaldı (Şekil 5H).
PGC-1'nin mitokondriyal dinamikleri düzenleme yeteneği göz önüne alındığında, daha sonra Drp1'in NLRP3 inflamatuar aktivasyonundaki rolünü test ettik. NLRP3 inflamatuar sinyali, Drp1'in yıkılmasıyla önemli ölçüde azaldı. Bununla birlikte, hem Ppargc1a hem de Drp1'in yıkıldığı RTEC'lerde, NLRP3 inflamatuar bileşenlerinin ekspresyon seviyeleri, TGF- 1- ile tedavi edilen hücrelerdekilerle karşılaştırıldığında azalmadı. Ppargc1a aşırı ekspresyonu ve Drp1 devrilme olan RTEC'lerde, NLRP3 inflamatuar sinyali daha az aktive edildi (Ek Şekil 9A, B). Bu bulgular, Drp1'in NLRP3 inflamatuar aktivasyonuna kısmen aracılık edebildiğini, ancak PGC-1'nin diğer eylemlerinin NLRP3 sinyal yolunun düzenlenmesinde rol oynadığını göstermektedir.
Ayrıca NLRP3 inflamatuarından gelen bir geri bildirim sinyalinin mevcut olup olmadığını da inceledik. Bu amaçla, Nlrp3 nakavt farelerden birincil kültür yoluyla RTEC'ler elde ettik. TGF- 1 ile tedavi edilen bu hücrelerde, NLRP3 sinyallemesinde muadil hücrelere göre daha az aktivasyon vardı, bu da mitokondriyal dinamiklerde iyileşmelere yol açtı (Ek Şekil 10A–E). Buna göre, Nlrp3 yokluğunda fibrotik değişikliklerde ve hücre ölümünde eşzamanlı gelişmeler vardı (Ek Şekil 10F, G). Bu bulgular mitokondriyal hasar ile NLRP3 sinyali arasında çift yönlü olası bir ilişki olduğunu göstermektedir.
NLRP3'ün adaptör proteini ASC ile oligomerizasyonu, inflamatuar kompleks oluşumunun önemli bir adımıdır. Böylece NLRP3 inflamatuar topluluğunun PGC- 1'den etkilenip etkilenmediğini inceledik. TGF- 1- ile muamele edilmiş RTEC'lerde, ASC'nin NLRP3'e bağlandığı gözlendi. Bu oligomerizasyon, PGC-1 veya metforminin aşırı ekspresyonuyla önemli ölçüde azalırken bağlanma, siPGC-1 tarafından yeniden sağlandı (Şekil 6A–C). Adeninle beslenen farelerde, NLRP3 oligomerizasyonu ve aktivasyonu, ASC'nin NLRP3'e bağlanmasıyla doğrulandı ve bu, metformin tarafından ortadan kaldırıldı (Şekil 6D, E).
Son olarak, mitokondriyal içerikleri ve NLRP3 ifadesindeki eşlik eden değişimi daha da inceledik. Konfokal mikroskopi incelemesi, PGC-1 içeren veya içermeyen RTEC'lerde MitoTracker Red yoğunluğunda ve NLRP3 ifadesinde karşılıklı bir değişiklik olduğunu ortaya çıkardı. TGF- 1, MitoTracker'ın boyama yoğunluğunu azalttı ve bunlar, PGC-1 aşırı ekspresyonu ve metformin ile eski durumuna getirildi. Tersine, TGF- 1-işlem görmüş RTEC'lerde NLRP3'ün artan ifadesi, PGC-1 aşırı ifadesi ve metformin tarafından azaltıldı. Ancak siPGC-1 bu bulguları tersine çevirdi (Şekil 7). Toplamda bu bulgular, NLRP3 inflamatuar kompleksinin bir araya gelmesinin böbrek hasarı sırasında indüklendiğini ve bu yolun aktivasyonunun PGC-1 tarafından zayıflatıldığını göstermektedir.
Şekil 5 PGC-1, NLRP3 inflamatuar sinyal yolunu modüle eder. NLRP3 inflamatuar yolunun mRNA ve B protein ekspresyon seviyeleri, Ppargc1a plazmidinin transfeksiyonu ile TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lerde azalırken, siPGC-1 ile arttı. C ELISA ile değerlendirilen IL- 1 ve IL-18 konsantrasyonları, Ppargc1a'nın aşırı ekspresyonu ile TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lerde azaldı. NLRP3 inflamatuar yolunun D mRNA ve E protein ekspresyon seviyeleri, metformin ile TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lerde zayıflatıldı. NLRP3 inflamatuar yolunun F mRNA ve G protein ekspresyon seviyeleri ve ELISA ile değerlendirilen IL-1 ve IL-18'nin H konsantrasyonları, metformin ile adeninle beslenen farelerde zayıflatıldı. Not: *P < 0.05'e karşı kontrol; **P < 0,05, TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lere veya adeninle beslenen farelere karşı. PGC-1 peroksizomal proliferatör-koaktivatör-1 ; NLRP3 NOD benzeri reseptör ailesi, pirin alanı içeren 3; Bir kaspaz alım alanı içeren ASC apoptozla ilişkili benek benzeri protein; RTEC renal tübüler epitel hücresi; ELISA enzimine bağlı immünosorbent tahlili; Ade adenin; Metformin ile tanıştım.
Şekil 6 PGC-1, böbrek hasarı sırasında NLRP3 inflamatuarının oligomerizasyonunu modüle eder. DSS aracılı çapraz bağlanma ile analiz edilen A–C ASC oligomerik yapıları, Ppargc1a ve metforminin aşırı ekspresyonuyla zayıflatılmış, ancak siPGC-1 ile şiddetlendirilmiş olan TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lerde gözlendi. Metformin ile zayıflatılmış adeninle beslenen farelerde D, E ASC oligomerik yapıları gözlendi. Not: *P < 0.05'e karşı kontrol; **P < 0,05, TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lere veya adeninle beslenen farelere karşı. PGC-1 peroksizomal proliferatör-koaktivatör-1 ; NLRP3 NOD benzeri reseptör ailesi, pirin alanı içeren 3; Bir kaspaz alım alanı içeren ASC apoptozla ilişkili benek benzeri protein; DSS disüksinimidil suberat; RTEC renal tübüler epitel hücresi; Ade adenin; Metformin ile tanıştım.
PGC-1, NLRP3 inflamatuarını düzenlemek için mtDNA, oksidatif stres ve TNFAIP3 salınımını düzenler
Böbrek hasarında PGC-1 ve NLRP3 inflamatuar yolağı arasındaki mekanik bağlantıyı daha da açıklığa kavuşturmak için, ilk olarak NLRP3 inflamatuar aktivasyonunun tetikleyicisi olarak bilinen hücre hasarı sonrasında mtDNA'da meydana gelen değişiklikleri inceledik. MtDNA kopya sayıları, TGF- 1 tedavisinden sonra mitokondriyal fraksiyonda azalmış ve sitozolik fraksiyonda artmıştır; bu, mtDNA'nın mitokondriden sitozole salındığını düşündürmektedir. Özellikle, bu değişiklikler Ppargc1a'nın aşırı ekspresyonundan sonra geri yüklendi (Şekil 8A).
Daha sonra NLRP3 inflamatuarının pozitif düzenleyicisi olan oksidatif stresi inceledik. TGF- 1- ile tedavi edilen RTEC'lerde, oksidatif stres, artan MitoSOX boyama yoğunluğu ve artan MDA düzeyleriyle kanıtlanan kontrollerle karşılaştırıldığında belirgin şekilde belirgindi. Ppargc1a plazmidi ve metformin ile tedavi, mitokondriyal ROS'un bu aşırı üretimini hafifletti. Tersine, Ppargc1a'nın yıkılması, TGF- 1- ile muamele edilmiş RTEC'lerde oksidatif stres seviyelerini daha da arttırdı (Şekil 8B-D). İn vitro çalışmanın bulgularına benzer şekilde, adeninle beslenen ve UUO farelerde MDA seviyeleri önemli ölçüde arttı. Artan oksidatif stres metformin ile azaltıldı (Şekil 8E ve Ek Şekil 6E).
Son olarak, PGC-1 tarafından düzenlenen ve aynı zamanda NLRP3 inflamatuarının negatif düzenleyicisi olarak da bilinen TNFAIP3'ü daha ayrıntılı olarak inceledik. TGF- 1, Tnfaip3'ün transkript seviyelerini azalttı ve Tnfaip3'ün bu azalmış ifadesi, PGC-1'nin restorasyonu ile eski durumuna getirildi. Buna karşılık, Ppargc1a'nın yıkılması, Tnfaip3 ekspresyonunun daha da azalmasına neden oldu (Şekil 8F, G ve Ek Şekil 8D, E). Ayrıca, adeninle beslenen ve UUO farelerde TNFAIP3 ekspresyonunda azalma vardı ve metformin bu ekspresyonu restore etti (Şekil 8H ve Ek Şekil 6F, 8F). Toplamda bu bulgular, PGC-1'nin mtDNA salınımı, mitokondriyal ROS/oksidatif stres ve TNFAIP3'ün modülasyonu yoluyla NLRP3 inflamatuarını düzenleyebileceğini göstermektedir.
Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:
E-posta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
