Cistanche Tubulosa'dan Feniletanol Glikozitler, Hepatik Stellat Hücre Aktivasyonunu Bastırır ve Potansiyel Anti-Hepatik Fibrozis Ajanları Olarak TGF-01/smad'da Sinyal Yollarının İletilmesini Engeller
Mar 05, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang ve Tao Liu
Soyut: Cistanche tübülozabağışıklığı düzenlemek için yaygın olarak kullanılan geleneksel bir Çin bitkisel ilacıdır vefeniletanoid glikozitler(CPhG'ler) bu aktiviteden sorumlu birincil bileşenler arasındadır. Önceki çalışmalar, CPhG'lerin sıçanlarda sığır serum albümini (BSA) ile indüklenen hepatik fibroz üzerindeki önleyici ve terapötik etkilerini göstermiştir. Çalışmanın amacı, CPhG'lerin ve monomerlerin anti-hepatik fibrozis etkisini değerlendirmektir.ekinakozitveasteosithepatik stellat hücre (HSC) aktivasyonunu inhibe ederek, transforme büyüme faktörü-p1 (TGF-pl)/smad'de sinyal yollarının iletimini bloke ederek ve bunların in vitro hepatoprotektif aktivite olduklarını belirleyerek. CPhG'ler (100,50 ^g/mL)/ekinakozit (500,250,125 ^g/mL)/acteoside (6, 3 ^g/mL) ile tedaviden sonra HSC proliferasyonu açıkça inhibe edildi, IC50 değerleri 119.125.520.345 ve 6.999 g/ MTT tahlilinde sırasıyla mL. Farklı CPhG konsantrasyonları/ekinakozit/asteositlaktat dehidrojenaz (LDH) ölçümlerine göre HSC üzerindeki hücresel toksisiteyi etkilemedi. Farklı CPhG konsantrasyonları/ekinakozit/asteositsmad7'nin mRNA seviyesini ve protein ekspresyonunu arttırdı ve smad2, smad3'ün mRNA seviyelerini ve HSC'de smad2, fosfo-smad2 (p-smad2), smad3, fosfo-smad3'ün (p-smad3) protein ekspresyonunu azalttı. Özetle, bu sonuçlar CPhGs/ekinakozit/asteositTGF-p1/smad'de sinyal yollarının iletimini bloke edebilir ve HSC aktivasyonunu inhibe edebilir, bu da şunu düşündürür:C. tübülozabu nedenle karaciğer fibrozunun tedavisi için potansiyel bir bitkisel ilaç olabilir.
Anahtar Kelimeler: Cistanche tübüloza; feniletanol glikozitlercistanche(CPHG'ler);ekinakozit; asteosit; hepatik yıldız hücreleri (HSC); TGF-p1/smad
1. Giriş
proliferatif ve fibrojenik hale gelir, daha sonra ECM biriktirir ve nihayetinde fibrojenik miyofibroblast benzeri hücrelere farklılaşır. Dönüştürücü büyüme faktörü-.1 (TGF-p 1), ana profibrojenik aracı olarak kabul edilir. TGF-&1 ile ilişkili sinyal yolu, hepatik fibrozun önemli bir mekanizmasıdır ve esas olarak smad'a bağımlı ve smad'den bağımsız sinyalleme içerir ve smad'e bağlı sinyal iletim yolunun, TGF-p1 sinyallemesinin ana kanalı olduğu düşünülmektedir. . Bu nedenle, TGF-p1/smad sinyal yolunun bloke edilmesi, kolajen üretimini baskılayabilir ve sonunda, bu yolu, son yıllarda anti-hepatik fibroz ilaç araştırmalarında önemli bir hedef haline getiren hepatik fibrozu hafifletebilir.
Hepatik fibrozun dünya çapındaki yüksek insidansına rağmen, genel olarak kabul edilen bir anti-fibrojenik tedavi mevcut değildir [2-4]. Geleneksel Çin Bitkisel İlaçları (TCHM'ler), karaciğer bozukluklarının tedavisi için büyük ilgi görmektedir, çünkü bazıları karaciğer fibrozunun yönetimi ve önlenmesinde terapötik ilaçlar olarak kullanılabilir. Halen birçok çalışma, binlerce yıldır TCHM olarak kullanılan potansiyel anti-fibrojenik ilaçlara odaklanmıştır [5].
Cistanche tubulosa W (Orobanchaceae familyası)fa parazit bitkisi, Çin'in Sincan'ın güney bölgesinde yaygın olarak yetiştirilmektedir [6]. İnsanlar onu böbrekleri canlandırmak, kanı beslemek, bağırsakları rahatlatmak ve yan etki olmaksızın yaşlanmayı geciktirmek için kullanır ve Çin Farmakopesinde resmi olarak listelenmiştir [7]. C. tubulosa, feniletanoid glikozitler (CPhG'ler), iridoidler ve polisakaritler dahil olmak üzere çeşitli aktif bileşenler içerir. C. tubulous'daki birçok aktif bileşen arasında, bir dizi biyoaktivite (antioksidan, anti-yorgunluk, radyorezistans vb.) sunan CPhG'ler, bu bitkinin Pie ana karakteristik bileşenleridir. Son yıllarda, CPhGis'in aşırı Hent hepatoprotektif etkileri olduğu ve ağaç radikallerini temizleyebildiği, hepatik membranları koruyabildiği ve immün düzenleyici etkiler, apoptoz inhibisyonu, hepatit B yüzey antijeni (HBs Ag) ve hepatit B ekspresyonunun inhibisyonu sergilediği bildirilmektedir. e antijen (HBeAg) ve hepatit B virüsü (HBV) DNA replikasyon aktivitesi vb. HBV DNA seviyesi, kronik HBV enfeksiyonlarının doğal seyrini belirlemede anahtar faktör olan viral replikasyon aktivitesini doğrudan yansıtan en güvenilir indekstir, oP antiviral tedavisinin etkisinin izlenmesi ve akut ve kronik HBV enfeksiyonlarının prognozunun değerlendirilmesi. HBV'nin serolojik tespit indeksleri esas olarak HBsAg, HBeAg, vb. içerir [8-11]. Bununla birlikte, CPhG'lerin anti-hepatik fibrozis etkileri hakkında az sayıda literatür raporu bulunmaktadır. Önceki çalışmalar, CPhG'lerin sıçanlarda sığır serum albümini (BSA) ile indüklenen hepatik fibroz üzerindeki önleyici ve terapötik etkilerini göstermiştir, ancak CPhG'lerin ve ana monomerlerinin (ekinakozit ve ateozit, Şekil 1) antifibrojenik aktivitesi hiçbir zaman in vitro olarak değerlendirilmemiştir.
organik Cistanche tubulosa
2. Sonuçlar
2.1. CPhG'lerin Kantitatif Tayini
CPhG'lerC. tübülozaiki feniletil alkol glikoziti içerir: ekinakozit ve akteo yan ve bunların CPhG'lerdeki içerikleri HPLC analizi ile tespit edildi (Şekil 1) yüzde 42,71 土 0, yüzde 42 ve yüzde 14,27 土 0.18 sırasıyla yüzde.
2.2. HSC-T6'da CPhG'ler, Ekinakozid ve Akteozid'in İnhibitör Aktiviteleri
CPhG'ler, ekinakozit ve asteozit (62.5-500 卩g/mL), HSC'nin hücre canlılığını konsantrasyona bağlı bir şekilde inhibe etti. CPhG'ler ve acteoside, HSC hücreleri üzerinde dikkate değer bir inhibitör aktivite gösterdi, hücre büyüme aktivitesinin yüzde 50 inhibisyonu (IC50) değerleri sırasıyla 119.125 µ/mL ve 6.999 µ/mL idi. Ekinakozid orta düzeyde inhibitör aktivite sergilemiştir (IC50,520.345 µ/mL; Tablo 1 ve Şekil 2).
2.3. HSC'de CPhG'ler, Echin ve Acteorida'nın Hücre Toksisitesi
Tüm hücrelerde bulunan stabil bir sitoplazmik enzim olan laktat dehidrojenaz (LDH), plazma zarı hasarı üzerine hücre kültürü süpernatanına hızla salınır. Kültür süpernatanındaki enzim aktivitesi, parçalanmış celflerin oranı ile ilişkilidir [12]. Tablo 2'de gösterildiği gibi, farklı C PhG'ler, ekinakozit ve asteozit konsantrasyonları ile tedavi edildiğinde, LDH aktivitesi hücre koirtrol grubuna kıyasla hafif bir artış gösterse de, fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (p > 0.05). ), hücre zarlarının çoğunun bütünlüğünü koruduğunu ve HSC üzerinde CPhG'ler, ekinakozid ve akteozid inhibisyonunun spesifik olmayan hücresel toksisiteden kaynaklanmadığını gösterir.
2.4. CPhG'ler, Ekinakozid ve Acteosde'nin TGF-^i Tarafından İndüklenen HSC Proliferasyonuna Etkisi
HSC'nin proliferasyonu, aktivasyonu ve farklılaşması çeşitli faktörler tarafından düzenlenir. Karaciğer fibrozunda yer alan çeşitli faktörler arasında, HSC'yi aktive edebildiği, miyofibroblast farklılaşmasını destekleyebildiği, ECM sentezini artırabildiği ve ECM bozulmasını engelleyebildiği ve kemokinleri ve kemokinleri serbest bırakabildiği için TGF{{0}} en önemlisi olarak kabul edilir. karaciğer fibrozunda rol oynayan sitokinler [13]. Bu çalışmada, kontrol grubu dışında, erken karaciğer fibrozunun oluşumunu simüle etmek ve CPhG'ler, ekinakozit ve ateositin TGF-p üzerindeki etkisini araştırmak için in vitro olarak TGF-P1 ile sabit HSC'ler uyarıldı1- indüklenen HSC proliferasyonu. Tablo 3'te gösterildiği gibi, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, TGF-61 grubu, HSC'nin çoğalmasını önemli ölçüde destekledi (p < 0.01).="" tgf-p1="" grubu="" ile="" karşılaştırıldığında,="" tgf-p1="" artı="" cphg'ler="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf{{18}="" }="" artı="" ekinakozit="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" µg/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf-p1="" artı="" ateozit="" (ta)="" (3.0,="" 6.0="" µg/ml,="" p="">< 0.05)="" hepsi="" belirgin="" bir="" şekilde="" proliferasyonu="" inhibe="" etti.="" tgf-|3="" 1="" tarafından="" farklı="" derecelerde="" indüklenen="">
2.5. HSC'lere CPhG'ler, ochmacoside ve acteaside müdahalesinden sonra smad2)smad3 ve smad7 mRNA'nın ifadeleri
Smad3 ve smad2, TTGF-p sinyal yolunun anahtar aşağı akış efektörleridir [14,15] ve smad7, smad sinyalleşmenin bir inhibitörüdür. Teorik olarak, smad7'nin artmış ifadesi veya smad2/smad3'ün azalmış ifadesi, TGF-p 1/smad'de sinyal yollarının iletimini bloke edebilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, gerçek zamanlı nicel PCR analizi, smad2 ve smad3'ün mRNA ekspresyonunun daha düşük bir seviyeyi gösterdiğini, smad7'nin ise kontrol grubunda TGF-|31 grubu ile karşılaştırıldığında daha yüksek seviyeleri gösterdiğini gösterdi. TC (25, 50, 75,100 |dg/mL) grubunda, smad2'nin mRNA seviyesi (p < 0).{{37="" }}5)="" ve="" smad3="" (p="">< 0.01),="" tgf-pf="" grubu="" ile="" karşılaştırıldığında="" önemli="" ölçüde="" azaldı="" ve="" hatta="" kontrol="" grubuna="" benzerdi;="" bir="" süre="" önce,="" smad7'nin="" mrna="" seviyesi="" tc="" (50,="" 75,100="" µg/ml)="" grubunda="" önemli="" ölçüde="" arttı="" (sırasıyla="" p="">< 0.05,="" p="">< 0.05,="" p="">< 0.01).="" yine="" de;="" smad7="" ifadesi,="" tgf-p1="" grubuna="" kıyasla="" tc="" 25="" ug/ml="" grubunda="" artan="" bir="" eğilim="" gösterdi="" (şekil="">
Ortalama hile, TGF-p1 grubu ile karşılaştırıldığında, TE (62.5, 125, 250, 500 卩g'de smad2 ve smad3 mRNA'nın ifadesi önemli ölçüde azaldı. /mL) grubu (p < 0.01)="" ve="" smad7="" mrna="" ifadeleri="" te="" (125,="" 250,500="" 昭/ml)="" grubunda="" (p="">< 0.01)="" (şekil="" 4)="" önemli="" ölçüde="" arttı.="" .="" benzer="" şekilde="" ta="" (0.75,1.5,="" 3.0,="" 6.0="" ^g/ml)="" grubu="" da="" aynı="" eğilimi="" göstermiştir="" (şekil="">
2.6. HSC'de T GF-^i/smad Sinyal Yolu üzerindeki CPhG'ler, Ekinakozid ve Ac)eosidlerin Etkisi
TGF-p 1/smad sinyal yolu, smad2, smad3, fosfo-smad2 (p-smad2), fosfo-smad3 (p-smad3) ve smad7'ye bağlıdır; burada p-smad2, p-smad3, smad2 ve p-smad3'ün smad2 ve smad3. Bu çalışmada omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 ve smad7 protein seviyeleri analiz edildi. Western blot analizi, TGF-p1 tarafından smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 seviyelerinde artışlar ve bu artışların CPhG'ler, echincoside ve acteoside tarafından inhibe edildiğini saptadı; bu arada, wesiern leke analizi, CPhG'ler, ekinakozit ve ateozid tarafından yukarı regüle edilmiş smad7 seviyelerini ortaya çıkardı. (Şekil 6-8).
Şekil 6'da gösterildiği gibi, c on2rol grubu ile karşılaştırıldığında (smad2, smad3, p-smad2, p-smad3'ün protein ekspresyonları TGF-p1 grubunda önemli ölçüde artmış ve smad7 protein ekspresyonu azalmıştır. TC'de (25) , 50, 75, 100 昭/mL) ilaç grupları, smad/ (Şekil 6A), p-smad2 (Şekil 6B), smad 3 (Şekil 6C), p -smad3 (Şekil 6D) ekspresyonları TGF-p1 grubuna göre anlamlı derecede düşüktü (卩 < 0.01) ve smad7(Şekil 6E) protein ekspresyonu TGF-S1 grubuna göre daha yüksekti (p < 0.01) (Şekil 6).
Aynı zamanda HSC'ye ekinakozid ve ateosit müdahalesi sonrası smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 ve smad7 protein ifadeleri ölçüldü. Şekil 7 ve 8'de gösterildiği gibi smad2, smad3, p-smad2 ve p-smad3 protein ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde inhibe edildi (p < 0.05="" veya="" p="">< 0.01)="" ),="" smad7="" protein="" ekspresyon="" seviyesi="" yükseldi="" (p="">< 0.01),="" tgf-p="" 1="" grubu="" ile="" karşılaştırıldığında="" (şekil="" 7="" ve="">
3. Tartışma
Karaciğer fibrozu, dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir, ancak şu anda bu durum için çok sınırlı terapötik seçenekler mevcuttur, bu nedenle, karaciğer fibrozu gelişimini önlemek için terapötik müdahale için potansiyel hedefler aramak bizim için çok önemlidir. 16]. Son zamanlarda araştırmacılar, çeşitli bitkisel ilaçların anti-fibrotik etkilerin hepatoprotektif olduğunu bulmuşlardır. Fufang Biejia Ruangan hapları [17] ve Xiao-chai-hu kaynatma (Japonya'da shosaiko'ya) [18,19] gibi birçok TCHM, binlerce yıldır Çin, Kore ve Japonya'da hepatik fibrozisin tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. C. tubulosa, CPhG'ler, iridoidler ve polisakkaritler dahil olmak üzere çeşitli aktif bileşenler içerir. C. tubulosa'nın etkili materyal bazlarından biri olarak, CPhG'ler mükemmel hepatoprotektif aktiviteye sahiptir, ancak GPhC'lerin ve bununla ilgili bileşiklerin anti-fibrotik etkileri hakkında sınırlı bilgi vardır. Bu çalışmada, potansiyel anti-heptik fibrozis ajanları olarak TGF-p1/snaad'da CPhG'ler, ekinakozit ve ateozidin HSC aktivasyonunu nasıl baskıladığını ve sinyal yolu iletimini in vitro olarak nasıl bloke ettiğini araştırdık.
Herhangi bir etiyolojinin karaciğer hasarı, nihayetinde fibrojenik miyofibroblast benzeri hücrelere transdiferansiasyona uğrayan HSC'lerin aktivasyonuna yol açacaktır [20]. Yani miyofibroblastlar
HSCss'nin [21] aktivasyonu ve proliferasyonundan türetilir ve hepatik fibrozis oluşumunun aracısı olarak kabul edilir. Bu nedenle, CPhG'lere, ekinakozitlere ve akteositlere maruz kalan HSC'lerin hücre canlılık oranlarını karşılaştırmak için in vitro çalışmalar yaptık. Sonuçlar, acteosidin HSC üzerindeki inhibitör etkisinin en güçlü olduğunu ve CPhG'lerin etkisinin ekinakozidden daha iyi olduğunu gösterdi. CPhG'ler, ekinakozit ve ateozit ilaçlı serumların tümü, doza bağlı bir şekilde HSC proliferasyonunu inhibe etti.
LDH, canlı hücrelerde bulunan sitoplazmik bir enzimdir ve normal şartlar altında hücre zarına nüfuz edemez. Hücreler hasar gördüğünde membran geçirgenliği artar ve LDH hücre dışına salınır. Genellikle, LDH hücre hasarının derecesini [{{0}}] tespit edebilir. Araştırma, CPhG'lerin, ekinakozit ve ateozit ilaçlı serumun LDH aktivitesinin, hücre kontrol grubu ile karşılaştırıldığında yalnızca hafif bir artış gösterdiğini ve farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığını (p > 0.05), hücre zarının çoğunun bütünlüğünü koruduğunu gösterir şekilde gösterdi. ve HSC'lerin CPhG'ler, echinacoside ve acteoside tarafından inhibisyonu, spesifik olmayan hücresel toksisiteden kaynaklanmaz.
Karaciğer hasarı meydana geldiğinde, aktive edilmiş hepatositler, sırayla HSC-T6'yı aktive eden TGF-pi'yi serbest bırakabilir, bu nedenle TGF-pi'nin fibrozis ile yakın bir ilişkisi vardır [25-27]. Bu çalışmada, CPhG'ler, ekinakozit ve akteosit, HSC'ler in vitro wTGF-pi ile uyarıldıktan sonra HSC proliferasyonunun inhibisyonu için çekici bir terapötik strateji olarak düşünülebilir. CPhG'ler, ekinakozit ve akteozid'in karaciğer fibrozunun bir tür tedavisi ve/veya önlenmesi olarak kullanılabileceğini ve erken karaciğer fibrozisi oluşumunu engelleyebileceğini düşünüyoruz. Hepatik fibrozisin oluşumu, çok faktörlü ve çok hücreli tutulumun karmaşık bir sürecidir. Bu patolojik süreçte hücre-hücre, hücre-sitokinler ve hücre-matris etkileşimleri hantal bir ağ oluşturur. Bu ağda, hepatik fibrozisin gelişimi, farklı sinyal yolları ve araçları ile düzenlenebilir. TGF-pi, HSC'nin klasik bir aktivatörüdür ve karaciğer fibrozisinin patogenezinde anahtar bir aracıdır [28]. CPhG'ler, echinacoside ve acteoside, HSC'lerde TGF-pi/smad yolu ile ilgili mRNA ve proteinlerin ekspresyonlarını inhibe edebilir.
TGF-pi, hücresel etkilerini smad sinyal yolu aracılığıyla gösterir ve karaciğer fibrozu ve inflamasyonunun gelişiminde önemli bir aracı olarak kabul edilir. TGF-pi'nin TGF-p-tip II reseptörüne bağlanması üzerine, tip II reseptör kinaz, TGF-p tip I reseptörünün GS alanını fosforile ederek tip I reseptörün aktivasyonuna yol açar [29]. P-smad2 ve p-smad3'ün C terminallerinin SSXS motifindeki iki serin tortusunda eylemi yoluyla, smad sinyal yolunun akış aşağısındaki reaksiyonlar, tip I reseptörünün aktivasyonu ile aktive edilir [30]. P-smad2 ve p-smad3, smad4 ile oligomerik kompleksler oluşturur, daha sonra çekirdeğe girer ve biyolojik transkripsiyon aktivitelerini uygular. Böylece, smad proteinleri sinyalleri doğrudan reseptör kinazdan çekirdeğe iletir [3i]. Öte yandan, smad7, TGF-pi reseptörü ile sıkı bir şekilde birleştirilir, bu da smad 2/3'ün aktive edilememesine ve ayrıca sinyal iletim yollarının inhibisyonuna yol açar [32]. Smad7, p-smad2 ve p-smad3'ü, aktive edilmiş smad komplekslerinin nükleer translokasyonunu ve (CAGA) (9)-MLP-Luc'un aktivasyonunu inhibe ederek, kollajen I ekspresyonunun azalmasına ve TGF-p sinyal iletiminin tamamen inhibisyonuna neden olabilir. [33,34]. Sonuçlarımız, CPhG'ler, ekinakozit ve akteositin smad2 ve smad3 mRNA ifadelerini azaltabildiğini ve smad7 mRNA ifadesini artırabildiğini gösterdi; smad2, p-smad2, smad3 ve p-smad3 protein ekspresyonlarını inhibe eder ve smad7 protein ekspresyonunu yukarı düzenler; mekanizma.
Üç test maddesinin hepatoprotektif etkilerinin dizisinin, asteosit > CPhGs > ekinakozit olduğu gösterildi. CPhG'ler, ekinakozit ve akteozid'in karaciğer fibrozuna karşı koruma mekanizmasındaki farklılıkların nedenlerini daha fazla aydınlatmak için kimyasal yapıları analiz edildi. Fenetil alkol glikozit parçası, hepatoprotektif etki için temel bir yapı gibi görünmektedir [35]. Acteoside (C29H36Oi5) bir çift glikozittir ve echinacoside (C35H46O20) bir triglycoside'dır, yani ekinakozitin yapısında, ateozide kıyasla ekstra bir glikozit bulunur, bu da uzaysal boyutunda bir artışa neden olur. Acteosidin HSC aktivitesinin hepatoprotektif veya inhibisyonu, sterik engelin varlığından kaynaklanabilecek ekinakozitten daha iyidir.
karaciğeri koruyun: cistanche özü
4. Deneysel Bölüm
4.1. Kimyasallar ve tepkimeler
TGF-pi, Peprotech'ten (Rocky Hill, NJ, ABD) satın alındı. HSC-T6 hücre dizisi, Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd.'den (Wuhan, Çin) satın alındı. Dimetil sülfoksit (DMSO), Sigma Inc.'den (St. Louis, MO, ABD) satın alındı. Smad2, smad3 ve smad7 primerleri Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, China) tarafından üretildi. Revert Aid ilk sarmal cDNA sentez kiti Thermo Scientific'ten (Shanghai, China) satın alındı. Quantifast SYBR yeşil PCR kiti QIAGEN GmbH'den (Hilden, Almanya) satın alındı. p-smad2 (ser465/467) antikoru, Smad3 (C67H9) tavşan mAb ve p-smad3 (ser423/425) tavşan mAb, Cell Signaling Technology'den (Boston, MA, ABD) satın alınmıştır. Smad7 antikoru Boster'dan (Wuhan, Çin) satın alındı. Smad2 poliklonal antikoru ve p-aktin monoklonal antikoru, Proteintech'ten (Wuhan, Çin) satın alındı. Primer antikor tespiti, Invitrogen™'den (Carlsbad, CA, ABD) satın alınan 2 dereceli Antikor solüsyonu (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) ve 2. dereceli Antikor solüsyonu (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) kullanılarak yapıldı. Laktat dehidrojenaz tahlil kiti Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü'nden (Nanjing, Çin) alındı.
4.2. Bitki Malzemesi
C. tubulosa, Çin'in Xinjiang Uirghur autonomo us bölgesindeki Tulufan'dan Mayıs 2006'da toplanmıştır. Bitki materyalleri, Xinjiang Materia Medica Enstitüsü'nden Jiang He tarafından C. tubulosa olarak tanımlanmıştır. Çin'deki Xinjiang Materia Medica Enstitüsü'ne bir kupon örneği yatırıldı.
4.3. CPhG'lerin ve Bileşiklerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması
C. tubulosa'nın (6.0 kg) kurutulmuş ve dilimlenmiş rizomları, geri akış altında yüzde 70 etanol (4.8 L) ile art arda üç kez özümlendi ve daha sonra çözücü, birleşik özütlerden uzaklaştırıldı. etanol özü (1.146 kg) elde etmek için. Etanol özleri, ham fenil etanol gliozitleri (CPhG s) özünü elde etmek için AB-8 reçinesi ile saflaştırıldı. d'nin suda çözülmesinden sonra, ekstrakt AB-8 adsorpsiyon makrogözenekli reçine kromatografisi ile saflaştırılarak C. tubulosa'dan toplam fenil etanol gliko yanları elde edildi (CPhGs, 210 g). CPhG'ler bir ODS OP{{10}} kolonuna uygulandı ve art arda MeOH—H?.(0:1 -^1:0) karışımları ile ayrıştırıldı. Yıkamalar, CHCh-MeOH-Hy.(6:4:0.5) solvent sistemi kullanılarak TLC davranışına göre beş alt fraksiyonda birleştirildi. Noktalar, yüzde 1 FeCih püskürtüldükten sonra görselleştirildi. Çeşitli fraksiyonlar, elüent olarak metanol ile Sephadex LH-20 kolon kromatografisiyle tekrar tekrar saflaştırıldı ve CPhG'lerden iki fenil etanol glikozit izole edildi. Yapılarının ekinakozit (C35H46O20) ve asteozit (C29H36O15) olduğu MS, 1H- ve MC-NMR [35] kullanılarak doğrulandı ve bu saflıkların UV-HPLC ile sırasıyla yüzde 99.17 ve yüzde 98.92 olduğu belirlendi. Ekinakozit ve ateozit yapıları Şekil 9'da gösterilmiştir.
4.5. CPhG'lerin Kantitatif Tayini
Sıvı kromatografisi (HPLC) (LC{{0}}Bir HPLC cihazı, Shimadzu Co., Kyoto, Japonya), CPhG'lerdeki ekina kosid ve bir cteoside içeriğini analiz etmek için kullanıldı. 30 derecede bir Phenomenex Gemini ODS kolonu (250 x 4.6 mm, 5 |^m) kullanıldı. Yüzde metanol-asetonitril-1 asetik asitten (15:10:75, v/v/v) oluşan izokratik bir mobil faz, UV ile 0,6 mL/dk'lık bir akış hızında 40 dakikalık bir çalışma için kullanıldı. 334 nm'de algılama.
4.6. Hücre kültürü
HSC hücreleri, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (Yüksek Glikoz) (DMEM, Beijing, Çin) yüzde 10 fetal sığır serumu (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, ABD), 10 ile desteklendi. 0 IU/mL penisilin ve 100 ^g/mL streptomisin (HyClone, Logan, UT, ABD) yüzde 5 CO2 ile 37 derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde. Bu hücreler, tripsin yüzde 0.25 (1x) solüsyonu (HyClone, Logan, UT, ABD) ile düzenli olarak alt kültürlendi ve ortam her 2 günde bir değiştirildi. Başlangıçta hücreler, 48 saat boyunca yüzde 10 FBS içeren DMEM ile kültürlendi. Ortam daha sonra hücreleri 12 saat aç bırakmak için FBS içermeyen DMEM ile değiştirildi. Bu hücreler 48 saat boyunca çoğaltıldı ve 48 saat sonra serum, 5 ng/mL TGF-&1 eklenmeden önce 12 saat boyunca yüzde 0.5 FBS ile aç bırakıldı.
4.7. IC50 Değerlerinin Belirlenmesi
Yüzde {0}}.5 FBS içeren açlık ortamında bir gece inkübasyondan sonra, HSC hücreleri, 24 saat boyunca 5 x 104 hücre/mL yoğunlukta bir 96-kuyu plakasına ekildi. HSC hücreleri, 48 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda (0, 3.90625, 7.8125, 15.625,31.25, 62.5, 125, 250 ve 500 ^g/mL) CPhG'ler, ekinakozit ve asteosit ile muamele edildi. Her konsantrasyonun dört kuyusu vardı. Tedavi sonunda 20 µL MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür] (Sigma; 5 mg/mL) eklendi ve hücreler 4 saat daha inkübe edildi. Süpernatantın çıkarılmasından sonra her bir oyuğa DMSO (200 rL) ilave edildi. Plaka bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika çalkalandıktan sonra, bir enzim etiketleme aleti (Benchmark PLUS, Hercules, CA, ABD) kullanılarak 490 nm dalga boyunda absorbans ölçülerek IC50 değerleri elde edildi, bu deney üç kopya halinde yapıldı. CPhGs, echinacoside ve acteoside IC50 değerleri sırasıyla 119.125, 520.345 ve 6.999 Rg/mL idi.
4.8. Hücre Proliferatif İnhibisyon Etkileri ve Hücre Canlılığı
HSC hücreleri, farklı konsantrasyonlarda CPhG'lere (25,50,100 Rg/mL), ekinakozit (125,250,500 Rg/mL) ve ateozide (1.5,3,6 Rg/mL) maruz bırakıldı. Plaka üzerine farklı konsantrasyonlarda CPhG'ler, ekinakozid ve akteozid, ardışık dört kuyucukta uygulandı ve 48 saat süreyle inkübe edildi. Hücre proliferasyonunu inhibisyon etkileri ve hücre canlılığı seviyesi (hasarlı hücrelerden süpernatana salınan LDH aktivitesinin ölçümüne dayalı olarak [36]) bir MTT tahlili ile belirlendi. İnhibisyon oranı, aşağıdaki formül [37] kullanılarak hesaplandı:
İnhibisyon oranı ( yüzde ) " [1 — (deney grubunun ortalama absorbansı/boş kontrol grubunun ortalama absorbansı)] x yüzde 100
Kitin talimatına göre,
LDH (U/L) {{0}} (Ölçülen OD — kontrol OD)/(standart OD — boş OD) x 0,2 mmol/L x 1000
Ön çalışmamız CPhG'ler, ekinakozit ve ateozidin hücre canlılığını etkilemediğini gösterdi.
4.9. TGF-^1 Tarafından Anti-Proliferatif Aktiviteler
TGF-p1 tarafından aktive edilen HSC'nin uzun süredir karaciğer fibrozu ile ilişkili olduğu düşünülmüştür ve HSC büyümesi için inhibisyon, karaciğer fibrozunun tedavisi için bir yöntem olarak önerilmiştir [36,38]. CPhG'ler, ekinakozid ve ateozid'in TGF-p1 tarafından aktive edilen HSC'ler üzerindeki anti-proliferatif etkileri bir MTT tahlili ile belirlendi [39]. Açıklandığı gibi prosedürleri ve ilaç konsantrasyonlarını kullanarak,
deney grupları, kontrol grubu, TGF-pi grubu, TGF-pi artı farklı konsantrasyondaki ilaç gruplarını içermiştir. Kontrol grubu dışındaki tüm hücre grupları, 24 saat boyunca 5.0 ng/mL TGF-p1 (FBS'siz) içeren DMEM ile kültürlendi. Hücre proliferasyonu üzerindeki inhibitör aktivite 100 x (tedavi edilen bileşiğin absorbansı — arka plan ışığının absorbansı)/(modelin absorbansı — arka plan ışığının absorbansı) olarak hesaplandı.
4.10. Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)
smad2, smad3 ve smad7'nin mRNA ekspresyon seviyesi real-time PCR ile belirlendi. HSC hücrelerinde mRNA ekspresyonunu belirlemek için hücreler (5 x 1{8}}4 hücre), yüzde 10 FBS ile 3.0 mL DMEM ile altı oyuklu plakalara ekildi ve gece boyunca 37 derecede inkübe edildi ve yüzde 5 CO2. Kültür ortamı serumsuz DMEM ile değiştirildikten sonra, oyuklara CPhG'ler (100,50,25 µg/mL), ekinakozit (500,250,125 µ/mL) ve ateozit (6, 3,1.5 µg/mL) ilave edildi. CPhG'ler ve monomer bileşimleri ile 48 saat inkübasyondan sonra, toplam RNA, TRIzol reaktifi (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak özümlendi ve 15 saniye boyunca kloroform ile kuvvetli bir şekilde çalkalandı. Oda sıcaklığında 3 dakika bekletildikten sonra lizat 12,000 xg'de 15 dakika 4 derecede santrifüjlendi. Sulu fazdaki RNA, izopropanol ile çökeltildi ve üst sulu faz, yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. RNA, yüzde 0.75 etanol eklenerek çöktürüldü, ardından mikrosantrifüj tüpü ve 12,000 xg'de 4 derecede en fazla 5 dakika santrifüjlendi. Süpernatan çıkarıldı ve RNA, oda sıcaklığında 5-10 dakika kurutuldu. Primerler (Sangon), Batch Primer 3 kullanılarak tasarlandı ve Tablo 4'te listelendi. Sonuçlar, dahili kontrol olarak temizlik geni p-aktin mRNA'sına normalleştirildi ve göreceli mRNA seviyeleri olarak sunuldu. Reaksiyonlar 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pM primer çifti, 8.5 damıtılmış su ve 2.5 rL cDNA ile gerçekleştirilmiştir.
Her polimeraz zincir reaksiyonu, aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirildi: 3 dakika boyunca 95 derece, ardından 95 derecede 10 sn, 55 derecede 30 sn ve uzatma için 55 derece -95 derecede 10 sn'lik 40 döngü, ardından tek bir floresan ölçümü. Nihai sonuçlar, bağıl değerlerle (2_AACt) açıklanmıştır. Hesaplama ve analiz iQ5 Real Time PCR Detection System ile yapılmıştır.
4.11. Western Blot Analizi
Bütün hücre özleri, yüzde 1 Halt proteaz inhibitörü ve yüzde 1 Halt fosfataz inhibitörü kokteylleri (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ile Radyoimmünopresipitasyon Tahlili (RIPA) tamponu (Thermo Fisher Scientific, Inc.) kullanılarak hazırlandı. Toplam protein, smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 ve smad7'nin tespiti için kullanıldı. Protein konsantrasyonu, Bradford yöntemiyle ölçüldü ve nicelendirildi. Protein (10-30 Rg), yüzde 10 SDS-PAGE jeli üzerinde ayrıldı ve poliviniliden florür (PVDF) membranlarına (Millipore, Boston, MA, ABD) aktarıldı. Zarlar, oda sıcaklığında, yüzde 5 bovin serum albümini ve birincil antikorlar (smad2 poliklonal antikor, p-smad2 antikoru, smad3 tavşan mAb ve p-smad3 tavşan mAb, 1:1000 seyreltme; tavşan mAb'si smad7, 1 ile oda sıcaklığında 1 saat bloke edildi. :200 seyreltme, p-aktin monoklonal antikor, 1:5000 seyreltme) 4 derecede gece boyunca inkübe edildi. İlgili Alk-Phos. konjuge sekonder antikorlar oda sıcaklığında inkübe edildi. Son olarak, membranlar yüzde 0.1 Tween 20 içeren 1 x Tris-HCl salin ile üç kez yıkandı ve sinyaller bir GEL DOC XR Görüntüleme Sistemi (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) tarafından tarandı ve görselleştirildi. İlgilenilen proteinler üzerinde dansitometrik analiz yapıldı ve GEL DOC Image Studio yazılımı (Bio-Rad) ile p-aktine normalleştirildi. p-aktin iç kontrol olarak kullanıldı.
4.12. İstatistiksel analiz
Veriler ortalama 土 standart sapma (SD) olarak ifade edildi. İstatistiksel analizler SPSS 16.0 yazılımı (Xinjiang Medical University) kullanılarak yapıldı. IC50 değerlerini analiz etmek için probit analizi kullanıldı. Farkın anlamlılığı tek yönlü ANOVA testi ile hesaplandı ve p < 0.05="" olan="" değerler="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" kabul="">
5. Sonuçlar
Sonuç olarak, C. tubulosa'dan elde edilen CPhG'ler ve bileşenleri echinacoside ve acteoside önemli anti-fibrotik etkiler göstermektedir. Bunlar arasında, acteoside aktivitesi en güçlüsüdür, CPhG'lerin aktivitesi ise iki bileşik arasındadır. TGF-p1/Smad sinyalinin aktivasyonunun inhibisyonu, CPhG'lerin fibrozis ile bağlantılı kronik karaciğer hastalığına karşı koruma sağladığı temel mekanizma olabilir ve ekinakozit ve akteosit, C. tubulosa'nın etkili anti-fibrotik materyal temelidir.
Teşekkür:Bu araştırma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81260624) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Profesör Tao Liu'ya bu makaledeki yazıları geliştirmesinden dolayı içten teşekkürlerini ifade etmek isterler.
Yazar Katkıları:TL, JZ, S.-PY, LM ve S.-LZ deneyleri tasarladı ve tasarladı. S.-PY, TL ve JZ verileri analiz etti. S.-PY ve JZ taslağı yazdı. TL, LM ve JZ makaleyi inceledi. Tüm yazarlar son makaleyi okudu ve onayladı.
Çıkar çatışmaları:Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Referanslar
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Karaciğer hastalıkları için bitkisel ilaçların geliştirilmesi. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31,166-175.
2. Friedman, SL Hastalık mekanizmaları: Hepatik fibroz mekanizmaları ve terapötik çıkarımlar. Nat. Klinik. Pratik yapın. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Rulo, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Hepatik lipositler: Normal sıçan karaciğerinin başlıca kolajen üreten hücreleri. Proc. Natl. Acad. bilim ABD 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Hepatik fibrozisin tersine çevrilmesi一Gerçek mi fantezi mi? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmet, A.; Ahmad, R. Hepatik fibrozun mekanizmasını ve potansiyel terapötik yaklaşımları anlamak. Suudi J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Peter, H.; kuzgun; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. Çin Flora'sında, 23. baskı; Çin Flora Yayın Komitesi: Çin Bilimler Akademisi, Pekin, Çin, 2013; s. 1-16.
7. Çin Halk Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Çin Farmakopesi Komisyonu. Çin Farmakopesi; Bölüm 1; Kimya Endüstrisi Yayınevi: Pekin, Çin, 2010; p. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; He, L. Roucongrong'un (Herba Cistanches Deserticolae) Leigongteng glikoziti (Radix et Rhizoma Tripterygii) tarafından indüklenen farelerde üreme toksisitesi üzerindeki etkisi. J. Gelenek. Çene. Med. 2014, 34, 324-332. [Çapraz Referans]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Keskin.; Zhang, P.; Tan, C.; NIH.; Wu, X.; Li, N.; Sincan'da yetişen Tamarix hohenackeri Bunge'den (Herba Cistanches'in ev sahibi bitkisi) Jia, X. ACE ve trombosit agregasyon inhibitörleri. farmakoj. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salih, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Ekinakozitle zenginleştirilmiş Cistanche tubulosa özütü ile farelerde dekstran sülfat sodyum kaynaklı kolitin iyileştirilmesi. Fitoster. Araş. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches, H9c2 kardiyomiyositlerinde mitokondriyal solunumdan üretilen reaktif oksijen türleri tarafından hücresel glutatyon redoks döngüsünü uyarır. Eczacılık Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Asit fosfataz: İn vitro toksisite testleri için son nokta. Tüp Hücre. geliştirici Biol. 1991, 27, 183-184. [Çapraz Referans]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01, p38MAPK, PI3-kinaz, AKT ve p70S6k'yi içeren karmaşık mekanizmalarla hepatik yıldız hücrelerinde matris metalloproteinaz-13 ifadesini modüle eder. Ben. J. Physiol. Gastrointest Karaciğer Fizyol. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load, TGFp'ye bağlı bir mekanizma yoluyla kemik oluşumunu ve Sklerostin ekspresyonunu düzenler. PLoS BİR 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pesah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun, onkoprotein Ski ile ilişki kurar ve Smad2 transkripsiyonel aktivitesini bastırır. J. Biol. Kimya 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; O, M.; Scott, C.; et al. Bir D Vitamini reseptörü/SMAD genomik devresi, hepatik fibrotik yanıtı açar. Hücre 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Fufang Biejia Ruangan Haplarının in vivo ve in vitro hepatik fibroz üzerindeki etkileri. Dünya J. Gastroenterol. 2013,19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, İ.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Bitkisel ilaç Sho-saiko-to (TJ-9), sıçan stellat hücresinde metalloproteinazların doku inhibitörünün (TIMP'ler) azaltılmış ekspresyonu ile ekspresyon matrisi metalloproteinazlarını (MMP'ler) arttırır. Hayat Bilimi. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY Sıçan/lar safra kanalı ligasyonu modelinde Sho-saiko-to tarafından karaciğer fibrozunun modülasyonunda TGF-01 ve sitokinlerin rolü. J. Etnofarmakol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, EC Biyokimyasal belirteçler, karaciğer fibrozu ve sirozda hücre dışı bileşenler. zenci QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Karaciğer fibrozunda miyofibroblastların kaynağı ve rolü. Çene. Farmakol. Boğa. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukuşima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, Pazarlama Müdürü; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Sıçan omuriliğinde iskemi-reperfüzyon modeli: Hücre canlılığı ve apoptoz sinyal çalışması. Int. J. Clin. Tecrübe. Patol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Makbul, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Nanopartiküllerin toksisitesi ve mevcut deneysel modellere genel bakış. İran Biyomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
