Trombosit İnhibisyonu, NLRP3 Enflamasom Aktivasyonunu ve Sepsise Bağlı Böbrek Hasarını Önler

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Marivee Borges-Rodriguez ve diğerleri

Soyut:

Trombozun hücresel aracıları olan trombositler, sepsis sırasında aktive edilir ve giderek artan bir şekilde bağışıklık tepkisinin aracıları olarak kabul edilir. Sepsis hastalarında trombosit aktivasyonu YBÜ kontrol hastalarına göre anlamlı olarak artmıştır. Bu korelasyona rağmen, aktive trombositlerin sepsis patofizyolojisine katkıda bulunmadaki rolü belirsizliğini koruyor. Daha önce, çekal ligasyon ponksiyonu (CLP) sıçanlarından sepsis kaynaklı trombositlerde NOD benzeri reseptör protein 3 inflamatuar (NLRP3) inflamatuar aktivasyonunu göstermiştik. Aktive trombositler, CLP'ye karşı SHAM kontrollerinde artmış pulmoner ödem ve glomerüler hasar ile ilişkilendirildi. Bu çalışmada, trombosit aktivasyonunun inhibisyonunun NLRP3 aktivasyonunu ve CLP'ye yanıt olarak renal ve pulmoner hasarı azaltıp azaltmayacağını araştırdık. Erkek ve dişi Sprague Dawley (SD) sıçanlarında (n=10/grup) abdominal sepsisi indüklemek için CLP uygulandı ve SHAM sıçanları kontrol olarak görev yaptı. CLPanimals'ın bir alt kümesi, trombosit aktivasyonunu inhibe etmek için Clopidogrel (10 mg/kg/gün, CLP artı CLOP) ile tedavi edildi. CLP'den 72 saat sonra, trombosit aktivasyonu ve NLRP3 inflamatuar düzeneği değerlendirildi, plazmada IL-1 ve IL-18 ölçüldü ve dokular, böbrek ve pulmoner patoloji ve böbrek fonksiyonu değerlendirildi. Aktive trombositler Sham'de yüzde 7,8 ± 3,6, CLP'de yüzde 22 ± 6 idi ve önemli ölçüde CLP artı CLOP'ta yüzde 14,5 ± 0,6'ya düştü (n=8–10/grup, p < 0.05)="" .="" nlrp3="" inflamatuar="" düzeneği,="" clp="" artı="" clop="" hayvanlarının="" trombositlerinde="" clp'ye="" karşı="" inhibe="" edildi.="" clp'ye="" yanıt="" olarak="" plazma="" ve="" böbrek="" il-1="" ve="" il-18'daki="" önemli="" artışlar="" clopidogrel="" tedavisi="" ile="" azaldı.="" böbrek="" hasarı,="" ancak="" akciğer="" histolojisi="" veya="" böbrek="" fonksiyonu="" değil,="" clp="" artı="" clop'a="" karşı="" clp'de="" düzeldi.="" bu="" veriler,="" aktive="" trombositlerin,="" muhtemelen="" trombositlerde="" nlrp3="" aktivasyonu="" yoluyla="" sepsis="" kaynaklı="" böbrek="" hasarına="" katkıda="" bulunabileceğine="" dair="" kanıt="" sağlar.="" trombositler,="" septik="" hastalarda="" böbrek="" hasarını="" azaltmak="" için="" terapötik="" bir="" hedef="">

Anahtar Kelimeler:sepsis; NLRP3; trombositler; klopidogrel; çoklu organ yaralanması; endotel aktivasyonu;iltihap

cistanche tubolosa özü: iltihap önleyici

1. Giriş

Sepsis, enfeksiyöz bir ajana [1] yaşamı tehdit eden düzensiz konağın inflamatuar yanıtıdır ve dünyadaki önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Amerika'da en az 1,7 milyon yetişkin sepsis geliştirir ve her yıl yaklaşık 270,000 Amerikalı sepsis nedeniyle ölür [2]. Sepsis, akut akciğer hasarı (ALI) dahil olmak üzere çoklu organ disfonksiyonuna yol açar [3],akutböbrekincinme(AKI) [4,5], hematolojik ve merkezi sinir sistemi disfonksiyonu, diğerleri arasında. Artan sayıda sepsise dahil olan organlar artmış mortalite ile ilişkilidir [6]. Mevcut tedavi modaliteleri destekleyici bakıma odaklanır; ancak, ölüm oranı yüksek kalır. Hastane içi ölümlerin yaklaşık yüzde 35 ila 50'sinin sepsise bağlı olduğu bildirilmiştir [7]. Sepsise bağlı mortaliteyi iyileştirebilecek bir terapötik hedef belirlemek çok önemlidir.

Trombositlerin hemostaz ve trombozdaki rollerinin yanı sıra bağışıklıkta da rolü olduğu bilinmektedir [8,9]. Sepsiste trombositopeni sıklıkla görülür ve trombosit aktivasyonu ve tüketimine bağlı olarak oluştuğu düşünülür; ancak hastalık sürecindeki rolü belirsizliğini koruyor. Trombositopeni (çoklu organ yetmezliği) MOF gelişimi ve artan 90-gün mortalitesi [10–14] ile ilişkilidir. Trombositler, sepsise karşı inflamatuar yanıtın ayrılmaz bir parçası olabilir. Trombositlerin çoklu organ hasarına katkıda bulunabileceği potansiyel bir mekanizma, NOD benzeri reseptör protein 3 inflamatuarının (NLRP3) aktivasyonudur. NLRP3, kaspaz-1 aracılı bölünmeye ve IL-1B ve IL-18 aktivasyonuna yol açan ve astım gibi inflamatuar hastalık süreçlerinin patogenezinde rol oynayan bir sitozolik immün sinyal reseptörüdür [15 ], Parkinson [16], inflamatuar bağırsak hastalığı [17] ve sepsis [18]. NLRP3 inflamatuar düzeneğinin inhibisyonunun, sepsis kaynaklı organ hasarına karşı koruyucu olduğu gösterilmiştir [19-23]. NLRP3 iltihabının çekal ligasyon delinmesine (CLP) yanıt olarak trombositlerde aktive olduğunu ve 72 saatlik bir CLP sıçan modelinde polimikrobiyal sepsise yanıt olarak çoklu organ hasarı ile ilişkili olduğunu daha önce göstermiştik. Bu çalışmada, trombosit aktivasyonunun Clopidogrel (CLOP) ile bloke edilmesinin, polimikrobiyal sepsise yanıt olarak NLRP3 inflamatuar aktivasyonunu, böbrek ve akciğer hasarını azaltacağını varsaydık.

cistanche flavonoidler: iltihap önleyici

2. Sonuçlar

2.1. Plaka Aktivasyonu ve NLRP3 Inflflammasome Montajı

Akış sitometrisini kullanarak gruplar arasında trombosit aktivasyonunun yüzdesini belirledik. CLP sıçanlarında trombosit aktivasyonunun SHAM'a kıyasla yüzde 22 ± 6 oranında arttığını (p < 0.{{10}}5)="" ve="" clp'de="" azaldığını="" bulduk.="" artı="" clop="" sıçanları="" yüzde="" 14,5="" ±="" 0,6="" (p="">< 0.05,="" şekil="" 1).="" trombositlerdeki="" nlrp3="" inflamatuar="" düzeneği,="" nlrp3'ün="" apoptoz="" ile="" ilişkili="" benek="" benzeri="" protein="" (asc)="" ile="" birlikte="" lokalizasyonunun="" immünositokimya="" kullanılarak="" görselleştirilmesiyle="" değerlendirildi="" (şekil="" 2).="" clp="" trombositlerinde="" inflamatuar="" bileşenlerin="" birlikte="" lokalizasyonu="" sham="" trombositlerine="" kıyasla="" 83="" kat="" daha="" fazlaydı="" (şekil="" 2c).="" ayrıca,="" clp="" ile="" karşılaştırıldığında,="" clp="" artı="" clop="" trombositlerinde="" enflamasyonun="" montajı="">

2.2. Enflamasyonla İlişkili Sitokinler

NLRP3 aktivasyonu, proinflamatuar sitokinler IL-1 ve IL-18'nin aktif formlarına salınmasıyla sonuçlanır. Her iki sitokini de plazmada ölçtük,akciğer, veböbrekhomojenatlarELISA yoluyla SHAM, CLP ve CLP artı CLOP. Plazma IL{{0}}, Sham'da 9 ± 21 pg/mL'den CLP'de 77 ± 31 pg/mL'ye önemli ölçüde arttı (p < {{10}}).0="" 5,="" şekil="" 3a).="" klopidogrel="" uygulaması="" plazma="" il-1="" 48="" ±="" 38="" pg/ml'de="" bir="" azalma="" gösterdi;="" ancak,="" düşüş="" clp="" ile="" karşılaştırıldığında="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" değildi="" (p="">< 0.05'e="" karşı="" sham).="" benzer="" şekilde,="" sham="" 2.5="" ±="" 0.9="" pg/mg="" ile="" karşılaştırıldığında="" clp="" 4="" ±="" 3="" pg/mg'de="" renal="" il-1="" yükselmiştir="" (p="">< 0.05,="" şekil="" 3b).="" klopidogrel="" ile="" tedavi="" renal="" il'yi-1="" önemli="" ölçüde="" 1.8="" ±="" 0.8="" pg/mg'ye="" düşürdü="" (p="">< 0.05).="" akciğerlerde,="" il-1="" sham'da="" 70="" ±="" 16="" pg/mg'den="" clp'de="" 106="" ±="" 36="" pg/mg'ye="" (p="">< 0.05)="" önemli="" ölçüde="" arttı="" ve="" clopidogrel="" ile="" tedavi="" edilen="" hayvanlarda="" (80="" ±="" 23="" pg)="" önemli="" ölçüde="" farklı="" değildi="" g,="" şekil="">

SHAM farelerinde plazma IL{{0}} saptanamadı; bununla birlikte, ortalama plazma IL-18, CLP'de 26 ± 6 pg/mL idi. Önemli olarak, Klopidogrel uygulaması daha düşük plazma IL-18 seviyelerine neden olmuştur (12 ± 9 pg/mL; p < 0.{{20}}5,="" şekil="" 3d).="" benzer="" şekilde,="" sham'e="" kıyasla="" (317="" ±="" 73="" pg/mg;="" p="">< 0.05)="" clp'de="" (396="" ±="" 65="" pg/mg)="" renal="" il{{10}}="" yükselmiştir.="" klopidogrel="" ile="" tedavi="" renal="" il'yi-18="" 214="" ±="" 70="" pg/mg'ye="" düşürdü="" (p="">< 0.05,="" şekil="" 3e).="" akciğerlerde,="" il-18="" sham'da="" 704="" ±="" 219="" pg/mg'den="" clp'de="" 999="" ±="" 158="" pg/mg'ye="" (p="">< 0.05)="" önemli="" ölçüde="" arttı="" ve="" clopidogrel="" ile="" tedavi="" edilen="" hayvanlarda="" 1014="" ±="" 235="" pg/mg="" (="" p="">< 0.05="" -="" sham,="" şekil="">

2.3. Endotel Aktivasyonu

ELISA yoluyla Sham, CLP ve CLP artı CLOP gruplarında endotel aktivasyon belirteçleri olarak anjiyopoietin{{0}} ve endokan plazma seviyelerini ölçtük. Plazma endokanı Sham'da 1234 ± 327 pg/mL'den CLP'de 1978 ± 306 pg/mL'ye (p < {{20}}.05'e="" karşı="" sham)="" önemli="" ölçüde="" arttı.="" endokan,="" clopidogrel="" ile="" tedavi="" edilen="" clp="" sıçanlarında="" önemli="" ölçüde="" 1521="" ±="" 283="" pg/ml'ye="" düşürüldü="" (clp'ye="" karşı="" p="">< 0.05,="" şekil="" 4a).="" anjiyopoietin-2="" için="" de="" benzer="" sonuçlar="" bulundu.="" anjiyopoietin-2,="" sham'de="" 5603="" ±="" 2142="" pg/ml'den="" clp'de="" 56.767="" ±="" 40,000="" pg/ml'ye="" (p="">< 0.05'e="" karşı="" sham)="" önemli="" ölçüde="" arttı="" ve="" clopidogrel="" ile="" tedavi="" edilen="" sıçanlarda="" 22.486="" ±="" 13.616="" pg/ml="" (p="">< 0.05'e="" karşı="" clp,="" şekil="">

2.4. Akciğer Hasarı

Her gruptan akciğerlerin histolojik analizi, CLP sıçanlarında {{6} puana kıyasla ortalama {{0}}.6 ± 0.2 puanla nötrofil infiltrasyonunda önemli bir artış gösterdi. Sham farelerde }.10 ± {{10}}.10 (p < 0.05).="" ayrıca="" clp="" sıçanlarına="" klopidogrel="" uygulamasının="" nötrofil="" infiltrasyonunu="" değiştirmediğini="" gözlemledik="" (skor="" 0.5="" ±="" 0.4,="" şekil="" 5a).="" sham="" sıçanlarında="" 0,8="" ±="" 0,3="" µm'ye="" kıyasla="" ortalama="" 1,2="" ±="" 0,1="" µm="" kalınlığa="" sahip="" clp'de="" önemli="" bir="" artış="" ile="" alveolar="" duvar="" kalınlığında="" benzer="" sonuçlar="" bulundu="" (p="">< 0.05).="" clp="" sıçanlarına="" klopidogrel="" uygulaması,="" alveolar="" duvar="" kalınlığını="" iyileştirmedi="" (şekil="">

2.5. böbrek hasarı

Daha önce yayınladığımız gibi, GFR 2,1 ± 0,8 mL/dk/100 g'den önemli ölçüde düştü, ancak Sham sıçanlarda {{10}}'a düştü. .7 ± 0.2 mL/dak/100 g ancak CLP sıçanlarında (p < 0.05).="" klopidogrel="" uygulaması,="" gfr'nin="" 1,3="" ±="" 0,5="" ml/dk/100="" g'a="" yükseldiğini="" gösterdi,="" ancak="" clp'ye="" kıyasla,="" ancak="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" değildi="" (şekil="" 6a).="" histolojik="" analiz,="" sham'e="" kıyasla="" clp="" grubunda="" artan="" glomerüler="" hasarı="" gösterdi.="" klopidogrel="" tedavisi,="" clp="" hayvanlarında="" glomerüler="" hasarı="" önemli="" ölçüde="" iyileştirdi="" (şekil="">

cistanche sağlık yararları: daha iyi böbrek fonksiyonu

3. Tartışma

Sepsis, genellikle çoklu organ yetmezliği ile ilişkili ve yüksek mortaliteye sahip olduğu bilinen, enfeksiyöz bir ajana karşı düzensiz bir bağışıklık tepkisidir. İnflamatuar yanıtı modüle edebilecek ve mortaliteyi azaltabilecek yeni bir terapinin tanımlanmasına ihtiyaç vardır. Trombositlerin immünomodülasyonda rol oynadığı öne sürülmüştür. Doğal olarak, pıhtılaşma kaskadı ve trombosit aktivasyonu, araştırmanın öne çıkan odak noktası olmuştur. Antikoagülan endojen bir enzim olan protein C'nin uygulanması, şiddetli sepsisli hastalarda daha iyi sağkalım ile ilişkilendirilmiştir [24]. Japonya'da sepsis kılavuzları, DIC'li septik hastalarda zamanlı antitrombin uygulamasının kullanımını içerir ve iyileştirilmiş sonuçlar göstermiştir [25]. Bu, trombosit aktivasyonunun inhibe edilmesinin sepsisteki sonuçları iyileştirebileceğini düşündürmektedir. Sepsis sırasında inflamatuar yanıt kesinlikle karmaşıktır ve birden fazla yolu içerebilir. CLP polimikrobiyal sepsis modelindeki trombositlerin trombosit NLRP3 düzeneğini/aktivasyonunu artırdığını ve akciğer ve böbrek hasarı ile ilişkili olduğunu daha önce yayınlamıştık [26]. Bu çalışmada, aynı modelde P2Y12 inhibitörü Clopidogrel kullanılarak trombosit inhibisyonunun inflamatuar yanıttaki rolünü belirlemek için yola çıktık.

Daha önce yayınlandığı gibi, Sham sıçanları ile karşılaştırıldığında CLP modelinde polimikrobiyal sepsise yanıt olarak trombosit aktivasyonu arttı. Klopidogrel uygulamasının CLP sıçanlarında trombosit aktivasyonunu azalttığını bulduk ve ilginç bir şekilde trombositlerde NLRP3 inflamatuar oluşumunda da bir azalma gözlemlendi. Ayrıca, CLP grubuyla karşılaştırıldığında, Clopidogrel ile tedavi edilen hayvanların plazmasında dolaşımdaki IL-1B ve IL-18'de azalma eğilimi bulduk. Daha önce yayınlanmış bir çalışmada, NLRP3 inflamatuarının MCC950 ile doğrudan inhibisyonunun plazmada azalmış IL-1B ve IL-18 ile sonuçlandığını bildirdik [27]. Bu, Klopidogrel ile trombosit aktivasyonunun inhibisyonuna ve bu sepsis modelinde inflamatuar sitokinlerdeki azalmaya kısmen NLRP3 mekanizmalarının aracılık ettiğini göstermektedir. Bu nedenle, trombositlerde NLRP3'ün aracılık ettiği inflamatuar yolakları daha net bir şekilde tanımlamak için daha ileri çalışmaların yapılması gerekmektedir.

Multi-organ failure (MOF) occurs frequently in sepsis. Previously published studies reported that in mice, the CLP model caused significant pulmonary damage; and depletion of platelets reduced CLP-induced edema and neutrophil recruitment in the bronchoalveolar space by >yüzde 60 [28]. Artmış trombosit aktivasyonunun, CLP sıçan modelinde çoklu organ disfonksiyonu ve yaralanması ile ilişkili olduğunu daha önce yayınlamıştık [26]. Verilerimiz, IL-1 ve IL-18'de önemli bir düşüş gösteriyor.böbreklerklopidogrel ile tedavi edilen hayvanlarda Akut böbrek yetmezliği ve sepsis kombinasyonu, tek başına akut böbrek yetmezliği olan hastalarda yüzde 45 mortalite ile karşılaştırıldığında, yüzde 70 mortalite ile ilişkilidir [29]. Glomerüler filtrasyon hızı (GFR),böbrekişlevve artan böbrek hasarı ile azalır. Klopidogrel tedavisi, CLP sıçanlarında böbrek hasarını iyileştirdi, bu da trombosit aktivasyonunun sepsis kaynaklı AKI gelişiminde rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

cistanche özü faydaları: böbrek fonksiyonunu iyileştirir

MOF'ye neden olma rolüyle uyumlu olarak, ALI ve akut respiratuar distres sendromu (ARDS) gelişimi sepsis hastalarında yaygındır ve bu hasta popülasyonunda sıklıkla mekanik ventilasyon ihtiyacı ile sonuçlanır. Kanıtlar, trombosit aktivasyonunun septik hastalarda MOF gelişiminde önemli bir rol oynadığını göstermektedir [8,30]. Önceki çalışmalar, trombosit tükenmesinden sonra CLP ile indüklenen septik farelerin akciğerlerinde nötrofil infiltrasyonunun azaldığını göstererek bunu desteklemiştir [28]. Ayrıca Liverani ve ark. Clopidogrel ile önceden tedavi edilen farelerin sepsis kaynaklı ALI'ye dirençli olduğunu bildirdi [31]. Bununla birlikte, mevcut çalışma akciğerlerde IL- 1, nötrofil infiltrasyonu veya alveolar duvar kalınlığını azalttığına dair herhangi bir önemli kanıt gösteremedi. Bunun nedeni farklı bir hayvan türünün kullanılması, bir doz Clopidogrel ve deney tasarımındaki diğer farklılıklar olabilir.

Kılcal sızıntı sepsisin belirgin bir özelliğidir. Vasküler büyüme faktörü anjiyopoietin-2 gibi proteinlerin inflamasyonu, endotelyal disfonksiyonu teşvik ettiği ve sepsisli hastalarda artan hastane mortalitesi ile ilişkili olduğu bilinmektedir [32]. Endokan, endotelyal hücre disfonksiyonunun başka bir belirtecidir ve hastalığın şiddeti ve septik hastaların sonucu ile ilişkilidir [33]. Ayrıca endotel aktivasyonu ve disfonksiyonunun bu belirteçlerinin CLP modelinde yükseldiğini ve Clopidogrel tedavi grubunda azaldığını bulduk. Benzer şekilde, klopidogrel ile tedavi edilen grupta GFR'de hafif fakat önemsiz bir artış gözlemledik. Bu, trombosit aktivasyonunun sepsise karşı inflamatuar yanıt üzerinde modülatör bir etkiye sahip olduğunu düşündürmektedir.

Bu çalışmada, trombosit aktivasyonunun inhibisyonu, organ fonksiyonunda önemli gelişmelere dönüşmedi. 10 mg/kg/gün'lük seçilen dozun trombosit aktivasyonunu, NLRP3 aktivasyonunu, sitokinleri ve endotel aktivasyon belirteçlerini azaltmak için yeterli olması, ancak akciğer hasarının azalmasına veya böbrek fonksiyonunda iyileşmeye dönüşmemesi mümkündür. Liverani, et al. daha önce vahşi tipte ve P2Y12 nakavt farelerde 30/mg/kg/gün'lük bir başlangıç ​​dozu kullanmış, bu da sepsis kaynaklı akciğer hasarının inhibisyonuna dönüşmüştür [31]. Aynı çalışmada, Klopidogrel sepsis indüksiyonundan önce uygulandı. Bu büyük fark, çalışmamızda gözlemlenen akciğer veya böbrek fonksiyonunda anlamlı iyileşme olmamasını açıklayabilir.

Mevcut çalışma, sepsise yanıt olarak inflamasyona ve endotelyal aktivasyona katkıda bulunmada trombosit aktivasyonunun bir rolü olduğunu öne sürse de, not edilmesi gereken sınırlamalar vardır. İlk olarak, endotel aktivasyonunun belirteçleri ölçülürken, endotel fonksiyonunu değerlendirmek için ek deneyler garanti edilir. Ayrıca, bu çalışmada diğer trombosit kaynaklı faktörlerin katkısı kontrol edilmemiştir. Bu nedenle, trombositlerin sepsis kaynaklı patolojiye ve organ yetmezliğine nasıl katkıda bulunduğuna dair hala cevaplanmamış sorular vardır.

Klopidogrel'in sepsiste mortaliteyi azaltmadaki rolü, ARDS ve mekanik ventilasyon insidansını azalttığı, ancak mortalitede azalma olmadığı raporlarıyla tartışmalıdır [34]. Trombositlerin sepsiste organ hasarına ve işlev bozukluğuna nasıl katkıda bulunduğunu tam olarak belirlemek için daha ileri çalışmaların yapılması gerekmektedir. Bu çalışma, septik hastalarda terapötik bir hedef olarak trombositlerin daha fazla araştırılmasını desteklemektedir.

cistanche tubolosa sağlığa faydaları: böbrek fonksiyonunu iyileştirir

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1. Hayvanlar

Envigo'dan (Indianapolis, IN, ABD) satın alınan dişi ve erkek Sprague Dawley sıçanları kullanıldı. Bu çalışmada yürütülen tüm deneysel prosedürler, hayvanların kullanımı ve bakımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygundur. Tüm protokoller, Mississippi Tıp Merkezi Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Hayvanların bakımı ve işlenmesi, etik hayvan tedavisi için Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygundu.

4.2. Çekal Ligasyon ve Ponksiyon

Tüm in vivo deneylerimiz, yaklaşık 225-325 g ağırlığındaki 12- ila 13-haftalık erkek ve dişi sıçanlarda gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar rastgele iki gruba ayrıldı: sham operasyon grubu (SHAM, n=10) ve çekal ligasyon ponksiyon grubu (CLP, n=10). İzofluran anestezisi altında, daha önce tarif ettiğimiz gibi abdominal polimikrobiyal sepsisi indüklemek için bir sıçan alt kümesinde CLP ameliyatı yapıldı [26,27]. Resüsitasyon için operasyondan hemen sonra önceden ısıtılmış salin (20 mL/kg, 37 ◦C) deri altına enjekte edildi. Sahte ameliyatlı hayvanlara, çekum ligasyonu veya delinme olmaksızın aynı cerrahi prosedür uygulandı. Ameliyattan sonra sıçanlar tekrar kafeslerine yerleştirildi ve ad libitum yem ve su verildi. CLP'den 24 saat sonra, önceki insizyon yeniden açıldı ve nekrotik çekum dikkatlice çıkarıldı. Karın boşluğu 10 mL ılık steril tuzlu su solüsyonu ile yıkandı. Karın kesi tekrar katmanlar halinde kapatıldı. Hayvanlara günlük olarak geniş spektrumlu bir antibiyotik (Naxcel 5 mg/kg) uygulandı ve 72 saatlik deney süresi boyunca buprenorfin SR (1.2 mg/kg) ile analjezi sağlandı. Trombosit agregasyonu, CLP sıçanlarının bir alt kümesinde (CLP artı CLOP; n=12) 3 gün boyunca özofagus gavaj yoluyla 3 gün boyunca Clopidogrel (10 mg/kg/gün) günlük uygulamasıyla bloke edildi. Protokol sonunda hayvanlar derin anestezi altında sakrifiye edildi. Daha fazla analiz için kan ve dokular toplandı.

4.3. Trombosit İzolasyonu

Arter kanı asit-sitrat-dekstroz vakumlu tüplere çekildi ve trombositten zengin plazma elde etmek için 200xg'de 20 dakika santrifüjlendi. Trombosit açısından zengin plazma (PRP), 1 uM PGE1 içeren eşit hacimde HEP tamponu (140 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 3.8 mmol/L HEPES, 5 mmol/L EGTA, pH 7.4) ile karıştırıldı. Bu karışım daha sonra trombositleri saymak için 40 uL süpernatantın kullanıldığı kalan RBC ve WBC'yi peletlemek için 100 x g'de 20 dakika santrifüjlendi. PRP daha sonra 800 x g'de 20 dakika santrifüjlendi, süpernatan atıldı ve pelet Tyrode tamponunda yeniden süspanse edildi (134 mmol/L NaCl, 12 mmol/L NaHC03, 2.9 mmol/L KCl, 0.34 mmol/L Na2HP04,1 5 mmol/L glikoz ve 3 mg/mL BSA içeren mmol/L MgCl2, 10 mmol/L HEPES).

4.4. Akış Sitometrisi

Taze izole edilmiş trombositler (106) 50 uL Tyrode tamponu içinde yeniden süspanse edildi. Trombositler, floresan izotiyosiyanat (FITC) konjuge anti-fare CD41 (Clone MWReg30, BioLegend, San Diego, CA, ABD) ve Allophycocyanin (APC) konjuge anti-fare/sıçan CD62P (Klon RMP{) ile inkübe edildi (30 dakika süreyle oda sıcaklığında). {9}}, Biyolojik Efsane). Kapı başına minimum 10000 olay, bir MACsQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, ABD) kullanılarak elde edildi ve FlowLogic yazılımı (Innovation, Sydney, Avustralya) kullanılarak analiz edildi. Trombositler, anti-CD41'in spesifik bağlanması ve karakteristik ileri ve yana saçılma ile ayırt edildi. CD41 ve CD62P için pozitif boyanan trombositler, aktive trombositler olarak adlandırıldı.

4.5. Konfokal ve Işık Mikroskobu

Sham veya CLP sıçanlarından veya LPS ile veya LPS olmadan uyarılan trombositlerin (107) permanox slaytlara (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) yapışmasına izin verildi. Yapıştırılan hücreler 30 dakika boyunca yüzde 10 formalin içinde sabitlendi, 3 kez PBS ile 10 dakika oda sıcaklığında yıkandı ve 10 dakika boyunca buz gibi soğuk yüzde 100 metanol ile geçirgenleştirildi. Slaytlar, 1 saat boyunca yüzde 10 keçi ve tavşan serumu ile PBS içinde bloke edildi, yıkandı ve tavşan anti-NLRP3antikoru (NBP2-12446, Novus Biologicals, Littleton, CO, ABD) ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. Slaytlar daha sonra yıkandı ve anti-tavşan Alexa Fluor 488 (A11070, Thermo FisherScientifific) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. Slaytlar tekrar yıkandı ve Alexa Fluor647-konjuge tavşan anti-ASC antikoru (NBP1-78977AF647, Novus Biologicals) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. Kontroller, birincil antikorların çıkarılması dışında aynı şekilde işlendi. Preparatlar Cytoseal 60'a (Thermo Fisher Scientific) yerleştirildi ve bir Nikon C1 (Nikon Inc., Melville, NY, ABD) konfokal tarama mikroskobu üzerinde analiz edildi. Görüntüler, bir Nikon-Fi1 renkli kamera (Nikon) ile donatılmış bir Nikon Eclipse 55i mikroskobu kullanılarak çekildi ve NIS-Elements D 3.0 yazılımı kullanılarak analiz edildi.

4.6. Endotel Aktivasyonu ve Sitokinlerin Biyobelirteçlerinin Kantifikasyonu

Plazma Angiopoietin-2 (MANG20, R&D Systems, Minneapolis, MN, ABD) ve Endocan-1 (MBS039900, MyBioSource, San Diego, CA, ABD) ELISA'ya göre endotelyal disfonksiyon belirteçleri olarak ölçüldü. üreticinin protokolüne göre. Plazma,böbrekve akciğer IL-1 (RLB00, R&D Systems) ve IL-18 (ab213909, Abcam, Boston, MA, ABD) üreticinin protokolüne göre ELISA ile ölçüldü.böbreklerve akciğer lizatları, üreticinin protokolüne göre BioPlex Cell Lysis Kit (171304011, BioRad, Hercules, CA, ABD) ile hazırlandı.

4.7. Akciğer Hasarının Değerlendirilmesi

Histological evaluation was performed on the lungs via hematoxylin and eosin (H&E)staining. A lung lobe was formalin-fixed. The tissue was subsequently paraffin-embedded and 5-µm sections were stained with (H&E). Sections were evaluated for neutrophil infiltration into the alveolar space. Five sections were scored in a blinded fashion on a scale of0–2 with 0 representing o neutrophils in the alveolar space, 1 representing 1–5 neutrophils in the alveolar space, and 2 representing >Alveolar boşlukta 5 nötrofil. Görüntüler, Nikon DS-Fi1 renkli kamera (Nikon Inc.) ile donatılmış bir Nikon Eclipse 55i mikroskobu kullanılarak 40X'te NIS-Elements D 30 yazılımı kullanılarak çekildi. Alveolar duvar kalınlığı, NIS-Elements D 3.0 yazılımı kullanılarak ölçüldü. Veriler sahte değerlere normalleştirildi.

4.8. Renal Glomerüler Hasarın Değerlendirilmesi

böbreklerwere collected, weighed, and fixed in a 10% buffered formalin solution. Paraffin sections (3 µm) were prepared and stained with Periodic acid-Schiff to assess the degree of glomerular injury on approximately 30 images per section, per rat. Thirtyglomeruli per section were scored in a blinded fashion on a 0–4 scale with 0 representing a normal glomerulus, 1 representing a 25% loss, 2 representing a 50% loss, 3 representing a 75% loss, and 4 representing >Tutamda yüzde 75 kılcal damar kaybı. Görüntüler, daha önce bahsedildiği gibi aynı mikroskop, kamera ve yazılım kullanılarak çekildi.

4.9. Böbrek Fonksiyonunun Ölçülmesi

CLP prosedürü sırasında, juguler vene bir kateter yerleştirildi ve boyun arkasından deri altından dışarı çıkarıldı. Kateter, üç günlük protokolün sonuna kadar her gün heparinize salin ile yıkandı. Protokolün son gününde, sıçanlara 480 nm'de FITC sinistrini uyaran iki ışık yayan diyottan oluşan NIC-Kidney cihazını (MediBeacon; Mannheim, Almanya) monte etmek için kısa izofluran anestezisi uygulandı. 531 nm, bir mikroişlemci ve bir pil. Bu cihaz, çift taraflı yapışkan bir yama (MediBeacon) kullanılarak sıçanın arkasına yapıştırıldı ve sıçanın arkasındaki traşlı bir bölgeye bir kemirgen ceketi ile sabitlendi. Sıçanların 15 dakika boyunca ayrı kafeslerde toparlanmasına izin verildi ve bir temel ölçüm kaydedildi. Başlangıç ​​ölçümlerinden sonra, juguler ven yoluyla bolus FITC-sinistrin (5 mg/100 g vücut ağırlığı; FTC-FS001, MediBeacon) uygulandı ve ardından bolus steril salin enjeksiyonu yapıldı. Bolus enjeksiyondan sonraki iki saatlik bir süre boyunca, FITC-sinistrin'in atılım kinetiği transkutan olarak ölçüldü ve MDPLab değerlendirme yazılımı ile tek bölmeli bir model kullanılarak FITC-sinistrinin eliminasyon yarı ömrünü (t1/2) hesaplamak için kullanıldı. (MediBeacon) ile doğrulanmış ampirik olarak türetilmiş bir dönüşüm faktöründen GFR'yi hesaplamak için [35,36].

cistanche incelemesi: böbrek fonksiyonunu iyileştirir

4.10. İstatistiksel analiz

Güç analizi, 10–12 hayvan/gruptan oluşan bir n'nin 0.80 güç(1-) ve Tip 1 hata olasılığına (1-) ulaşacağını belirler ( ) Sham ve CLP sıçanları arasında trombosit aktivasyonunda en az yüzde 5-10'luk bir farkı saptamak için 0.05'tir. Tüm veriler ortalama± SD olarak ifade edilir. Tüm verilerin Gauss dağılımına uygunluğu D'Agostino-Pearson normallik testi ile kontrol edildi. İstatistiksel analizler, post hoc analiz olarak Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA ile yapıldı. p < 0.05="" değeri="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" kabul="">

Yazar Katkıları:

Kavramsallaştırma, CAS, JMW ve DCC; metodoloji, JMW ve D.CC; doğrulama, OKT, JMW ve DCC; biçimsel analiz, MB-R., CAS, OKT, JMW veD.CC; soruşturma, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW ve DCC; kaynaklar, JMW ve DCC; veri iyileştirme, MB-R., CAS ve DCC; yazma—orijinal taslak hazırlama, MB-R. ve CAS; yazma—inceleme ve düzenleme, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW ve DCC; görselleştirme, MB-R., CAS, JMW ve DCC; denetim, OKT ve DCC; proje yönetimi, DCC; fon alımı, DCC Tüm yazarlar, makalenin yayınlanan versiyonunu okudu ve kabul etti.

Finansman:

Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitülerinin Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından P20GM104357 ve P30GM103328 Ödül Numarası altında desteklenmiştir. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından F31HL149257 (OKT), R00HL130456 (DCC) ve R01HL151407 (DCC) Ödül Numaraları ile ve Ulusal Diyabet ve Sindirim Enstitüsü tarafından finanse edilmiştir. veBöbrekHastalıklarR01DK109133 (JMW) Ödül Numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (Ulusal Sağlık Enstitüleri) içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Kurumsal İnceleme Kurulu Açıklaması:

Bu çalışmada yürütülen tüm deneysel prosedürler, hayvanların kullanımı ve bakımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Tüm protokoller, Mississippi Üniversitesi Tıp Merkezindeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol 1487A, Onaylı 07/02/2019). Hayvanların bakımı ve işlenmesi, etik hayvan tedavisi için Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygundu.

Veri Kullanılabilirlik Bildirimi:

Bildirilen sonuçları destekleyen tüm veriler el yazmasında sunulmuştur ve serbestçe kullanılabilir.

Çıkar çatışmaları:

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması ifade etmemektedir.

Referanslar

1. Greco, E.; Lupia, E.; Bosco, Ö.; Vizio, B.; Montrucchio, G. Trombositler ve Sepsis'te Çoklu Organ Yetmezliği. Int. J. Mol. bilim 2017, 18, 2200.
2. Rhee, C.; Dantes, R.; Epstein, L.; Murphy, DJ; Seymour, CW; Iwashyna, TJ; Kadri, SS; Angus, DC; Danner, RL; Fiore, AE; et al. Klinik ve Hasar Verilerini Kullanan ABD Hastanelerinde Sepsis İnsidansı ve Eğilimleri, 2009–2014. JAMA 2017, 318, 1241–1249.
3. Kim, WY; Hong, SB Sepsis ve Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu: Son Güncelleme. Tüberk. Nefes al. Dis. (Seul) 2016, 79, 53–57.
4. Alobaidi, R.; Basu, RK; Goldstein, SL; Bagshaw, SM Sepsis ile ilişkili akut böbrek hasarı. Semin. Nefrol. 2015, 35, 2–11.
5. Umbro, İ.; Gentile, G.; Tinti, F.; Muresan, P.; Mitterhofer, AP Sepsis kaynaklı akut böbrek hasarının patofizyolojisinde ve biyobelirteçlerinde son gelişmeler. J. Enfeksiyon. 2016, 72, 131-142.
6. Bilevicius, E.; Dragosavac, D.; Dragosavac, S.; Araujo, S.; Falcao, AL; Terzi, RG Septik hastalarda çoklu organ yetmezliği. Braz. J. Enfeksiyon. Dis. 2001, 5, 103–110.
7. Liu, V.; Escobar, GJ; Greene, JD; Soule, J.; Whippy, A.; Angus, DC; Iwashyna, 2 bağımsız kohorttan sepsisli hastalarda TJ Hastanesi ölümleri. JAMA 2014, 312, 90–92.
8. Katz, JN; Kolappa, KP; Becker, RC Trombozun ötesinde: Kritik hastalıkta çok yönlü trombosit. Sandık 2011, 139, 658–668.
9. Smyth, SS; McEver, RP; Weyrich, AS; Morrel, CN; Hoffman, MR; Arepally, GM; Fransızca, PA; Dauerman, HL; Becker, RC; Trombosit Kolokyumu, P. Trombosit hemostazın ötesinde işlev görür. J. Tromb. Hemost. 2009, 7, 1759-1766.
10. de Stoppelaar, SF; van 't Veer, C.; van der Poll, T. Trombositlerin sepsisteki rolü. Trombüs. Hemost. 2014, 112, 666-677.
11. Navaz, M.; Dickfeld, T.; Bogner, C.; Fateh-Moghadam, S.; Neumann, FJ Platelet septik çoklu organ disfonksiyon sendromlarında işlev görür. Yoğun Bakım Med. 1997, 23, 379-385.
12. Layios, N.; Delierneux, C.; Hego, A.; Huart, J.; Gosset, C.; Lecut, C.; Maes, N.; Geurts, P.; Joli, A.; Lancellotti, P.; et al. Yoğun bakım ünitesine kabulde trombosit aktivasyon belirteçleri ile kritik hastalarda sepsis tahmini: Prospektif bir pilot çalışma. Yoğun Bakım Med. Tecrübe. 2017, 5, 32.
13. Russwurm, S.; Vickers, J.; Meier-Hellmann, A.; Spangenberg, P.; Bredle, D.; Reinhart, K.; Losche, W. Platelet ve lökosit aktivasyonu, septik organ disfonksiyonunun ciddiyeti ile ilişkilidir. Şok 2002, 17, 263–268.
14. Vanderschueren, S.; De Weerdt, A.; Malbrain, M.; Vankersschaever, D.; Frans, E.; Wilmer, A.; Bobbaers, H. Trombositopeni ve yoğun bakımda prognoz. Kritik. Bakım Med. 2000, 28, 1871-1876.
15. Theofanis, E.; Semitekolou, M.; Morianos, İ.; Sanitas, K.; Xanthou, G. Şiddetli Astımda NLRP3 Enflamasom Aktivasyonunu Hedefleme. J. Clin. Med. 2019, 8, 1615.
16. Haque, BEN; Akter, M.; Jakarya, M.; Kim, İŞ; Azam, S.; Choi, DK Mikroglial NLRP3 inflamatuarını ve Parkinson hastalığındaki rolünü hedefleme. hareket. Bozukluk. 2020, 35, 20–33.
17. Liu, L.; Dong, Y.; Ye, M.; Jin, S.; Yang, J.; Joosse, BEN; Güneş, Y.; Zhang, J.; Lazarev, M.; Brant, SR; et al. Hem Farelerin hem de İnsanların İltihaplı Bağırsak Hastalıklarında NLRP3 Enflamasom Aktivasyonunun Patojenik Rolü. J. Crohn's Colitis 2017, 11, 737-750.
18. Danielski, LG; Giustina, AD; Bonfante, S.; Barichello, T.; Petronilho, F. NLRP3 İnflamasomu ve Sepsis Gelişimindeki Rolü. İltihap 2020, 43, 24-31.
19. Luo, YP; Jiang, L.; Kang, K.; Fei, DS; Meng, XL; Nan, CC; tava, SH; Zhao, MR; Zhao, MY Hemin, sepsis kaynaklı akut akciğer hasarında heme oksijenaz-1 içeren NLRP3 inflamatuar aktivasyonunu inhibe eder. Int. İmmünofarmakol. 2014, 20, 24-32.

20. Ay, JS; Lee, S.; Park, MA; Siempos, II; Haslip, M.; Lee, PJ; Yun, M.; Kim, CK; Howrylak, J.; Ryter, GB; et al. UCP2-indüklenen yağ asidi sentazı, sepsis sırasında NLRP3 inflamatuar aktivasyonunu destekler. J. Clin. Araştırın. 2015, 125, 665-680.

[PubMed]21. Gong, Z.; Zhou, J.; Li, H.; Gao, Y.; Xu, C.; Zhao, S.; Chen, Y.; Cai, W.; Wu, J. Curcumin, NLRP3 inflamatuar aktivasyonunu bastırır ve LPS kaynaklı septik şoka karşı korur. Mol. Nutr. Gıda Araş. 2015, 59, 2132–2142.
22. Wang, P.; Huang, J.; Li, Y.; Chang, R.; Wu, H.; Lin, J.; Huang, Z. Eksojen Karbon Monoksit, Sepsisin Neden Olduğu Akut Böbrek Hasarını Azaltır ve Sıçanlarda NLRP3 Enflamasom Aktivasyonunu Engeller. Int. J. Mol. bilim 2015, 16, 20595-20608.
23. Kalbitz, M.; Fattahi, F.; Römork, JJ; Jajou, L.; Malan, EA; Taş, FS; Huber-Lang, M.; Russell, MW; Ward, PA Kompleman, sepsiste kardiyak NLRP3 enflamasyonunun aktivasyonunu tetikledi. FASEB J. 2016, 30, 3997–4006.
24. Bernard, GR; Vincent, JL; Daha sonra, PF; LaRosa, SP; Dhainaut, JF; Lopez-Rodriguez, A.; Steingrub, JS; Garber, GE; Helterbrand, JD; Ely, EW; et al. ve Rekombinant insan proteini CWEiSSsg. Şiddetli sepsis için rekombinant insan aktive protein C'nin etkinliği ve güvenliği. N. İngilizce J. Med. 2001, 344, 699-709.
25. İba, T.; Thachil, J. Sepsis ile ilişkili yayılmış intravasküler pıhtılaşma için antitrombin ve trombomodulin kullanan antikoagülan tedavinin bugünü ve geleceği: Japonya'dan bir bakış açısı. Int. J. Hematol. 2016, 103, 253–261.
26. Cornelius, DC; Bayk, CH; Travis, tamam; Beyaz, DL; Genç, CM; Austin Pierce, W.; Kalkanlar, CA; Poudel, B.; Williams, JM NLRP3 sepsise yanıt olarak trombositlerde inflamatuar aktivasyon. Fizol. 2019, 7, e14073.
27. Cornelius, DC; Travis, tamam; Tramel, RW; Borges-Rodriguez, M.; Bayk, CH; Greer, M.; Giachelli, CA; Tardo, GA; Williams, JM NLRP3 inflamatuar inhibisyonu, sepsis kaynaklı trombosit aktivasyonunu hafifletir ve çekal ligasyon ponksiyonunda çoklu organ hasarını önler. PLoS BİR 2020, 15, e0234039.
28. Asadüzzaman, M.; Lavaşan, S.; Rahman, M.; Zhang, S.; Braun, OO; Jeppsson, B.; Thorlacius, H. Trombositler abdominal sepsiste nötrofillerin pulmoner alımını destekler. Kritik. Bakım Med. 2009, 37, 1389-1396.
29. Schrier, RW; Wang, W. Akut böbrek yetmezliği ve sepsis. N. İngilizce J. Med. 2004, 351, 159–169.
30. Vincent, JL; Yağışi, A.; Pradier, O. Sepsiste trombosit fonksiyonu. Kritik. Bakım Med. 2002, 30, S313–S317.
31. Liverani, E.; Riko, MC; Tsygankov, AY; Kilpatrick, LE; Kunapuli, SP P2Y12 Reseptörü Sepsisin İndüklediği Enflamasyonu Modüle Eder. Arter. Trombüs. Vask. Biol. 2016, 36, 961–971. [Çapraz Referans]
32. Siner, JM; Bhandari, V.; Engle, KM; Elias, JA; Siegel, MD Yükselmiş serum anjiyopoietin 2 seviyeleri,
sepsiste ölüm. Şok 2009, 31, 348-353.
33. Scherpereel, A.; Depontieu, F.; Grigoriu, B.; Cavestri, B.; Tsicopoulos, A.; Gentile, T.; Jourdain, M.; Pugin, J.; Tonel, AB; Lassalle, P. Endocan, insan sepsisinde yeni bir endotel belirteci. Kritik Bakım Med. 2006, 34, 532-537.
34. Valerio-Rojas, JC; Jaffer, IJ; Kor, DJ; Gajic, Ö.; Cartin-Ceba, R. Kronik antiplatelet tedavi alan şiddetli sepsis ve septik şok hastalarının sonuçları: Tarihsel bir kohort çalışması. Kritik. Bakım Araş. Pratik yapın. 2013, 2013, 782573.
35. Hap, J.; Issaeva, O.; Meraklı, S.; Sadık, M.; Kranzlin, B.; Fiedler, F.; Klotzer, HM; Kramer, U.; Gretz, N. GFR ölçümleri için yeni bir belirteç olan floresan etiketli sinistrinin farmakolojik profili ve toksisitesi. Naunyn-Schmiedeberg Kemeri. Farmakol. 2006, 373, 204–211.
36. Hap, J.; Kraenzlin, B.; Jander, J.; Sattelkau, T.; Sadık, M.; Kloetzer, HM; Deus, C.; Kraemer, U.; Gretz, N. Glomerüler filtrasyon hızının belirteci olarak floresein etiketli sinistrin. Avro. J. Med. Kimya 2005, 40, 1056-1061.