Poli- ve Oligosakkarit Ulva Sp. Enzim Destekli Ekstraksiyondan Gelen Fraksiyonlar, Hücre Dışı Matrisin Metabolizmasını Modüle Ediyor

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Soyut:Ulva sp. kamyonetler gibi biyoaktif bileşiklerin bir kaynağı olduğu bilinmektedir, ancak bunların insan dermal fibroblast hücre dışı matrisi (ECM) üzerindeki biyolojik aktiviteleri zayıf bir şekilde rapor edilmiştir. Bu çalışmada, Ulva sp.'den poli- ve oligosakkarit fraksiyonları ile 48 saatlik inkübasyondan sonra, normal insan derisi dermal fibroblastlarında ECM'nin hem proteomik hem de transkriptomik seviyelerde düzenlenmesi ilk kez araştırılmıştır. enzim destekli ekstraksiyon ve depolimerizasyondan sonra elde edilir. Fibroblastlar üzerinde herhangi bir sitotoksik etki göstermeden hücre proliferasyon artışı (artı yüzde 68'e kadar), her iki fraksiyon tarafından 50 ve 1000 ug/mL'de gösterildi. Proteomik düzeyde, 1000 ug/mL'deki polisakarit fraksiyonları, glikozaminoglikanların (GAG'ler, artı yüzde 57'ye kadar), toplam kolajen, özellikle tip I (artı yüzde 217'ye kadar) ve Ⅲ sentezinin yanı sıra sentezi en fazla arttırdı. ve MMP-1 aktivitesi (Matrix Metalloproteinase-1, artı yüzde 309'a kadar). Buna karşılık, oligosakkarit fraksiyonlarının GAG sentezi üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak kolajenler ve MMP-1 düzenlemesi için benzerlikler sergiledi.püriten c vitaminiTranskriptomik seviyede, COL1A1 ve COL1A2 ifadesinin azalması ve COL3A1 ve MMP-1 ifadesinin artması, her iki fraksiyon tarafından da ECM metabolizmasının modülasyonunu doğruladı. Araştırmamız, poli ve oligosakkarit Ulva sp. Fraksiyonlar ilginç biyolojik aktiviteler sergiler ve yaşlanma karşıtı dermokozmetik uygulamalar için cilt yenileme alanında potansiyel kullanımlarını destekler.

daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

Anahtar Kelimeler:kolajen; hücre dışı matris; insan dermal fibroblastı; matris metalloproteinaz; Deniz yosunu; Ulva sp.

1. Giriş

Uloa sp.'nin neden olduğu büyük ölçekli yeşil gelgitler. deniz ötrofikasyonu nedeniyle Brittany'de (Fransa) tekrarlandı. Yeşil deniz yosunu kümelerinin ekosistem yapısının değişmesi, yerli biyolojik çeşitliliğin azalması ve ekonomik kayıplar dahil olmak üzere derin olumsuz ekolojik etkileri vardır [1,2]. Toprak ıslahı, hayvan yemi olarak kullanım veya karaya oturma olaylarından kaynaklanan çürüme veya yanma ile basit bozunma dışında, Uloa sp'nin değerlendirilmesi hakkında çok az şey bilinmektedir. insan sağlığında [1]. Ancak Ulloa sp. ulvans gibi bileşiklerin önemli bir kaynağıdır. Esas olarak ramnoz, üronik asitler ve ksilozdan oluşan suda çözünür sülfatlanmış hücre duvarı polisakkaritleri olan Evans, Ulloa kuru ağırlığının yüzde 36'sını temsil edebilir [3]. Ulvanın tekrarlanan iki ana disakkarit birimi, aldobiüronik asitler (ulvanobiüronik asitler), tip A: -L-ramnoz 3-sülfat'a bağlı -D-glukuronik asit (1,4) ve tip B: -L-'dir. -L-ramnoz 3-sülfat'a bağlı iduronik asit (1,4). Ulvanobiosis (tip U) olarak adlandırılan minör disakkarit aldozları da ulvan'da bulunabilir[3.4]. Ulvan ekstraksiyonu, biyokütleye uygulanan ekstraksiyon ve fraksiyonlama yöntemlerine göre kantitatif verim ve kalite açısından önemli ölçüde değişebilir. Ulvanlar, genellikle maserasyon işlemi olarak adlandırılan yüksek sıcaklıklarda (80-90 derece) sulu çözelti içinde ekstrakte edilir. Bununla birlikte, Evans, Enzim Destekli Ekstraksiyon (EAE)[5] adlı yeni bir yeşil teknoloji ile geri kazanılabilir. yüksek katalitik verim, yüksek özgüllük, hafif reaksiyon koşulları ve bileşiklerin biyolojik aktivitelerinin korunması. EAE ayrıca, klasik bir maserasyon işlemine kıyasla [6-9] verimi artırır ve maliyeti ve enerji tüketimini azaltır. Maserasyondan veya EAE gibi yeni bir işlemden sulu ekstraksiyondan sonra, ulvan zenginleştirme genellikle etanolik bir çökeltme prosedürü ile gerçekleştirilir [3]. Ulvanlar, immünomodülasyon, antioksidan, antikanser, antikoagülan, antihiperlipidemik veya antiviral gibi çeşitli biyolojik aktiviteleri in vitro ve in vivo göstermiştir [3,5,10-14].sistancheEvans'ın yapısal özelliği (sülfasyon derecesi, sülfatlama modeli, monosakkarit bileşimi, glikozidik bağlantılar, dallanma derecesi ve moleküler ağırlık) biyolojik aktivitesini etkiler [3]

Cilt yaşlanması, birbirini tamamlayan iki süreci olan karmaşık bir süreçtir: içsel (genetik, hücresel metabolizma vb.) ve dışsal (UV maruziyeti, kirlilik, tütün içimi vb.)[15-17]

Cistanche yaşlanmayı geciktirebilir

Deniz yosunu biyoaktiflerinin dermo-kozmetik endüstrisi için yüksek katma değerli ürün kaynakları olarak kullanımı yeni ortaya çıktı. Bu biyoaktif bileşikler arasında ulvanlar yüksek potansiyele sahiptir. Gerçekten de, son yıllarda doğal ürünlere yönelik tüketici talepleri artıyor, bu da deniz ürünlerini ve özellikle deniz yosununu cilt güzelliğini ve sağlığını hedefleyen ilginç bir doğal içerik kaynağı haline getiriyor [18-22]. Kozmetik ürünlerin hedefi olan cilt, birbiriyle örtüşen üç ana katmandan oluşur: epidermis, dermis ve hipodermis.cistanche nedirDermis, epidermisi destekler ve fibroblastlar olarak bilinen önemli cilt hücrelerini barındırır. Epidermisin hemen altında bulunan papiller dermisin ana hücreleri olan fibroblastlar, esas olarak hücre dışı matrisi (ECM) sentezler ve organize eder. ECM, kollajenler (kuru ağırlığın yüzde 70'i), başlıca tip I ve III, elastin (yüzde 2-4), glikoproteinler (fibronektin, laminin, vb.), ya sülfatlanmış (heparan) glikozaminoglikanlar (GAG'ler) dahil olmak üzere çeşitli makromoleküllerden oluşur. sülfat, dermatan sülfat, keratan sülfat, kondroitin sülfat) ve sülfatsız (hyaluronik asit), proteoglikanlar ve MMP'ler (Matriks Metalloproteinazlar) gibi parçalayıcı bileşenler [23,24]. Tip I kolajen, toplam kolajenin [25] yüzde 80'ini temsil eder ve cilt dermisi ECM'nin ana bileşenlerinden biridir; cilt elastikiyeti, esnekliği ve gerginliği ile ilgilidir. Tip I kollajen, sırasıyla COL1Al ve COL1A2 genleri tarafından kodlanan iki cl zinciri ve bir c2 zincirinden oluşan bir heterotrimer, üçlü sarmal proteindir [26]. Tip I ve II fibriler kollajenler, toplam kollajenin yüzde 90'ından fazlasını temsil eder ve ciltle yakından ilişkilidir [27,28]. Tip II kollajen, genç ciltte yaşlı ciltten daha yaygındır ve özellikle yara iyileşmesinde rol oynar [29,30]. ECM montajı için moleküler bir ağ oluşturmak için, GAG'lar proteinlerle ilişkilidir ve tip I kollajen ile etkileşime giren proteoglikanlar (örn., decorin veya versican) oluşturur [31]ECM içinde, ECM katabolik yolunun enzimleri olan MMP'ler, latent veya aktif formda, aktivitelerini düzenleyen TIMP'ler olarak bilinen metalloproteinazların doku inhibitörlerine bağlıdırlar [32]. MMP-1(kollajenaz-1), tip I kollajen yıkımından sorumlu ana enzimdir ve TIMP-1 onun ilgili inhibitörüdür [334]. Fibroblastlar, ECM homeostazının kilit düzenleyicileridir. Tip I ve II kollajenler, GAG'ler veya TIMP'ler gibi anabolizmada ve MMP'ler gibi katabolizmada yer alan cilt ECM bileşenleri arasındaki sentez dengesi ve eşleşmesi, bu ECM'nin yenilenmesine ve sürekli yeniden şekillenmesine izin verir[25]. , ana sonuç, fibroblast proliferasyonunun azalması, tip I kollajen sentezi, GAG salgılanması ve TIMP-1 sentezinde önemli bir azalma ile ECM bileşen seviyelerinin modülasyonu ile ECM düzenlemesinin dengesizliği ve MMP-1 seviyesi [24,35].

Şimdilik sadece birkaç çalışma Ulva sp'nin etkisini araştırdı. Hem proteomik hem de transkriptomik seviyelerde fibroblast cilt hücrelerinin metabolizması üzerindeki fraksiyonlar[36-39]ve bugüne kadar, EAE işleminden türetilen Ulua poli- ve oligosakkarit fraksiyonları üzerinde proteomik ve transkriptomik seviyede tam bir çalışma yapılmamıştır.Yaşlanma karşıtı cistancheBu bakış açısıyla, bu çalışma, in vitro olarak Ulva sp. insan dermal fibroblast metabolizması üzerine yeni yeşil teknoloji EAE'den türetilmiştir. Bunların fibroblast proliferasyonu ve canlılığı üzerindeki etkileri ve hem ECM anabolizması hem de katabolizması üzerindeki proteomik ve transkriptomik seviyelerdeki etkileri, cilt bakımındaki (örn. yaşlanma karşıtı) potansiyellerini vurgulamak için incelenmiştir.

2. Sonuçlar

2.1.Ulva sp.'nin Poli- ve Oligosakkarit Fraksiyonları.

EAE'den Farklı Biyokimyasal Bileşim ve Moleküler Ağırlık Dağılımı Sergileniyor

Poli- ve oligosakkarit fraksiyonlarının üretim mekanizmaları, Malzeme ve Yöntemler bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır: "4.2 Poli- ve Oligosakkarit Fraksiyonları Üretimi ve Karakterizasyonu". Önceki detaylı biyokimyasal karakterizasyon analizleri (karbonhidratlar, üronik asitler, sülfat grupları ve proteinler) ve moleküler Ulloa sp.'den poli- ve oligosakarit fraksiyonlarının ağırlık dağılımı. EAE'den türetilenler gerçekleştirilmiştir [36]. Veriler Tablo 1'de birleştirilmiştir.

Kısaca, ham ulvanların (UE) ve diyalize ulvanların (DS-UE) polisakkarit fraksiyonları, yüksek moleküler ağırlıklı ulvanlardan (ham minibüsler) 23.5-37%0,4 karbonhidrat,18.5-37 oluşur. Yüzde 0 üronik asit,29.9-49%0,1 sülfat grupları ve 10.5-12%0,8 protein. Karbonhidrat bileşimi esas olarak ramnoz (yüzde 50) ve glukuronik asit (yüzde 11) idi. DS-UE fraksiyonu, ulvanlarda UE fraksiyonundan önemli ölçüde daha zengindir. Oligosakarit fraksiyonları, HzO2'den depolimerize kamyonetler (DEP-HD PP-UE) ve Amberlite reçinesinden depolimerize kamyonetler (DEP-AD PP-UE), yüzde 24'lük düşük moleküler ağırlıklı kamyonetlerden oluşur.4-30%0,4 karbonhidrat ( ramnoz yüzde 44.9-554,4 ve glukuronik asit yüzde 7.5-110,0 ), 21.6-30 yüzde 0,8 üronik asit ve yüzde 12.8-160,8 proteinler.

Ancak depolimerizasyon işlemi, kısmi sülfat kaybına yol açtı (DEP-ADPP'de saptanmadı ve DEP-HD PP-UE'de yalnızca yüzde 6.6). Oligosakarit fraksiyonlarının moleküler ağırlık (Mw) dağılımı, DEP-HD PP-UE için ortalama düşük Mw 8kDa ve 1.5 kDa ile DEP-AD PP-U için daha düşük bir Mw gösterdi.

2.2.Ulva sp.'nin Poli- ve Oligosakkarit Fraksiyonları. Metabolik Aktiviteyi Uyarır Ama Fibroblastların Canlılığını Etkilemez

48 saat boyunca poli ve oligosakkarit Ulloa fraksiyonlarına（50 ve 100 ug/mL） maruz kalan normal insan dermal fibroblastlarının (NHDF) metabolik aktivitesi, WST-1 ile değerlendirildi (Şekil 1). Bu deneylerde (n=9), EAE'den elde edilen Ullva fraksiyonları, kontrole kıyasla fibroblastların proliferasyonunu artı yüzde 68'e kadar artırdı.cistanche faydalarıMetabolik aktivitede önemli artışlar (p<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

Bu etkilerin hücre toksisitesi ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için, Ulou özütü ile muamele edilmiş hücrelerin canlılığı, 48 saatlik inkübasyondan sonra CytoTox96 derece testi kullanılarak LDH (laktat dehidrojenaz) salınımının ölçülmesiyle değerlendirildi (n=3)(Şekil 2). Sitotoksisite tahlili, tüm fraksiyonların kontrole kıyasla önemli bir sitotoksisite sergilemediğini gösterdi.

2.3.Ulva sp.'nin Poli- ve Oligosakkarit Fraksiyonları. Fibroblastlarda Hücre Dışı Matriks Metabolizmasını Uyarır

Poli- ve oligosakarit Ulloa fraksiyonlarının fibroblast sülfatlanmış ve sülfatlanmamış glikozaminoglikanlar (GAG'ler) sentezi üzerindeki etkisi, 48 saatlik inkübasyondan sonra Alcian mavisi boyama ile değerlendirildi (n=4)(Şekil 3). Hem sülfatlanmış (p<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

En zengin ulvans fraksiyonu olan DS-UE'nin GAG sentezini en çok geliştirdiğini belirtmek ilginçtir. 50 ug/mL'de, UE ve DS-UE sülfatlanmamış GAG sentezini artırdı, ancak önemli ölçüde değil (sırasıyla artı yüzde 14,2 ve artı yüzde 22,7). Oligosakarit fraksiyonları 1000 ug/mL'de DEP-AD PP-UE sülfatlanmamış GAG sentezini hafifçe azalttı, ancak önemli ölçüde değil (yüzde -3) ve DEP-HD PP-UE 100 ug/mL'de GAG ​​sentezini biraz arttırdı ancak önemli ölçüde değil mL (sülfatlanmış için artı yüzde 4,1 ve artı sülfatsız için yüzde 10,9).

Toplam kolajen sentezi (Şekil 4), 100 ug/mL'de poli- ve oligosakkarit Ulloa fraksiyonlarına 48 saat fibroblastlara maruz kaldıktan sonra Red Sirius testi ile değerlendirildi ve n=6 50 ug/mL'de） .

Tüm fraksiyonlar, kollajen sentezinde konsantrasyona bağlı bir artış gösterdi. Kontrole kıyasla 50 ug/mL'de tüm fraksiyonlar için marjinal ve önemli olmayan kolajen sentezi düşüşü kaydedildi. Buna karşılık, 1000 ug/mL'de tüm fraksiyonlar toplam kolajen sentezini artırdı ve UE için önemli bir şekilde (artı yüzde 22, p<><0.01),and dep-hd=""><>

Poli- ve oligosakarit türetilmiş EAE fraksiyonunun tip I kollajen sentezi (n=6) ve MMP-1 sentezi(n=4) üzerindeki etkisi ELISA deneyleriyle değerlendirildi (Şekil 5).

Tüm fraksiyonlar tip I kolajen sentezini ve MP-1 sentezini artırdı, ancak her zaman önemli ölçüde değil. Tip I kollajen sentezi artışı konsantrasyona bağlıydı. 1000 ug/mL'de polisakkarit fraksiyonları, UE ve DS-UE'nin önemli ölçüde （p olduğu bulundu<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

48 saat fibroblast maruziyetinden sonra 100 ug/mL'de poli- ve oligosakkarit Ulloa fraksiyonlarının tip I(n=5) ve tip Ⅲ(n=4)kollajenlerin sentezi üzerindeki etkileri, MMP-1(n=6) ve TIMP-1(n=5) ​​üretimi, toplam şerit protein yöntemi kullanılarak normalizasyon yöntemiyle Western blot (WB) analizi ile değerlendirildi ( Şekil 6).

Şekil 6a, e ve WB'de sırasıyla tüm fraksiyonlar için olgun tip I kollajen (130 kDa) ve olgun tip III kollajen (190 kDa) sentezinde bir artış vurgulanmıştır. Tip I kollajenin Şekil 6c'deki ve tip III kollajenin Şekil 6g'deki protein nicelemesi, hem poli- hem de oligosakkaritler Ulloa sp. kesirler. Bu arada, Şekil 6b,d'deki WB, önemli bir （p'yi ölçmemize izin verdi.<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

MMP-1 kollajenaz aktivitesi, 48 saat fibroblast maruziyetinden sonra (n =4).

Sonuçlar, hem poli- hem de oligosakkarit Ulva sp. fraksiyonlar, fibroblastların MMP-1 aktivitesini önemli ölçüde artırmadı.

2.4.Ulva sp.'nin Poli- ve Oligosakkarit Fraksiyonları. Fibroblastların ECM Gen İfadesini Diferansiyel Olarak Modüle Etme

Poli- ve oligosakarit Ulloa EAE'den türetilen fraksiyonların etkisi, birkaç hücre dışı matris bileşeninin (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1 ve TIMP-1) mRNA kararlı durum seviyeleri üzerinde incelenmiştir. =4)(Şekil 8).

1000 ug/mL'deki tüm fraksiyonların önemli ölçüde azaldığını fark ettik (p<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

Tablo 2, 1000 ug/mL'de fraksiyonlara fibroblast maruziyetinden sonra gen mRNA sabit durum seviyesi üzerindeki birleşik sonuçları gösterir.

Tablo 2, UE'nin önemli ölçüde azaldığını göstermektedir (p<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

Bu makale Mart. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs