Parkinson Hastalığının Teşhisi İçin Potansiyel Gözyaşı Biyobelirteçleri—Bir Pilot Çalışma Ⅰ

Özet: Parkinson hastalığı (PD), Alzheimer hastalığından sonra en sık görülen ikinci nörodejeneratif hastalıktır. Bu çalışmada idiyopatik PH'li hastaların (iPD, n=24), E46K-SNCA mutasyonu taşıyıcılarının (n=3) ve sağlıklı kontrolün (CT, n {{4}) gözyaşı proteom profili }}) denekler, PH teşhisi için aday biyobelirteçleri belirlemek üzere analiz edildi. Katılımcının gözyaşı örneklerini nano-sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (nLC-MS/MS) ile araştıran ve nörolojik bozulmalarını değerlendiren gözlemsel, prospektif ve vaka kontrollü bir pilot çalışma gerçekleştirildi. Elde edilen proteomik veriler, ProteomeXchange'te 10.6019/PXD028811 tanımlayıcısı ile mevcuttur.

Parkinson hastalığı için Amway'den kürtaj yaptırmak için tıklayın

Bu analizler, 560 gözyaşı proteininin tanımlanmasına yol açtı, bunlardan bazıları PD hastalarında serbest bırakıldı ve bağışıklık tepkileri, iltihaplanma, apoptoz, kollajen yıkımı, protein sentezi, savunma, lipid taşınması ve değiştirilmiş lizozomal fonksiyon ile ilişkilendirildi. Bu proteinlerden altısı nörodejeneratif süreçlerle ilgiliydi ve hastaları ve kontrolleri sınıflandırmak için mükemmel bir kapasite gösterdi. Bu bulgular, PD hastalarının gözyaşlarında belirli proteinlerin, özellikle de lizozomal fonksiyonda yer alan proteinlerin yukarı regüle edildiğini ortaya çıkardı. Bu nedenle, bu çalışmada gözyaşı proteinlerinin, Parkinson hastalarında agresif bir hastalık fenotipi ile ilişkili olabilecek nörodejenerasyonda rol oynadığı belirlendi.

Anahtar Kelimeler: biyobelirteçler; Parkinson hastalığı; gözyaşı filmi; lizozom

1. Giriş

Parkinson hastalığı (PD), Alzheimer hastalığından (AD) sonra en yaygın ikinci nörodejeneratif hastalıktır ve hareket yavaşlığı (bradikinezi), artmış kas tonusu (sertlik), titreme (titreme) ve bozulmuş postüral kontrol ile karakterizedir. Patolojik olarak doğrulanmış PD'de, merkezi sinir sisteminde (CNS) Lewy cisimcikleri (LB'ler) ve Lewy nöritleri şeklinde yanlış katlanmış alfa-sinüklein (-syn) değişken miktarı ve birikimi vardır. Bu yapıların birikimindeki bu değişkenlik, muhtemelen bu hastalıktaki klinik heterojenliği yansıtmaktadır [1-3]. Gerçekten de, idiyopatik (IPD) ve genetik PD'li hastalar ve LB'li demanstan muzdarip hastalar dahil olmak üzere, Lewy cisimcikli hastalıklar (LBD'ler) spektrumunda birçok klinik bozukluk yer alır. Nörodejeneratif hastalıklarla baş etmedeki ana zorluklardan biri, hastaların erken sınıflandırılmasına izin veren ve hastalık ilerlemesinin izlenmesine yardımcı olan klinik belirteçler bulmaktır.

Oksidatif stres, proteoliz ve değiştirilmiş yağ asidi veya fosfolipid konsantrasyonları gibi faktörler, -syn'deki yapısal değişikliklerle ilişkilendirilmiştir ve post-translasyonel modifikasyonlar ayrıca -sin'in boyutunu, yapısını veya protein yükünü değiştirebilir [4]. -syn genindeki (SNCA) düzensiz mutasyonlar ve çoğalmalar, otozomal-dominant ailesel PD formlarına neden olur [5]. Belki de PD'ye neden olduğu bilinen en patojenik mutasyon, -syn'deki (E46K-SNCA) E46K mutasyonudur ve bu, LB'li demansı anımsatan klinik ve patolojik özelliklere sahip bir grup agresif, genetik LBD'nin temelini oluşturur [6,7]. -syn'deki mutasyonlar nadir olmasına rağmen, PH'li hastaları belirlemek ve bu patolojilerin ilerlemesini daha iyi anlamak için eşsiz bir fırsat sağlarlar.

PH hastalarının halüsinasyonlar, göz ve göz kapağı hareketlerinde değişiklikler ve azalmış miktarlarda gözyaşı bileşiminde değişiklikler geliştirdiği bilinmektedir [8,9]. Göz yüzeyi hasarına ek olarak, bu hastalar akomodasyonda değişiklikler, görme keskinliğinde azalma, skotom oluşumu (görme alanlarının kısmen azaldığı veya tamamen bozulduğu alanlar) ve özellikle bir azalmaya bağlı olarak retina tabakalarında incelme yaşayabilir. sinir liflerinin sayısında [10,11]. Nörotransmisyon ve monoamin metabolizmasındaki eksiklikler de PH hastalarının görme sistemindeki patolojik değişiklikleri etkiler [12].

Bu değişiklikler oldukça tipiktir, çünkü monoaminler retinada görsel bilginin iletilmesinde yer alır [13]. Ayrıca, PD hastaları, gözün ön kısmının innervasyonunda, nihayetinde gözyaşı bileşimini değiştirebilen değişiklikler yaşayabilir. Aköz hümör veya korneadan geçen sinirlerden kaynaklanan birçok nörotransmitter ve trofik madde gözyaşında salgılanır [14].

Bununla birlikte, bu ilişkilerin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmalar henüz tam olarak aydınlatılmamıştır. PD birkaç motor olmayan sistemi ve periferik sinirleri etkilediğinden, bu hastalarda lakrimal sekresyon değişebilir ve gözyaşı proteini bileşimi bu hastalarda tanısal bir biyobelirteç olarak hizmet edebilecek karakteristik bir profil sergileyebilir. Bu anlamda, E46K-SNCA ve iPD'li hastaların gözyaşı proteinlerinin analiz edilmesi, PH'nin teşhisi ve ilerlemesi için yararlı aday biyobelirteçlerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Bu nedenle, bu çalışma, non-invaziv numuneler kullanarak ileride PD tanısında yardımcı olabilecek bir biyobelirteç bulmak için iPD hastalarında ve E46K-SNCA mutasyonunun taşıyıcılarında gözyaşı proteom profilini analiz etmeyi amaçladı.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Çalışma Grubu

24 iPD hastası, 3 E46K-SNCA mutasyonu taşıyıcısı ve 27 sağlıklı deneğin (CT) kaydedildiği gözlemsel, prospektif, vaka kontrollü bir pilot çalışma tasarladık. Bu araştırma, OSI Ezkerralde-Enkaterri-Cruces Etik Komitesi CEIC E18/47'den onay alındıktan sonra tıbbi açıdan kalifiye personel tarafından yapılmıştır. Çalışma, İnsan Deneklerini İçeren Biyomedikal Araştırmalara İlişkin Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine tam olarak uygun olarak gerçekleştirildi. Örnek toplamadan önce, çalışmanın doğası ve olası sonuçları açıklandıktan sonra tüm deneklerden imzalı bilgilendirilmiş onam alındı. Hastalar, üzerinde anlaşmaya varılan dahil etme ve hariç tutma kriterlerine dayalı olarak, ayakta hasta konsültasyonları sırasında Cruces Üniversite Hastanesinin (Barakaldo, Bizkaia, İspanya) Nöroloji ve Oftalmoloji Servis Birimlerinde işe alındı. IPD'li hastalar, PH tanısı için Parkinson's UK Brain Bank kriterlerini karşıladı ve bilinen herhangi bir mutasyon taşımadı.

CT'ler için dahil etme kriterleri, her iki cinsiyetten de 40 yaşın üzerinde olmak ve herhangi bir nörolojik bozukluğun klinik öyküsü olmamasıydı. Herhangi bir sistemik veya oküler rahatsızlığı/durumu olan (veya öyküsü olan) bireyler çalışmaya dahil edildi. Hariç tutma kriterleri, önceki üç ay içinde göz ameliyatı, kronik göz ilacı (örneğin, glokom için), alerji öyküsü, herhangi bir topikal ilaç (suni gözyaşı dışında) veya kortikosteroid içeren oral ilaç, atopi ve Sjögren hastalarından oluşuyordu. sendrom.

Kontakt lens kullanıcıları da sonuçların yorumlanmasında herhangi bir olası müdahaleyi önlemek için hariç tutulmuştur. Ön oküler testler ve numune alımı aynı gün yapılırken, PH'li hastalar da hareket bozuklukları konusunda uzman olan araştırma ekibi üyeleri tarafından Parkinson Skalalarını değerlendirmek için ayrı bir günde görüldü.

2.2. Oftalmolojik Muayene

Klinik oftalmolojik muayene, gözün nemli tutmak için yeterli gözyaşı üretip üretmediğini belirleyen Schirmer testi I'i (SCH) içermiştir. Test, gözyaşı içindeki suyun bir kağıt test şeridinin uzunluğu boyunca hareket etmesine izin verir ve normal değerler, 5 dakika sonra kağıdın 10 mm ıslanmasından büyük veya eşittir. Gözyaşı filmi kararsızlığı, floresein ile gözyaşı kırılma süresi (TBUT) kullanılarak değerlendirildi. TBUT, tam bir göz kırpmanın ardından korneada ilk kuru noktanın görünmesi için geçen süredir. 10 s'den küçük bir değer genellikle bazı gözyaşı filmi istikrarsızlığını yansıtır. Sonuçların yorumlanmasını engelleyebilecek herhangi bir sistemik hastalık veya başka bir durum/ilaç kullanımı, bir dışlama kriteri olarak kabul edildi.

2.3. Nörolojik muayene

Hareket bozuklukları alanında uzman bir nörolog, PH hastalarının gözyaşı toplama anındaki yaşlarını, hastalık sürelerini ve Birleşik Parkinson Hastalığı Derecelendirme Ölçeği (UPDRS) ve Hoehn Yahr ölçeğindeki puanlarını kaydetti. Bu testler, hastalığın ilerlemesini izlemek için tabakalandırma kriterleri olarak hizmet eder. Basque Biobank kullanılarak hasta verilerinin gizliliği sağlandı.

2.4. Gözyaşı Örneği Toplama

Tüm gözyaşı örnekleri, kalibre edilmiş 10 uL cam mikrokapiller tüpler (BLAUBRAND intraMark, Wertheim, Almanya) kullanılarak toplandı. Alt temporal yırtık menisküsünden, oküler yüzey veya kapak marjının tahrişini en aza indirecek şekilde ve anestezi uygulanmadan gözyaşı numuneleri alındı. Her katılımcının her iki gözünden gözyaşı örnekleri toplandı ve hemen önceden soğutulmuş Eppendorf tüplerine yerleştirildi. Gözyaşı alımından sonra örnekler analizlerine kadar -80 ◦C'de saklandı.

2.5. Proteomik Analizler

Proteomik analizler, numune işleme ve sindirme için Filtre Destekli Numune Hazırlama (FASP) protokolü [15] kullanılarak CIC bioGUNE Proteomics Servisinde (Derio, Bizkaia, İspanya) gerçekleştirildi. Tripsin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD) 1:5'lik bir tripsin: protein oranında ilave edildi0 ve karışım gece boyunca 37°C'de inkübe edildi, bir RVC'de kurutuldu{{4} } Speedvac yoğunlaştırıcı (Christ, Viyana, Avusturya). Elde edilen peptitlerin tuzu giderildi ve C18 aşamalı uçlar (Millipore, St. Louis, MO, ABD) kullanılarak yüzde 0.1 Formik Asit (FA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD) içinde yeniden süspanse edildi.

Numuneler, çevrimiçi olarak bir nanoElute sıvı kromatografına (Bruker, Coventry, BK) bağlanmış yeni bir hibrit hapsolmuş iyon mobilite spektrometresi dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometresinde (PASEF ile timsTOF Pro, Bruker Daltonics, Bremen, Almanya) analiz edildi. Bu kütle spektrometresi, hassasiyette herhangi bir kayıp olmadan sıralama hızını artıran paralel birikimli seri parçalanma (PASEF) olarak adlandırılan yeni bir tarama modundan yararlanır ve proteomik analizler için olağanüstü analitik hız ve hassasiyet sağladığı kanıtlanmıştır [16].

Numuneler (200 ng) doğrudan 15 cm Bruker nano elute FIFTEEN C18 analitik kolonuna (Bruker, Coventry, BK) yüklendi ve 400 nL/dk'da çözüldü. Sütun bir etüvde 50°C'ye ısıtıldı. PEAKS yazılımı (Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, CA, ABD) kullanılarak protein tanımlaması ve miktarı gerçekleştirildi. Kanonik insan Uniprot/Swissprot girişlerinin (izoform dikkate alınmadan) veri tabanına karşı öncül ve parça toleransları ile aramalar yapıldı. 20 ppm ve 0,05 Da.

PEAKS yazılımında bulunan PEAKS Q modülü kullanılarak alan bazlı etiketsiz bir protein ölçümü gerçekleştirildi. Sadece yüzde 1'in altında Yanlış Keşif Oranında (FDR) en az iki peptit ile tanımlanan ve analiz altındaki deney gruplarından birinden alınan numunelerin en az yüzde 70'inde bulunan proteinler ileri analiz için dikkate alındı. Veriler, Perseus platformuna [17] yüklendi ve diferansiyel protein-ifade analizi için bir Student t-testi uygulanmadan önce işlendi (log2 dönüşümü, değerlendirme). Proteomik verileri, Ek Malzemeler Dosyası S1'de özetlenmiştir ve kütle spektrometresi proteomik verileri, PXD028811 ve 10.6019/PXD028811 veri kümesi tanımlayıcıları ile PRIDE [18] ortak deposu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumuna depolanmıştır.

2.6. İstatistiksel Analizler

İstatistiksel analizler, Windows için IBM SPSS Statistics paketi, 23.0v (IBM-SPSS, Armonk, New York, NY, ABD) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sürekli verilerin normalliği bir Shapiro-Wilk testi ile değerlendirildi. Hesaplanan p-değerleri, veri kümesindeki proteinler ile belirli bir kanonik yol, işlevsel ağ veya yukarı akış düzenleyici arasındaki ilişkinin, bir p-değeri < {{5) olan bir Fisher'in kesin testine dayalı olarak yalnızca şans eseri açıklanma olasılığını belirler. }}.05 önemli kabul ediliyor.

PD-hasta ayrımı ile ilişkili istatistiksel olarak anlamlı özellikleri belirlemek için tek değişkenli lojistik regresyonlar kullanıldı. Değişken seçiminden sonra, bir PD ayrımcılık modeli oluşturmak ve PD tanımlamasıyla ilgili klinik ve proteomik değişkenleri belirlemek için çok değişkenli lojistik regresyonlar kullanıldı. Lojistik modeller, ayrı bir bağımlı değişken ile bir dizi sürekli veya ayrık bağımsız değişken arasındaki ilişkinin tahmin edilmesini sağlar. Modeller, her bir gruba ait olma olasılığını hesaplayarak, Parkinson hastalığı olan veya olmayan hastaların sınıflandırılmasına izin verir. Her ortak değişkenin p değeri, yanıt ile modele dahil edilen her terim arasındaki ilişkinin istatistiksel önemini tanımlar.

daha fazla bilgi için: Ali.ma@wecistanche.com