İskemik İnme ve Alzheimer Hastalığının Kombine Tedavisi İçin Ayrıcalıklı KinolilnitronlarⅡ

3. Malzemeler ve Yöntemler

3.1. sentez

Hedef QN'ler, Ek Malzemede gösterildiği gibi hazırlandı ve saflaştırıldı.

3.2. İskemi Deneysel Modelinde Nöroproteksiyon Analizi

3.2.1. Birincil Nöronal Kültürler

Birincil nöronal kültürler, daha önce tarif edildiği gibi serebral korteksten hazırlandı [16]. Serebral korteksler E16 Sprague-Dawley sıçan embriyolarından elde edildi, homojenleştirildi ve 2,5 x 105 hücre/cm2 yoğunlukta 0,05 mg/mL poli-Dlizin ile önceden kaplanmış plastik çoklu tabaklara ekildi. Hücre kültürleri, yüzde 15 ısı ile inaktive edilmiş (56 °C, 30 dakika) fetal buzağı serumu ile takviye edilmiş yüksek glukozlu Dulbecco ortamında 37°C'de yüzde 6.5 CO2 atmosferinde tutuldu. 24 saat sonra kültür ortamı, serumsuz ortam (Dulbecco's/Ham's F12, 1:1 hacim/hacim, 5 mg/mL glukoz, 2 mM L-glutamin ve 1 mM sodyum piruvat) ile değiştirildi ve 100 ug ile desteklendi /mL transferrin, 100 uM putresin, 20 nM progesteron, 30 nM sodyum selenit ve 5 ug/mL insülin).

Alzheimer hastalığı için tubulosa kapsülleri kesmek için tıklayın

Bildirilen deneylerde, 6- ila 7-gün in vitro (DIV) nöronal kültürler kullanılmış olup, bunlar daha önce açıklandığı gibi yüzde 90 -tubulin izotip III-pozitif olgun nöronlar içermektedir [17]. Hayvan deneyleriyle ilgili tüm prosedürler, Hastane Universitario Ramón y Cajal'ın (Madrid, İspanya) Etik Kurulu tarafından yetkilendirilmiştir.

3.2.2. Nöronal Kültürlerde ve Tedavilerde Deneysel İskemi

Deneysel iskemiyi indüklemek için, primer nöronal kültürler oksijen-glukoz yoksunluğuna (OGD) tabi tutuldu [18]. 6- ila 7-DIV kültürleri yıkandı ve önceden 30 dakika boyunca yüzde 95 N2/5 CO2 ile köpürtülmüş glikoz içermeyen Dulbecco ortamına yerleştirildi ve aşağıdakileri içeren nemlendirilmiş bir anaerobik odada tutuldu: yüzde 95 N2/yüzde 5 CO2 gaz karışımı 37 ◦C'de 4 saat (OGD4h). Kontrol grubu glukoz ilaveli Dulbecco besiyerine yerleştirildi ve 4 saat normoksik inkübatörde tutuldu. Anoksik (OGD4h) veya normoksik (kontrol) koşul altında 4 saatlik inkübasyonun ardından, kültür hücreleri hızlı bir şekilde serumsuz normoglisemik kültür ortamına ve reoksijenasyon koşuluna yerleştirildi, ardından bileşikler veya araç eklendi ve hücreler iyileşme için normoksik ve normoglisemik koşullarda tutuldu 24 saat boyunca

Araç deney grubu (R24h), test edilen bileşiklerle aynı miktarda aracı içermiştir (son konsantrasyon metinsiz 0,5 yüzde etanol). 24 saat geri kazanımdan sonra hücre canlılığı belirlendi. Test edilen her gruba, deneysel prosedürü körü körüne gerçekleştirmek için rastgele bir sıra verildi. Bileşik deneyleri, farklı kültür grupları ile bağımsız olarak dört ila sekiz farklı kez gerçekleştirildi ve her deney, dört kopya halinde gerçekleştirildi.

3.2.3. Hücre Canlılığı Deneyi

Bileşiklerin OGD'ye karşı nöroprotektif etkisinin değerlendirilmesi için, hücre yaşayabilirliği, 3-(4,5-dimetiltiyazol{{3)'ün fotometrik indirgenmesiyle belirlendiği üzere, canlı, metabolik olarak aktif hücrelerin nicelendirilmesiyle değerlendirildi. }}il)-2,5-difenil tetrazolyum bromür (MTT) (Roche)'den mavi bir formazan ürününe.

MTT tahlili iyileşme döneminden sonra yapıldı - OGD döneminin bitiminden hemen sonra MTT'nin eklendiği OGD 4 saat grubu hariç, iyileşme olmadı - hücrelere 0,2 mg/mL MTT uygulanarak yapıldı. kültür ortamında 1,5 saat 37 ◦C'de yüzde 6,5 CO2 atmosferinde. Kuluçkadan sonra hücreler, gece boyunca eşit hacimde lizis solüsyonu (10 mM HCI, yüzde 10 SDS) ile parçalandı. MTT indirgemesi, 595 nm'de (referans olarak 690 nm) absorbans ölçümü ile nicelendirildi. Azalan MTT aktivitesi, mitokondriyal fonksiyon bozukluğunu gösterir ve hücre hasarının göstergesi olarak kabul edilir.

3.3. AD Deneysel Modellerinde Nöroproteksiyon Analizi

3.3.1. SHSY-5Y Hücre Kültürü

Nöroblastoma SH-SY5Y hücre çizgisi, Sigma-Aldrich'ten (Madrid, İspanya) elde edildi, muhafaza edildi ve yüzde 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Eagle's minimum temel ortam (EMEM) ve F12 ortamının 1:1 karışımında kültürlendi ), daha önce açıklanan prosedürlere göre [8].

Kültürler şişelere ekildi ve yüzde 5 CO2 ve yüzde 95 havadan oluşan nemli bir atmosferde 37°C'de tutuldu. Canlılık analizleri için SH-SY5Y hücreleri, bildirilen prosedür izlenerek 96-gözlü plakalara 50,000 hücre/kuyu yoğunlukta ekildi [8]. Bu çalışmada, tüm hücreler düşük geçiş sayısında kullanılmıştır (<14).

3.3.2. Nöroproteksiyon Çalışmaları

Bileşiklerin potansiyel nöroprotektif etkisini incelemek için hücreler, bileşiklerle 0.3, 1, 3 veya 10 uM'de 24 saat süreyle ön kuluçkaya bırakıldı. Daha sonra hücreler, 30 uM Rotenon ve 10 uM Oligomisin-A (R/O) [19], Okadaik Asit (20 nM) [20] veya Amiloid- 25-35 (30 uM) (Sigma-Aldrich, Madrid, İspanya) 24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda bileşik içeren veya içermeyen. Deneyin sonunda, hücre canlılığı, Bölüm 3.2.3'te açıklanan MTT yöntemi kullanılarak ölçüldü.

3.4. İstatistiksel analiz

Her tedavi için elde edilen sonuçların ortalaması alındı ​​ve bağımsız olarak analiz edildi ve tedavi bilgileri çalışma boyunca gizli tutuldu. Veriler ortalama ± SE olarak temsil edildi. Varyans analizi (ANOVA), varyans analizi anlamlı olduğunda bir post hoc testi takiben çoklu konsantrasyonlar arasındaki verileri karşılaştırmak için gerçekleştirildi. İstatistiksel önem seviyesi, Prism istatistik yazılımı 5.0 (GraphPad) kullanılarak {{0}}.05 olarak ayarlandı.

3.5. ADME Analizi

MC903 bileşiğinin ADME özellikleri, Schrödinger'in QikProp modülüyle değerlendirildi (QikProp, sürüm 5.1, Schrödinger, LLC, New York, NY, ABD, Ocak 2017) [21–23].

4. Sonuçkullanımlar

Bu çalışmada, iskemik inme ve AD'nin potansiyel kombine tedavisi için tek ve yeni ajan arayışında elde ettiğimiz ön sonuçları açıkladık. Bildirilen diğer yaklaşımların [14,15] aksine, burada ilk kez, en gelişmiş kurşun bileşiklerimiz olan QN23 ve Contilisant'tan seçilen farmakoforların yan yana getirilmesine dayanan fragman tabanlı bir ilaç tasarım stratejisi kullanan rasyonel olarak yönlendirilen bir ilaç tasarımını ele aldık. sırasıyla iskemik inme ve AD tedavisi için.

Bu nedenle, nöroprotektif-antioksidan ajanlar olarak sadece ROS seviyelerini düşürmekle kalmayıp aynı zamanda biyolojik hedeflere bağlanabilen ve nörotransmiterlerin seviyesini artırabilen yeni nitronlar arayarak - AD hastalarının beyninde bulunan önemli bir eksiklik - QN'ler JMA101A, JMA98C'yi sentezledik. , DDI89, DDI88, JMA12A, JMA11A, MC903 ve MC902 (Şekil 1) ve bunları iskemik yaralanma ve AD için uygun fenotipik analizlere tabi tuttu. Sonuç olarak, MC903'ü bir suikast ajanı olarak tanımlayabildik. Yapıyla ilgili olarak, MC903, diğer nitrojende bir metoksi grubu yerine O(C6)'ya bağlı bir lineer üç metilen motifi ile ikame edilen bir N-propargil piperazin dışında, QN23 ile aynı konumlarda aynı fonksiyonel grupları taşır.

Burada bildirilen ön SAR ile elde edilen sonuçlar dikkate alındığında, bu fonksiyonel ve farmakofor düzenlemesi, gözlemlenen faaliyetler için kritik görünmektedir ve daha sonraki gelişmeler için dikkate alınmalıdır. Bu nedenle MC903, iskemik inme ve AD'nin potansiyel kombine tedavisi için yeni ve küçük bir QN'dir ve deneysel bir iskemi modeli olarak OGD koşulları altında birincil nöronal kültürlerde ve R/O, OA'ya karşı nöronal hat hücrelerinde güçlü nöroprotektif özellikler gösterir. AD'de bulunan etkileri taklit eden 25-35 tedavi.

Bu ümit verici sonuçlara dayalı olarak, çabalarımız artık hit-MC903'ün gözlemlenen farmakolojik profilini, ilgili enzimatik ve reseptör bağlama analizleri dahil olmak üzere yeni ilgili QN'lerin tasarımı, sentezi ve biyolojik değerlendirmesi yoluyla iyileştirmeye yöneliktir. uygun iskemik inme ve AD hayvan modellerine sunmak. Mevcut sonuçlar, iskemik inme ve AD'nin kombine tedavisi için yeni ajanlar arayışında yeni terapötik içgörüler ve gelişmelerin yolunu açmaktadır.

Cista'nın mekanizmasınche nöro koruma etkisi

Cistanche, nöroprotektif etkilere sahip olduğu bildirilen geleneksel bir Çin bitkisidir. Bu etkilerin arkasındaki mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır, ancak araştırmacılar tarafından önerilen birkaç olası mekanizma vardır:

1. Antioksidan aktivite: Cistanche özlerinin, oksidatif stres kaynaklı nöronal hasara karşı koruma sağlayabilen güçlü antioksidan aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur.

2. Anti-inflamatuar etkiler: Enflamasyon, nörodejeneratif hastalıkların yaygın bir nedenidir ve cistanche özlerinin, nöronal hasarı azaltabilecek anti-inflamatuar etkilere sahip olduğu gösterilmiştir.

3. Mitokondriyal fonksiyonun korunması: Mitokondriyal disfonksiyon, nöronal hasara ve hücre ölümüne önemli bir katkıda bulunur ve cistanche özlerinin mitokondriyal hasara karşı koruma sağladığı ve mitokondriyal fonksiyonu iyileştirdiği bulunmuştur.

4. Nörotrofik faktörlerin aktivasyonu: Nörotrofik faktörler, nöronların büyümesini ve hayatta kalmasını destekleyen kimyasallardır ve cistanche özlerinin, beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ve sinir büyüme faktörü (NGF) gibi nörotrofik faktörlerin ekspresyonunu arttırdığı gösterilmiştir. .

referansces

1 Carney, JM; Starke-Reed, PE; Oliver, CN; Landum, RW; Cheng MS; Wu, JF; Floyd, RA Spin-trapping bileşik N-tert-butil-alfa-fenilnitron'un kronik olarak uygulanmasıyla beyin protein oksidasyonundaki yaşa bağlı artışın, enzim aktivitesinde azalmanın ve zamansal ve uzamsal bellekteki kaybın tersine çevrilmesi. Proc. Natl. Acad. bilim ABD 1991, 88, 3633–3636. [ÇaprazRef]

2. Akçaağaçlar, KR; Yeşil, AR; Floyd, RA Nitrone İlişkin Terapötikler. CNS Drugs 2004, 18, 1071–1084. [CrossRef] [PubMed]

3. Zhang, S.; Gao, T.; Luo, Y.; Chen, X.; Gao, G.; Gao, X.; Zhou, Y.; Dai, J. Geçici fokal serebral iskemi/reperfüzyon, sıçanlarda erken ve kronik aksonal değişikliklere neden olur: Alzheimer hastalığı riski açısından önemi. PLoS BİR 2012, 7, e33722. [ÇaprazRef]

4. Kim, HA; Miller, AA; Drummond, GR; Amanda, G.; Tasarruf, AG; Arumugam, TV; Phan, TG; Srikanth, VK; Sobey, CG Vasküler bilişsel bozukluk ve Alzheimer hastalığı: Serebral hipoperfüzyon ve oksidatif stresin rolü. Naunyn-Schmiedeberg'in Kemeri. Eczacılık 2012, 385, 953–959. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhen, G.; Kim, YT; Li, RC; Yokum, J.; Kapoor, N.; Langer, J.; Dobrowolski, P.; Maruyama, T.; Narumiya, S.; Doré, S. PGE2 EP1 reseptörü, bir serebral iskemi ve Alzheimer hastalığı fare modelinde nörotoksisiteyi şiddetlendirdi. Nörobiyol. Yaşlanma 2012, 33, 2215–2219. [ÇaprazRef]

6. Macrae, MI; Allan, SM İnme: Geçmiş, bugün ve gelecek. Beyin Nörobilim. Av. 2018, 2, 1–5. [ÇaprazRef]

7. Chioua, M.; Martìnez-Alonso, E.; Gonzalo-Gobernado, R.; Ayuso, MI; Escobar-Peso, A.; Bebekler, L.; Hadjipavlou-Litina, D.; Montoya, JJ; Montaner, J.; Alcazar, A.; et al. İnme tedavisi için yeni kinolilnitronlar: Antioksidan ve sinir koruyucu (Z)-N-tert-bütil-1-(2-kloro-6-metoksikinolin-3-il) metenamin oksit (yeni bir kurşun olarak) -iskemik inme tedavisi için bileşik J. Med. Chem. 2019, 62, 2184–2201. [CrossRef] [PubMed]

8. Bautista-Aguilera, OM; Hagenow, S.; Palomino-Antolin, A.; Farré-Alìns, V.; İsmaili, L.; Joffrin, P.-L.; Jimeno, ML; Soukup, O.; Janocova, J.; Kalinowsky, L.; et al. Nörodejeneratif hastalıklar için kolinesteraz ve monoamin oksidaz inhibisyonunu histamin H3R antagonizmi ile birleştiren çok hedefe yönelik ligandlar. Angew. kimya uluslararası Ed. 2017, 56, 12765–12769. [CrossRef] [PubMed]

9. Bautista-Aguilera, OM; Budni, J.; Mina, F.; Medeiros, EB; Deuther-Conrad, W.; Giriş, JM; Moraleda, I.; Iriepa, I.; LòpezMunoz, F.; Marco-Contelles, J. Contilisant, kolinesteraz, monoamin oksidaz inhibisyonu ve H3R antagonizmini S1R agonizm profili ile birleştiren Alzheimer hastalığı tedavisi için bir tetra hedefli küçük molekül. J.Med. kimya 2018, 61, 6937–6943. [CrossRef] [PubMed]

10. Bolea, I.; Juàrez-Jiménez, J.; de los Rios, C.; Chioua, M.; Pouplana, R.; Luque, FJ; Ünzeta, M.; Marco-Contelles, J.; Samadi, A. Donepezil ve n-[(5-(benziloksi)-1-metil-1h-indol-2-il)metil] sentezi, biyolojik değerlendirmesi ve moleküler modellemesi - Alzheimer hastalığının tedavisi için yeni multipotent kolinesteraz/monoamin oksidaz inhibitörleri olarak nmetilprop-2-yn-1-amin hibritleri. J.Med. kimya 2011, 54, 8251–8270. [CrossRef] [PubMed]

11. Brouns, R.; De Deyn, PP Akut iskemik inmede nörobiyolojik süreçlerin karmaşıklığı. klinik Nörol. beyin cerrahı 2009, 111, 483–495. [ÇaprazRef]

12. Marco-Contelles, J. A Tau, lobi mi yoksa din mi? ACS Med. kimya Letonya 2019, 10, 1361–1362. [CrossRef] [PubMed]

13. Oset-Gasque, MJ; Marco-Contelles, J. Alzheimer hastalığı, "tek molekül, tek hedef" paradigması ve çok hedefli yönlendirilmiş ligand yaklaşımı. ACS Kimya Nörobilim. 2018, 9, 401–403. [CrossRef] [PubMed]

14. Güneş, P.; Zhou, W.; Yue, H.; Zhang, C.; Ö, Y.; Yang, Z.; Hu, W. Bileşik AD110, fare ve sıçan modellerinde Alzheimer hastalığı ve inme için terapötik yönetim görevi görür. ACS Kimya Nörobilim. 2020, 11, 929–938. [CrossRef] [PubMed]

15. Liu, Z.; Cai, W.; Lang, M.; Yan, R.; Li, Z.; Zhang, G.; Evet.; Wang, Y.; Güneş, Y.; Zhang, Z. Parkinson hastalığı modelinde serbest radikalleri, monoamin oksidaz B'yi ve kolinesterazı hedef alan çok işlevli ajanların nöroprotektif etkileri ve etki mekanizmaları. J. Mol. Nörobilim. 2017, 61, 498–510. [CrossRef] [PubMed]

16. Quevedo, C.; Salinas, M.; Alcázar, A. Başlatma faktörü 2b aktivitesi, insülin benzeri büyüme faktörü 1-uyarılan nöronal hücrelerde mitojenle etkinleştirilen protein kinaza (harita) bağlı yol tarafından etkinleştirilen protein fosfataz 1 tarafından düzenlenir. J. Biol. kimya 2003, 278, 16579–16586. [ÇaprazRef]

17. Sid, C.; Alcazar, A.; Regidor, I.; Masjuan, J.; Salinas, M.; Álvarez-Cermeño, J. Multipl skleroz hastalarından beyin omurilik sıvısı tarafından indüklenen nöronal apoptoz, t1 manyetik rezonans görüntülemede hipointens lezyonlarla ilişkilidir. J. Neurol. bilim 2002, 193, 103–109. [ÇaprazRef]

18. Chioua, M.; Salgado-Ramos, M.; Diez-Iriepa, D.; Escobar-Peso, A.; Iriepa, I.; Hadjipavlou-Litina, D.; Martínez-Alonso, E.; Alcazar, A.; Marco-Contelles, J. Nöroprotektif ve antioksidan özellikleri birleştiren yeni kinolilnitronlar. ACS Kimya Nörobilim. 2019, 10, 2703–2706. [CrossRef] [PubMed]

19. Malek, R.; Arribas, RL; Palomino-Antolin, A.; Totoson, P.; Demougeot, C.; Kobrlova, T.; Soukup, O.; Iriepa, I.; Moraleda, I.; DiezIriepa, D.; et al. Alzheimer hastalığı tedavisi için histamin h3 reseptörleri (h3r) antagonizmi ve ek kolinesteraz inhibisyonu ile kalsiyum kanalları blokajını birleştiren yeni ikili küçük moleküller. J.Med. kimya 2019, 26, 11416–11422. [ÇaprazRef]

20. Buendia, I.; Egea, J.; Parada, E.; Navarro, E.; Leon, R.; Rodriguez-Franco, MI; López, MG Melatonin-N,N-dibenzil(Nmetil)amin hibrit ITH91/IQM157, hemo-oksijenaz-1 indüksiyonu yoluyla bir in vitro Alzheimer modelinde nöroproteksiyon sağlar. ACS Kimya Nörobilim. 2015, 18, 288–296. [ÇaprazRef]

21. Lipinski, CA; Lombardo, F.; Hakimiyet, BW; Feeney, PJ İlaç keşfi ve geliştirme ortamlarında çözünürlüğü ve geçirgenliği tahmin etmeye yönelik deneysel ve hesaplamalı yaklaşımlar. Av. Uyuşturucu Dağıtımı Rev. 2001, 46, 3–26. [ÇaprazRef]

22. Duffy, EM; Jorgensen, WL Simülasyonlardan özelliklerin tahmini: Heksadekan, oktanol ve suda serbest çözülme enerjileri. J. Am. kimya Sos. 2000, 122, 2878–2888. [ÇaprazRef]

23. Jorgensen, WL; Duffy, EM Monte carlo simülasyonlarından ilaç çözünürlüğü tahmini. Biorg. Med. kimya Letonya 2000, 10, 1155–1158. [ÇaprazRef]