trDil
Ana sayfa / Bilgi / İçerik

Bilgi

Hsa-microRNA-4535-aracılı TGF /Smad Sinyali Yoluyla H2O2/UVB ile Uyarılan Dermal Fibroblast Kollajen Bozunmasına Karşı Cistanche'ın Koruyucu Etkileri

May 06, 2023

SOYUT

Bu çalışma, bu durumun altında yatan mekanizmayı araştırmayı amaçlamıştır.cistanche'nin koruyucu etkileriin vitro ve in vivo fotohasar modelleri kullanılarak H2O2/UVB kaynaklı hasara karşı. Ayrıca, miRNA düzenlemesinin bu sürece dahil olduğunu belirledik. H2O2/UVB ile muamele edilmiş HS68 insan dermal fibroblastları ve UVB ile indüklenen C57BL/6J çıplak fareler, in vitro ve in vivo fotohasar modelleri olarak kullanıldı. Sonuçlar gösterdi kikist tedavisihücre canlılığında H2O2/UVB'nin neden olduğu azalmayı hafifletti, TGF /Smad sinyal bozukluğuve dermal yaşlanma. microRNA dizi analizlerinin ve veritabanı aramalarının sonuçlarına göre has-miR-4535,Smad4'ü hedefleyen potansiyel aday miRNA. In vitro, cistanche tedavisi Smad2/3/4 kompleksini aktive etti ve H2O2/UVB'ye maruz kalan hücrelerde hsa-miR-4535 ekspresyonunu inhibe etti. C57BL/6J çıplak farelerin sırt derisine düşük (12 mg/kg) ve yüksek dozlarda (24 mg/kg) cistanche'ın in vivo topikal uygulaması, TGF/Smad kollajen sentezi sinyalini teşvik ederek UVB'nin neden olduğu cilt fotohasarını önemli ölçüde hafifletti. epidermal hiperplaziyi, kırışık oluşumunu ve cilt yaşlanmasını azaltmanın yanı sıra hsa-miR-4535 ifadesini inhibe eder. Birlikte ele alındığında, bulgularımız hsa-miR-4535 ve TGF /Smad kollajen sentezi sinyali arasında bir bağlantı olduğunu gösteriyor ve bu faktörlerin, H2O2/UVB kaynaklı yaşlanmaya karşı dermal fibroblastlardaki foto-koruyucu cistanche mekanizmasına dahil olduğunu öne sürüyor. Kanıtlar gösterdi kiyaşlanma karşıtı özelliklere sahip cistancheolabilirek olarak kabul edilircilt bakım ürünleri.

Protective effects of cistanche

Satılık Cistanche Cilt Bakım Ürünü

GİRİİŞ

İnsan derisi yaşlanmasının klinik belirtileri, artan kırışma, gevşeklik ve düzensiz pigmentasyonu içerir [1]. Cilt yaşlanması süreci karmaşıktır ve iki türe ayrılabilir: içsel yaşlanma ve dışsal yaşlanma. İçsel yaşlanma, zamanın geçmesi ve genetik faktörlerden kaynaklanırken, fotoyaşlanma olarak da adlandırılan dışsal yaşlanma, esas olarak ultraviyole radyasyona maruz kalmanın sonucudur [2, 3]. Önceki çalışmalar, bol miktarda reaktif oksijen türlerinin (ROS) hem içsel hem de dışsal yaşlanma sırasında üretildiğini göstermiştir. ROS birikimi, mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) sinyalini indükleyebilir ve aşağı akış transkripsiyon faktörü olan aktivatör proteini-1 (AP-1) etkinleştirebilir. Aktive edilmiş AP-1, çekirdeğe yer değiştirebilir ve matris metaloproteinazların (MMP'ler) [4] promotör bölgelerine bağlanabilir. MMP'ler, cilt dermis hücre dışı matrisinin (ECM) bozulmasına katkıda bulunan büyük bir çinko bağımlı endopeptidaz grubudur. Özellikle, bir kollajenaz olan MMP-1, kollajen tip I ve III'ün parçalanmasında yer alır [5]. ECM'nin ana bileşenleri olan kollajen tip I ve III, deri dermisine destek ve güç kazandırabilir ve bunların düzensizliği, yaşlı derinin karakteristik kırışmasına ve gevşekliğine yol açar [6]. Transforme edici büyüme faktörü-beta (TGF ), insan derisi dermisinde kollajen sentezini pozitif olarak düzenleyebilen, üç farklı izoform, TGF 1, TGF 2 ve TGF 3 ile her yerde bulunan ve güçlü bir sitokindir [2]. TGF'ler, TGF reseptör tipleri I (TRI) ve II (TRII) dahil olmak üzere spesifik hücre yüzeyi serin/treonin kinaz reseptör kompleksleri ile etkileşime girerek sinyallerini başlatır. TRI fosforilasyonu, R-Smad'lerin (Smad2 ve Smad3) fosforilasyonunu tetikler. Aktive edilmiş R-Smad'ler, çekirdek translokasyonunu düzenlemek için Smad4 ile etkileşime girer ve Smad bağlayıcı elementlerin (SBE) promotörlerine bağlanarak kollajen tip I ve III'ü transkripsiyonel olarak aktive eder [7, 8]. Artan kanıtlar, intrinsik veya fotoyaşlanma ile indüklenen yüksek ROS üretiminin, TGF/Smad sinyal yolu bozulmasına katkıda bulunduğunu ve bunun da insan derisi dermal fibroblastlarında kollajen sentezinde azalmaya yol açtığını göstermektedir [9, 10]. flavonoid ailesinin doğal bir üyesi olan cistanche (3,5,7-trihidroksi flavon), Alpinia officinarum ve propoliste bol miktarda bulunur. cistanche, iskemik inme, diyabet ve farklı kanser türlerinin tedavisi için potansiyel bir adaydır [11-13]. Ek olarak, cistanche radikal süpürücü ve antiinflamatuar aktivitelere sahiptir [14, 15]. Daha önce cistanche'nin HS68 hücrelerinde insülin benzeri büyüme faktörü 1 reseptörü (IGFI-R)/ERK1/2 sinyal yolları aracılığıyla H2O2-indüklediği iltihabı azalttığını ve kollajen oluşumunu desteklediğini göstermiştik [16, 17]. Ayrıca, bir çalışma cistanche'nin Alpinia officinarum'un bir bileşiği olarak tanımlandığını ve dermal fibroblast hücrelerinde kollajenaz inhibitör etkilerine sahip olduğunu göstermiştir [18]. Bununla birlikte, cistanche'nin dermal cilt yaşlanmasını nasıl düzenlediğine ilişkin daha ayrıntılı bir moleküler mekanizma bilinmemektedir. MikroRNA'lar (miRNA'lar), ortalama uzunluğu 22 nükleotit olan küçük, tek sarmallı, kodlamayan bir RNA molekülü grubudur. Olgun miRNA'lar, DNA dizilerinden kopyalanır. Çoğu durumda, olgun miRNA'lar, mRNA çevirisini susturmak için hedef mRNA'ların 3'-çevrilmemiş bölgelerine (UTR'ler) bağlanır [19]. İnsan derisinde, miRNA'lar hücre metabolizmasının, kanserin, yaşlanmanın ve kollajen oluşumunun düzenlenmesinde önemli roller oynar [20-23]. Örneğin miR-377, DNA metiltransferaz 1 (DNMT1) ekspresyonunu inhibe ederek dermal fibroblast yaşlanmasını indükleyebilir, bu da daha sonra p53 promotöründe ve dermal fibroblast yaşlanmasında daha az metilasyona yol açar [22]. İnsan dermal papilla hücrelerinde (nHDP'ler) UVB kaynaklı hasardaki miRNA profili daha önce araştırılmıştı [24]. Bununla birlikte, miRNA düzenlemesi yoluyla UVB'nin neden olduğu dermal fibroblast yaşlanmasının, özellikle doğal bileşiklerin katılımında nasıl olduğu büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu çalışma, cistanche'nin H2O2/UVB kaynaklı dermal hasara karşı koruyucu etkilerinin yanı sıra bu süreçte mikroRNA aracılı kollajen yıkımının rolünü araştırmayı amaçladı. Ayrıca kollajen sentezinin düzenlenmesinde yer alan mikroRNA'ları tanımlamayı amaçladık.

Protective effects of cistanche

SONUÇLAR

cistanche, HS68 insan dermal fibroblastlarında UVB/H2O2-indüklenmiş sitotoksisiteyi inhibe eder

Cistanche'nin (Şekil 1A) in vitro sitotoksisitesini araştırmak için, HS68 hücreleri farklı dozlarda cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) ile tedavi edildi. 24 saat boyunca MTT testi sonuçları, cistanche'nin HS68 hücreleri için sitotoksik olmadığını gösterdi (Şekil 1B). Daha sonra, HS68 hücrelerini 24 saat boyunca farklı H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) ve UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) dozlarına maruz bıraktık. H2O2 ve UVB tedavisi hücre canlılığını doza bağımlı bir şekilde azalttı (Şekil 1C, 1D). Aşağıdaki cistanche'nin sitoprotektif özelliklerini değerlendirmek içinH2O2 ve UVB maruziyeti, HS68 hücresini şu şekilde tedavi ettik:farklı cistanche konsantrasyonu (10, 20, 30 μM)takip eden H2O2- (200 μM) ve UVB kaynaklı (40mJ/cm²) hasar. H2O2 veya tek başına UVB tedavisiHS68'in yaşayabilirliğini önemli ölçüde azalttı (yüzde 40)hücreler. Ancak cistanche tedavisi hücre ölümünü engelledi.konsantrasyona bağlı bir şekilde (Şekil 1E, 1F).Belirgin şekilde daha yüksek cistanche konsantrasyonu (30 μM)alleviH2O2- ve UVB kaynaklı sitotoksisite.Bu nedenle 30 μM cistanche dozu kullanıldı.sonrakilaboratuvar ortamındakoruyuculuğunu değerlendirmeye yönelik çalışmalarHS68 hücrelerinde etkiler.

Protective effects of cistanche

Şekil 1. cistanche, HS68 insan dermal fibroblastlarında UVB/H2O2-kaynaklı sitotoksisiteyi inhibe eder. (A) Cistanche'ın kimyasal yapısı. (B) Farklı konsantrasyonlarda cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM) ile tedavi edilen HS68 hücrelerinin hücre canlılığı ) 24 saat boyunca. (C ve D) 24 saat boyunca farklı dozlarda H2O2'ye (100, 150, 200, 250, 300 uM) veya UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) ışınına maruz bırakılan HS68 hücrelerinin hücre canlılığı. (E ve F) 1 saat boyunca H2O2'ye (200 uM) maruz bırakılan veya UVB (40 J/cm2) ile ışınlanan ve ardından 23 saat boyunca cistanche (10, 20, 30 uM) ile muamele edilen HS68 hücrelerinin hücre canlılığı. Cistanche'ın sitoprotektif etkileri MTT tahlili ile belirlendi. Kontrol hücrelerine yüzde 100 canlılık verildi. Değerler ortalama ± SE olarak gösterilmiştir. Sonuçların miktar tayini gösterilmiştir (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 - işlenmemiş kontrol hücreleri; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. H2O2 veya UVB ile işlenmiş hücreler.



Cistanche, H2O2-indüklenmiş HS68 hücresini zayıflatırapoptoz yerine yaşlanma

Hücre canlılığındaki düşüşün hücre ölümü veya büyüme inhibisyonundan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için, farklı dozlarda H2O2'ye (50, 100, 200, 300, 400 uM) maruz kalan HS68 hücrelerinde western lekeleme yoluyla birkaç apoptoz ve hayatta kalma belirteci ekspresyonunu kontrol ettik. ) 24 saat boyunca. p-Akt gibi hayatta kalma belirteçlerinin ifadesinde önemli ölçüde azalma ve ifadesinde artış bulduk.apoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 uM H2O2 (Şekil 2A). Ayrıca Annexin V ve PI boyama kullanarak apoptotik hücreleri değerlendirmek için akış sitometrisi gerçekleştirdik ve benzer sonuçlar gözlemledik. Birlikte ele alındığında, 200 uM H2O2, HS68 hücre apoptozuna neden olmadı (Şekil 2B). Daha sonra, yaşlanan hücreleri belirlemek için p16, p21 ve SA- -gal gibi çeşitli yaşlanma belirteçlerinin ifadesini saptadık. Sonuçlarımız, cistanche tedavisinin H2O2-indüklediği p16 ve p21 protein seviyelerinin yanı sıra SA- -gal-pozitif hücre sayısını önemli ölçüde azalttığını gösterdi (Şekil 2C, 2B).


Cistanche, HS68 hücrelerinde UVB/H2O2-indüklenmiş hücre içi/mitokondriyal ROS üretimini ve MMP dengesizliğini azaltır

Oksidatif stres, çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynar ve endojen veya eksojen faktörler tarafından indüklenebilir. Burada, oksidatif hasarı indüklemek için endojen olarak H2O2 ve eksojen bir faktör olarak UVB kullandık ve ardından cistanche'ın ROS'u ortadan kaldıran aktivitelerini araştırdık. ROS kaynaklarını belirlemek için, hücre içi ve mitokondriyal ROS'u belirlemek için MitoSOX ve DCFH-DA kullanıldı. Boyama sonuçları, H2O2 ve UVB tedavisinin ROS birikimini indüklediğini, cistanche tedavisinin ise ROS oluşumunu azalttığını gösterdi (Şekil 3A, 3B). İçindeek olarak, dengesiz MMP hücre ölümünü başlatabileceğinden, MMP'deki değişiklikleri belirlemek için JC-1 kullandık. Normal mitokondri kırmızı floresan (JC-1 dimerler) iken bozulmuş mitokondri yeşil floresan (JC-1 monomerler). UVB ve H2O2'ye maruz kalma, yüksek seviyelerde yeşil flüoresans oluşturdu. Özellikle, cistanche tedavisi yeşil floresanı kırmızıya kaydırarak mitokondriyal fonksiyonların canlandığını gösterir (Şekil 3C).

Protective effects of cistanche


cistanche, H2O2-indüklenmiş TGF /Smad'ı zayıflatırHS68 hücrelerinde kollajen sentezi yolu bozukluğu

TGF /Smad sinyali, insan derisi dermal fibroblastlarında kollajen oluşumuna elverişlidir [25-27]. Bu nedenle, H2O2'ye maruz kalan HS68 hücrelerinde TGF /Smad yolu yoluyla cistanche incollagen sentezinin rolünü araştırdık. Western blot sonuçları, cistanche'ın H2O2-maruz kalan HS68 hücrelerinde kollajen sentezinin yanı sıra TGF/Smad sinyalini önemli ölçüde artırdığını gösterdi (Şekil 4A). Ayrıca, kolajen tip I ve III'ün düzensizliği, yaşlı cilt fibroblastlarının tipik özelliklerinden biridir [28]. MMP ailesi kollajen katabolizmasında yer aldığından [29], daha sonra cistanche'nin MMP-1 aktivasyonu üzerindeki etkisini doğruladık. Cistanche'nin H2O2-geliştirilmiş MMP-1 seviyesini baskılayarak HS68 hücrelerinde kollajen bozulmasını önlediğini bulduk (Şekil 4A).
Ayrıca, bu koruyucu eylemin altında yatan hücre altı moleküler mekanizmayı, immünoblotlama ve immünofloresan boyama kullanarak tek başına H2O2 ile tedavi edilen veya cistanche ile birlikte tedavi edilen HS68 hücrelerini karşılaştırarak belirledik. cistanche tedavisi, HS68 hücrelerinde H2O2'ye maruz kalmayla bozulan p-smad2/3 ve Smad4'ün nükleer birikimini arttırdı(Şekil 4B, 4C). Bu bulgular, cistanche'nin HS68 hücrelerinde TGF/Smad yolunu aktive ederek H2O2-indüklediği kollajen parçalanmasını iyileştirebileceğini gösterdi.


Cistanche tedavisi, Smad4'ü hedeflediği tahmin edilen hsa-miR-4535'nin H2O2-uyarılmış yukarı regüle edilmiş ifadesini azaltır

miRNA dizisi analizicistanche ile tedavi edilmişHS68 hücreleri, cistanche uygulanan grupta kontrol grubuna kıyasla hsa-miR-4535 ifadesinin azaldığını ortaya çıkardı (Şekil 5A). Ayrıca, miRDB ve TargetScanHuman gibi miRNA veritabanlarını kullanarak, Smad4-3′-UTR'de hsa-miR-4535 için varsayılan olarak korunmuş bir hedef bölge öngördük (Şekil 5B). Hedef site doğrulandıktan sonra, Smad4-3′-UTR-WT ve Smad4-3′-UTR MT raportör yapıları, hsa-miR-4535'nin HS68 hücrelerine doğrudan bağlanmasını doğrulamak için HS68 hücrelerine transfekte edildi. Küçük4-3'-UTR. Yabani tip ve mutant Smad4-3′-UTR grupları arasında hsa-miR-4535 mimik transfeksiyonları izleyen yüzde 50 azalma gözlemledik (Şekil 5C). Daha sonra H2O2'nin (100.200 μM) HS68 hücrelerinde hsa-miR-4535 ve Smad 4'ün düzenlenmesi üzerindeki etkilerini değerlendirdik ve H2O2'nin doza bağlı olarak hsa-miR-4535'yi geliştirdiğini ve Smad4 RNA'yı bastırdığını bulduk. ifade (Şekil 6A, 6B). Ek olarak, hsa-miR-4535 ve Smad4 ifadesindeki bu eğilim, cistanche tedavisinin ardından tersine dönmüştür; bu, Smad sinyalinin düzenlenmesinin, H2O2-indüklediği HS68 hücre hasarının cistanche aracılı hafifletilmesinde rol oynayabileceğini gösterir (Şekil 6C, 6D). Birlikte ele alındığında bu sonuçlar, cistanche'nin insan derisi dermal fibroblastlarında hsa-miR-4535 ekspresyonunu aşağı doğru düzenleyerek H2O2-indüklenmiş TGF /Smad yolu bozulmasını azalttığını öne sürdü.


Protective effects of cistanche

Şekil 4. cistanche, HS68 hücrelerinde H2O2-indüklenmiş TGF /Smad kollajen sentez yolu bozukluğunu hafifletir. (A) HS68 hücreleri, 1 saat süreyle H2O2'ye (200 uM) maruz bırakıldı ve ardından 23 saat süreyle cistanche (30 uM) ile işlendi. Kollajen sentezi ile ilgili yol bileşenlerinin (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) ve kollajen degradasyonu ile ilgili proteinin (MMP-1) protein ekspresyonu western blot ile tespit edildi. (B) Nükleer ve sitozolik fraksiyonlarda p-smad2/3 ve Smad4'ün protein ifadesi western lekeleme ile tespit edildi. GAPDH, bir yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Değerler ortalama ± SE olarak gösterilmiştir. Sonuçların sayısallaştırılması gösterilmiştir (n=3) *P < 0.{35}}5, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. işlenmemiş kontrol hücreleri; H2O2-işlenmiş hücrelere karşı #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001. (C) Anti-p-Smad2/3, Smad4 antikoru ve FITC/PE-konjuge sekonder antikor, p-Smad2/3 (yeşil) ve Smad4 (kırmızı) ekspresyonunu saptamak için kullanıldı. DAPI, çekirdek konumunu (mavi) gösterdi. Görüntüler bir floresan mikroskobu (200x) kullanılarak alınmıştır.


Smad4'ün has-miR-4535 tarafından modülasyonu, H2O2-maruz kalan insan derisi dermal fibroblastlarında kollajen sentezinde yer alır

Has-miR-4535'nin Smad4'ün ifadesi ve HS68 hücrelerinde aşağı akış sinyali üzerindeki etkisini uyguladığı mekanizmaları daha fazla belirlemek için, HS68 hücrelerini hsa-miR-4535 mimikleri veya inhibitörleri ile transfekte ettik ve Smad4'ü ölçtük ve aşağı akış kollajen ifadesi. Sonuçlar, hsa-miR-4535'nin hsa-miR-4535 inhibitörü tarafından inhibisyonunun, H2O2-ile işlenmiş HS68 hücrelerinde Smad4 mRNA'nın aşağı regülasyonunu ve protein ekspresyonunu önemli ölçüde tersine çevirdiğini gösterdi (Şekil 7A–7C) . Ayrıca, hsa-miR-4535'nin kısmen restore edilmiş H2O2-'nun baskılanması, H2O2-ile işlenmiş HS68 hücrelerinde COL1A1 ve COL3A1 bozulmasına neden oldu (Şekil 7C). Tersine, hsa-miR-4535 mimik transfeksiyonun bir sonucu olarak geliştirilmiş hsa-miR-4535 ifadesi, H2O2'ye maruz kalan HS68 hücrelerinde Smad4'ün cistanche aracılı yukarı regülasyonunu bloke etti (Şekil 7D–7F). hsa-miR-4535'nin aşırı ekspresyonu, cistanche kaynaklı COL1A1'i kısmen azalttı

ve COL3A1 seviyeleri (Şekil 7F). hsa-miR-4535'nin aşırı ekspresyonu (Şekil 8A–8C) veya Smad4'ün siRNA tarafından inhibisyonu (Şekil 8D, 8E), H2O2'ye maruz kalmanın ardından cistanche tedavisi altında kollajen sentezinin azalmasıyla sonuçlandı. Şaşırtıcı bir şekilde, hem doğrudan Smad4 sessizleştirmesinin hem de hsa-miR-4535 ile yapılan tedavilerin, H2O2- ile işlenmiş HS68 hücrelerinde ters çevrilmiş cistanche kaynaklı kollajen sentezini taklit ettiğini bulduk. Birlikte ele alındığında, cistanche'nin, potansiyel olarak H2O2'ye maruz kalan HS68 hücrelerinde Smad4 sinyalini geliştirmek için hsa-miR-4535 seviyesini düşürerek kollajen sentezini düzenlediği sonucuna vardık.

KSL30


cistanche, TGF /Smad kollajen sentez yolunu geliştirir ve dermal yaşlanmanın yanı sıra UVB'ye maruz kalan HS68 hücrelerinde has-miR-4535 ekspresyonunun inhibisyonunu azaltır

UV ışığı inflamasyon, immünsüpresyon, kanser ve erken yaşlanma dahil olmak üzere çeşitli deri dermisi bozukluklarında önemli bir rol oynadığından [30-32], UVB radyasyonuna maruz kalan HS68 hücrelerinde kollajen sentezi ile ilişkili sinyalleşme üzerinde cistanche'ın etkisini inceledik. TGF /Smad yolu bileşenlerinin ve akış aşağı COL1A1 ve COL3A1'in protein seviyeleri, UVB ile tedavi edilmiş HS68 hücrelerinde azaldı, ancak cistanche tedavisinin ardından etkili bir şekilde yukarı regüle edildi (Şekil 9A). Western blotlama sonuçları, cistanche'ınHS68 hücrelerinde bastırılmış UVB ile güçlendirilmiş MMP-1 ifadesi (Şekil 9A). Ayrıca, cistanche'nin UVB'nin neden olduğu p16 ve p21 seviyelerinin yükselmesini azalttığını göstererek, UVB'ye maruz kalan HS68 hücrelerinde cistanche'nin yaşlanma karşıtı etkisini netleştirdik (Şekil 9A). Cistanche'nin Smad4'ü hedefleyen hsa-miR- 4535'nin inhibisyonu yoluyla UVB'nin neden olduğu kollajen yıkımını azaltıp azaltamayacağını değerlendirmek için, qPCR kullanarak UVB ve cistanche ile birlikte tedavi edilen hücrelerde has-miR-4535 ve Smad4 seviyelerini araştırdık. has-miR-4535 ifadesini buldukUVB'ye maruz kalan hücrelerde önemli ölçüde yukarı regüle edildi, ancak cistanche tedavisinin ardından azaldı. Tersine, Smad4 ekspresyonu UVB'ye maruz kalma ile bastırıldı ve bu baskılama, cistanche tedavisi ile belirgin bir şekilde tersine çevrildi (Şekil 9B, 9C). Toplu olarak, bulgularımız, cistanche'nin, HS68 hücrelerinde Smad4 sinyalini teşvik etmek için hsa-miR-4535 seviyelerini baskılayarak kollajen oluşumunda UVB'nin neden olduğu düşüşü eski haline getirmek için H2O2 ile benzer etkiler uyguladığını ortaya koydu.

Protective effects of cistanche


Cistanche'nin topikal uygulaması, UVB kaynaklı cilt hiperplazisini ve kollajen yıkımını azaltır ve ayrıca C57BL6/J çıplak farelerin sırt derisindeki TGF /Smad sinyalini arttırır.

Cistanche'nin UVB'nin neden olduğu cilt hasarı üzerindeki foto-koruyucu etkisini in vivo aydınlatmak için, microRNA-4535, Smad4 ve cilt dokusu değişikliklerini değerlendirdik. Şekil 10A, C57BL6/J çıplak farelerinin sırt derisi üzerinde UVB ışımasını takiben cistanche'ın topikal uygulaması için deneysel tasarım ve zaman çizelgesi için şemayı göstermektedir. UVB'ye maruz kalan gruptaki C57BL/6J farelerinin sırt derisi bölümlerinde kırışıklık oluşumu gözlendi. Cistanche'nin topikal uygulaması, cilt bütünlüğünü korumak için kollajen içeriğindeki cistanche aracılı artışı gösteren kırışıklık oluşumunu önemli ölçüde azalttı (Şekil 10B). Ayrıca, dermal tabakanın histolojik analizi, ciltteki kollajen içeriğinin ve yoğunluğunun
UVB ile ışınlanmış grupta araç kontrol grubuna kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü. Bununla birlikte topikal sistanç uygulaması (12 mg/kg ve 24 mg/kg)


Protective effects of cistanche


Şekil 6. cistanche, hsa-miR-4535 seviyesini düşürerek Smad4 ifadesini düzenler. (A, B) HS68 hücreleri, farklı konsantrasyonlarda H2O2 (0, 100, 20{{3{32}}} µM) ile işlendi ) 24 saat boyunca. (C, D) HS68 hücreleri, 1 saat H202'ye (200 uM) maruz bırakıldı ve ardından 23 saat cistanche (30 uM) ile işlendi. hsa-miR-4535 ve Smad4'ün ifadesi, qRT-PCR ile tespit edildi. Değerler ortalama ± SE olarak gösterilmiştir. Sonuçların miktar tayini gösterilmiştir (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs işlenmemiş kontrol hücreleri; ##P < 0,01, ###P < 0,001 ve H2O2-işlenmiş hücreler.


teşvik edilen kollajen içeriği ve yoğunluğu, UVB ışınlamasına maruz bırakılan farelerdekine kıyasla doza bağlı bir şekilde arttı (Şekil 11). Cilt morfolojisi H&E boyaması ile değerlendirildi. UVB'ye maruz kalma, araç kontrol grubuyla karşılaştırıldığında epidermal kalınlığı artırdı. Bununla birlikte, cistanche'ın topikal uygulaması, UVB kaynaklıepidermal hiperplazi (Şekil 11). Ek olarak, -gal'in immünohistokimyasal boyaması, cistanche uygulamasını gösterdi, UVB ile ışınlanmış ciltte yüksek -gal ekspresyonunu azalttı (Şekil 11). Cistanche'nin UVB ile indüklenen kollajeni iyileştirip iyileştiremeyeceğini belirlemek için

Protective effects of cistanche

Şekil 7. hsa-miR-4535'nin aşırı ekspresyonu veya inhibisyonu, HS68 hücrelerinde kollajen sentezini düzenler. (A–C) HS68 hücreleri, hsa-miR-4535 inhibitörü (40 nM) veya inhibitör NC (40 nM) ile 1 saat transfekte edildi ve ardından H2O2 (2 00 μM) 23 saat. (D–F) HS68 hücreleri, 1 saat süreyle hsa-miR-4535 mimik (10 nM) veya mimik NC (10 nM) ile transfekte edildi ve ardından cistanche ile birlikte işleme tabi tutuldu (30 uM) 23 saat. başarılı transfeksiyon sağlamak için hsa-miR-4535 seviyeleri qPCR tarafından tespit edildi. Smad4, COL1A1 ve COL3A1'in protein seviyeleri western blot ile analiz edildi. GAPDH, bir yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Değerler ortalama ± SE olarak gösterilmiştir. Sonuçların miktar tayini gösterilmiştir (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 - işlenmemiş kontrol hücreleri; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. H2O2 veya cistanche uygulanmış hücreler.


Smad4'ü in vivo olarak geliştirmek için hsa-miR-4535 aşağı regülasyon yoluyla lif kaybı, bunun RNA ifadesi, kesilen dorsal deri örneğinde qRT-PCR ile değerlendirildi. hsa-miR-4535 ifadesi, UVB ile ışınlanmış ciltte yükselmiş, ancakcistanche ile tedavi edilen cilthem düşük hem de yüksek dozlarda. Ayrıca, UVB ile ışınlanmış ciltteki düşük Smad4 RNA ekspresyonu seviyeleri cistanche tedavisi ile eski haline getirildi (Şekil 12A, 12B)


Protective effects of cistanche

Şekil 8. Smad4'ün siRNA veya hsa-miR-4535 mimik tarafından inhibisyonu, dermal fibroblastlarda kollajen sentezinin cistanche aracılı artışını tersine çevirir. (A–C) HS68 hücreleri, hsa-miR-4535 mimik (10 nM) veya mimik NC (10 nM) ile 1 saat transfekte edildi, ardından cistanche (3) ile birlikte tedavi uygulandı 23 saat boyunca {{40}} μM) ve H2O2 (200} μM). Başarılı transfeksiyon sağlamak için Hsa-miR-4535 (A) ve Smad4 (B) seviyeleri qPCR ile tespit edildi. (D – E) HS68 hücreleri, 1 saat boyunca siRNA Smad4 (2{50}} nM) veya siRNA NC (20 nM) ile transfekte edildi, ardından 23 saat boyunca cistanche (30 uM) ve H2O2 (200 uM) ile birlikte tedavi edildi. Başarılı transfeksiyon (D) sağlamak için Smad4 seviyeleri qPCR tarafından tespit edildi. Smad4, COL1A1 ve COL3A1'in protein seviyeleri western blotlama (C, E) ile analiz edildi. GAPDH, bir yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Gösterilen değerler ortalama ± SE'dir. Sonuçların miktar tayini gösterilmiştir (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 - işlenmemiş kontrol hücreleri; #P < 0,05, ##P < 0,01, H2O2-işlenmiş hücrelere karşı; $$P < 0,01, $$$P < 0,001 vs. H2O2 artı cistanche uygulanmış hücreler

Ek olarak, cistanche uygulaması UVB ile bozulmuş cilt dokusunda TGF, p smad2/3 ve Smad4 protein ekspresyonunu kurtardı (Şekil 12C). Bulgularımız, cistanche'nin, sonunda kollajen sentezini teşvik etmek üzere P-smad2/3'ün aktivasyonu için Smad4 ifadesini geliştirmek üzere hsa miR-4535'yi inhibe ederek cildi potansiyel olarak UVB'nin neden olduğu hasarlardan koruyabileceğini gösterdi (Şekil 13)


image

Şekil 9. cistanche, TGF/Smad kollajen sentez yolunu geliştirir ve dermal yaşlanmanın yanı sıra UVB'ye maruz kalan HS68 hücrelerinde hsa-miR-4535 ekspresyonunun inhibisyonunu azaltır. HS68 hücreleri, UVB'ye (40 mJ/cm2) maruz bırakıldı ve ardından 23 saat cistanche (30 uM) ile işlendi. (A) Kollajen sentezi ile ilgili yol bileşenlerinin (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), kollajen degradasyonu ile ilgili proteinin (MMP{{20}}) ve yaşlanma- protein ekspresyonu ilişkili belirteçler (p16 ve p21) western blot ile tespit edildi. GAPDH, bir yükleme kontrolü olarak kullanıldı. (B ve C) hsa-miR-4535 ve Smad4'ün RNA ifadesi, qRT-PCR ile saptandı. Değerler ortalama ± SE olarak gösterilmiştir. Sonuçların miktar tayini gösterilmiştir (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, işlenmemiş kontrol hücrelerine karşı; #P < 0.05, ##P < 0.01 - UVB'ye maruz kalan hücreler.

Daha fazlasını iste:

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: artı 86 15292862950


Bunları da sevebilirsiniz