Multipleks Tiramid Sinyal Amplifikasyonu ve Derin Öğrenme Kullanılarak Böbrek Nakli Biyopsilerinde İnflamatuar Sızıntıların Nicel Değerlendirilmesi

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Brasen²ve diğerleri

Soyut

Gecikmiş greft fonksiyonu (DGF), böbrek transplantasyonlarında interstisyel fibrozis ve tübüler atrofi (IFTA) gelişimi için güçlü bir risk faktörüdür. DGF hastalarının böbrek biyopsilerindeki inflamatuar infiltratların nicel değerlendirmesi, IFTA gelişimi için öngörücü belirteçleri ortaya çıkarabilir. Bu çalışmada, transplantasyondan 6 hafta sonra alınan DGF hastalarının (n=22) böbrek biyopsilerindeki inflamatuar mikro ortamı değerlendirmek için multipleks tiramid sinyal amplifikasyonunu (mTSA) ve konvolüsyonel sinir ağlarını (CNN'ler) birleştirdik. Hastalar IFTA gelişimi için sınıflandırıldı (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche Deserticola böbrek hastalığını önler, numuneyi almak için buraya tıklayın

giriiş

Böbrek transplantasyonundan sonra gecikmiş greft fonksiyonu (DGF) çok faktörlüdür ve esas olarak donör özellikleri ve iskemi süresi ile ilgilidir. DGF genellikle transplantasyondan sonraki 7 gün içinde diyaliz ihtiyacı olarak tanımlanır ve kronik böbrek greft hasarı için güçlü bir risk faktörüdür [1-3]. Kronik böbrek hasarının klasik bir bileşeni, interstisyel fibrozis ve tübüler atrofinin (IFTA) varlığıdır. Bununla birlikte, tüm DGF hastaları IFTA gelişimine ilerlemez ve DGF ile IFTA arasındaki karmaşık ilişki hala tam olarak anlaşılmamıştır. Bu, ilk olarak, potansiyel olarak nedensel olaylar ile fonksiyonel düşüş arasındaki gecikme süresinden ve ikinci olarak, ilacın reddi ve yan etkileri gibi potansiyel indükleyicilerin değişken ve karmaşık etkileri nedeniyledir [1, 4]. Enflamasyonun genel varlığı ve spesifik makrofajlar, çok sayıda çalışmada greft kaybının bir göstergesi olarak tanımlanmıştır [5-8]. Bununla birlikte, altta yatan patolojik süreçler tam olarak anlaşılamamıştır ve yüksek düzeyde iltihaplanma her zaman uzun vadeli greft kaybına yol açmaz. Çevresel uyaranların bir sonucu olarak, makrofajlar özel işlevler kazanır ve farklı fenotiplere polarize olur. Çok sayıda çalışma, belirli makrofaj alt tiplerinin (alternatif olarak aktive edilmiş makrofajlar) doku onarımını veya fibrozu indükleyerek doku yeniden şekillenmesinde rol oynadığını göstermektedir. Bir doku yeniden şekillenmesi (bazen pro-fibrotik) fenotipine doğru polarizasyonun, diğerlerinin yanı sıra T yardımcı lenfosit alt tipleri tarafından sağlanan çok çeşitli çevresel uyaranlara bağlı olduğu bilinmektedir [9-11]. DGF zamanında greftteki T yardımcı hücre popülasyonlarının değerlendirilmesi, yaygın bir T yardımcı 1 alt tipini ortaya çıkardı, ancak greft sonucu veya IFTA'ya ilerleme ile korelasyonlar şimdiye kadar araştırılmadı [12]. Dikkatle seçilmiş hasta kohortlarında özellikle makrofajlar ve T yardımcı hücre alt kümelerine odaklanan inflamatuar mikro ortamın kapsamlı bir değerlendirmesi, DGF hastalarının bazılarının, ancak hepsinin IFTA gelişimine neden ilerlemediği konusunda fikir verebilir.

Bununla birlikte, inflamatuar infiltratların kapsamlı bir araştırması, çeşitli (teknik) sınırlamalar nedeniyle engellenmektedir. Geleneksel immünohistokimya (IHC) ve immünofloresan teknikleri, bir doku bölümünde yalnızca sınırlı sayıda hücre markörünün görselleştirilmesini destekler. Böbrek biyopsileri gibi küçük, değerli doku parçalarının seri olarak kesilmesi istenmez ve farklı kesitlerdeki hücreler arasındaki ilişkilerin yorumlanması zordur. Ek olarak, görsel tahmin ile inflamatuar sızıntıların nicel değerlendirmesi, önemli düzeyde gözlemciler arası değişkenlik ile birlikte gelir [13]. Piksel eşikleme, havza ve morfolojiye dayalı bölütleme gibi geleneksel görüntü işleme teknikleri, bir veri seti boyunca tüm morfolojik hücre temsilleri ve doku lekesi yoğunluğu hakkında önceden bilgi sahibi olunmasına dayanır [14-16]. Bu nedenle, bu yöntemler genellikle biyolojik ve teknik görüntü varyasyonları için sağlamlıktan yoksundur ve yeni veya harici veri kümelerine yetersiz şekilde çevrilir. Dijital patolojinin yükselişi, tam slayt görüntülerinin (WSI) değerlendirilmesi için alternatif yöntemlerin geliştirilmesini hızlandırdı [17, 18]. Derin öğrenme modelleri, özellikle evrişimli sinir ağları (CNN'ler), histopatolojik slaytlarda ilgili biyolojik yapıları segmentlere ayırma ve tespit etme yeteneğine sahip olduğunu kanıtlamıştır [19-23]. Bu teknikler, öznel görsel tahminden ve geleneksel görüntü işlemeden doğru, nesnel ve tekrarlanabilir hücre algılamaya geçme potansiyeline sahiptir.

Bu çalışmanın amacı, çoklu inflamatuar hücre belirteçlerinin objektif, nicel değerlendirmesi için kapsamlı seri slayt kesit ihtiyacını ortadan kaldıran bir yöntem geliştirmektir. Bunu yapmak için multipleks IHC, multispektral görüntüleme ve derin öğrenme modellerini birleştiriyoruz. Bu tekniklerin uygulanabilirliğini göstermek için, DGF hastalarının sürveyans greft biyopsilerinde IFTA'nın gelişimi ile derin öğrenme modelleriyle ölçülen inflamatuar mikro-ortamın korelasyonlarını inceliyoruz.

böbrek hastalıklarını tedavi eden cistanche özü

Malzemeler ve yöntemler

DGF hastalarının böbrek biyopsilerindeki inflamatuar mikro-ortamı değerlendirmek için, transplantasyondan 6 hafta sonra alınan sürveyans biyopsilerinde multipleks IHC uyguladık. Hastalar IFTA gelişimi için sınıflandırıldı (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Doku örnekleri

Prospektif bir sürveyans biyopsi programı bağlamında elde edilen, Hannover Tıp Okulu'ndaki (Hannover, Almanya) böbrek nakli alıcılarından alınan sürveyans biyopsilerini kullandık. Dahil etme kriterleri şunlardı: DGF oluşumu (olarak tanımlanır:<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

IFTA değerlendirmesi

6 hafta ve 6 ayda, Banff lezyon derecelendirme sistemi [24] kullanılarak ifade edilen interstisyel fibrozis (ci) ve tübüler atrofinin (ct) (IFTA) kapsamı patoloji raporundan elde edilmiştir. Erken inflamatuar infiltratlar ile IFTA gelişimi arasındaki ilişkiyi daha ayrıntılı olarak değerlendirmek için, PAS ile boyanmış tüm slaytlar yeniden inceleme için Pannoramic 250 Flash II dijital slayt tarayıcı (3DHistech, Macaristan) kullanılarak dijitalleştirildi. × 0,24 μm/ piksel çözünürlükte objektif. Her iki zaman noktasının (6 hafta ve 6 ay) PAS WSI'si, üç böbrek patologu tarafından IFTA'nın (yüzey alanı yüzdesi, yüzde 10 aralıklarla) kapsamı için puanlandı. Patologların ortalama IFTA skorları, transplantasyon sonrası 6 hafta ile 6 ay arasında IFTA'daki değişimi hesaplamak için nihai skor olarak kullanıldı. Hastalar, IFTA skorundaki mutlak artış yüzde 10 veya daha fazla (n=13) ve hayır veya<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Ayrıca, Wilcoxon işaretli sıra testi kullanılarak Banff lezyon skorları zaman noktaları arasında karşılaştırıldı. Bu, Banff kategorileri ti (p=0.017), ci (p=0.004) ve ct (p=0.011) için 6 hafta ve 6 aylık biyopsiler arasında önemli farklılıkları ortaya çıkardı. .

Multipleks TSA boyama

6 haftalık biyopsilerde çoklu hücre belirteçlerini görselleştirmek için mTSA kullanarak multipleks IHC gerçekleştirdik. Birincil ve ikincil antikor ile inkübasyondan sonra doku, floresan olarak işaretlenmiş tiramid ile muamele edildi. İkincil antikordan gelen yaban turpu peroksidazı, aktif tiramid radikallerinin oluşumunu katalize eder. Tiramid radikalleri, antijen üzerindeki tirozin kalıntılarına kovalent olarak bağlanır. Bu kalıcı bağlanma, floresan tiramid birikimini korurken, birincil-ikincil antikor kompleksinin ısıyla indüklenen çıkarılmasına izin verdi [25]. Bu, hedef antijenlere karşı aynı türden başka antikorlarla müteakip ardışık inkübasyonu mümkün kıldı.

mTSA, 6 haftalık sürveyans biyopsilerinden iki ardışık slayt üzerinde gerçekleştirildi. Hasta gruplarımızda inflamatuar infiltrat ve peritübüler kapiller yayılımı değerlendirmek için iki mTSA paneli geliştirdik. Panel I, anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 ve CD34 antikorlarından oluşuyordu. Panel II, anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 ve CD163 antikorları kullanılarak T-yardımcı hücre ve makrofaj polarizasyonunu araştırmak için kullanıldı. Antikor spesifikasyonları, seyreltmeler ve boyama sıraları Ek Tablo 1'de listelenmiştir. Tüm slaytlar ksilen içinde deparafinize edildi, yüzde 95 etanol içinde dehidre edildi, musluk suyunda yıkandı ve epitop alımı için 10x seyreltilmiş trisborat-EDTA (TBE 10x) içinde kaynatıldı. , 0658, VWR Life Sciences, ABD) arabelleği. Soğutulduktan sonra, lamlar endojen peroksidaz blokajı için yüzde 3 hidrojen peroksidaz solüsyonunda yıkandı ve yüzde 0.05 Tween 20 (822184, Merck KGaA, Almanya) (TBS-T) içeren tris-tamponlu tuzlu su tamponu ile yıkandı. Protein blokajı, yüzde 1 bovin serum albümini (BSA) ile TBS-T kullanılarak yapıldı (mTSA adım 1). Birincil antikorlar, 1 saat boyunca oda sıcaklığında veya gece boyunca dört santigrat derecede (mTSA adım 2) inkübe edildi. TBS-T'de yıkandıktan sonra, slaytlar bir HRP-konjuge sekonder antikor (Poli-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Hollanda) ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi (mTSA adım 3). Daha sonra, bir Opal 7-renkli Manuel IHC Kitinden (NEL811001KT, Akoya Biosciences, ABD) (mTSA adım 4) Opal TSA floroforları kullanılarak TSA yapıldı (floroforlar ve bunlara karşılık gelen antikorlar Ek Tablo 1'de listelenmiştir). Antikor-TSA kompleksi, TBE tamponu içinde bir kaynama döngüsü ile çıkarıldı (mTSA aşaması 5). mTSA adımları 1-5, slaytlar ilgili paneldeki tüm antikorlarla boyanıncaya kadar tekrarlandı. Slaytlar DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, ABD) ile fluoromount-G ile kaplandı.

bitki özsuyu

Multipleks TSA doğrulaması

Tekrarlanan kaynatma döngüleri, hedef epitop afinitesini etkileyebilir. Bazı antikorlar, doku birden çok kez kaynatıldıktan sonra daha zayıf bir boyama modeli gösterir, diğer antikorlar, optimum boyama yoğunluğuna ulaşmak için daha fazla kaynama döngüsüne ihtiyaç duyar ve diğerleri hiç etkilenmez. Bu etkiyi, FFPE kontrol bademcik dokusu üzerinde kromojenik IHC kullanan tüm antikorlar için değerlendirdik. Test edilen her antikor (n=9) için altı bölüm kesildi (4 um kalınlığında). Tüm slaytlar ksilen içinde parafinden arındırıldı, yüzde 95 etanol içinde dehidre edildi, musluk suyunda yıkandı ve epitop alımı için 10x seyreltilmiş TBE'de (kaynama döngüsü bir) kaynatıldı. Soğutulduktan sonra, test edilen antikor başına bir slayt fosfat tamponlu salin (PBS) içinde saklandı. Kalan slaytlar tekrar kaynatıldı. Bu döngü beş kez tekrarlandı. Tüm slaytlar daha sonra yüzde 3 hidrojen peroksidaz solüsyonunda yıkandı ve ardından PBS'de durulandı. Birincil antikorlar (Ek Tablo 1) oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırıldı. İnkübasyondan sonra lamlar PBS ile yıkandı. Anti-CD68, Tibet ve GATA3 antikorları ile boyanmış slaytlar, 15 dakika boyunca antikor sonrası bloklama (PAB) ile ek bir inkübasyon gerektirmiştir (VWRKDPVB bloklama, Immunologic, Hollanda). İnkübasyondan sonra, slaytlar PBS içinde yıkandı ve bir HRP-konjuge sekonder antikor ile inkübe edildi (diğerleri için PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Hollanda'dan sonra, ikincil antikor Ek Tablo 1'e bakınız). Görselleştirme 3,3′-diaminobenzidin (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Hollanda) kullanılarak yapıldı. Sonuçlar Ek Şekil 1'de görselleştirilmiştir. Bu sonuçlara dayanarak, Ek Tablo 1'de listelendiği gibi mTSA deneyleri için optimal antikor sırasını belirledik.

İlgilenilen epitoplar aynı yerde bulunursa, tiramid birikintileri birbiriyle etkileşebilir. Bu sterik inhibisyonu test etmek için bademcik kontrol doku slaytlarını kullandık ve bunları mTSA panellerimizle boyadık. mTSA'daki antikor ifadesi, aynı sayıda kaynama döngüsünden geçen tek lekeli slaytlardakiyle karşılaştırıldı. Tek ve multipleks lekeli slaytlar arasında boyama modellerinde farklılıklar gözlemlemedik (panel I'den alınan örnekler, Ek Şekil 2 ve 3). mTSA'daki tüm birincil antikorlar, kromojenik IHC için kullanılanla aynı dilüsyonda kullanıldı. Floresan sinyalinin yoğunluğu, TSA solüsyon seyreltmelerini ayarlayarak optimize edildi.

Multipleks TSA görüntüleme

Multispektral görüntüleme, piksel başına 0.49 μm çözünürlükte 20x objektifli bir Vectra Polaris Görüntüleme Sistemi (CLS143455, Akoya Biosciences, ABD) ve DAPI, FITC, CY3, Texas Red ve Cy5 spektral küpler. Vectra sistemi, daha sonra sistem tarafından karolara bölünen multispektral alım için bölgelerin manuel olarak seçilmesine izin verir (Şekil 1.1). Oto-floresan spektrumları ve tüm Opal TSA floroforları, Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6 kullanılarak bir spektral "kütüphanede" önceden kaydedilmiştir. (Akoya Biosciences, ABD). Spektral kitaplık, mültipleks karonun, her bir floroforun ("karışmayan") katkısını temsil eden birden çok tek karoya ayrıştırılmasını sağladı. Bu, her kanalın tek bir florofora ve dolayısıyla antikora karşılık geldiği monokrom, çok kanallı karolarla sonuçlandı (Şekil 1.2).

Yapay parlak alan IHC'ye dönüştürme

Saklanan koordinatlara dayalı olarak karolar, özel bir python betiği kullanılarak çok kanallı bir WSI oluşturmak için dikildi (Şekil 1.3). DAPI sinyalini (IDAPI) temsil eden kanallar ve antikorlardan birini (IIHC) temsil eden kanallar sırasıyla yapay hematoksilen ve DAB boyamaya dönüştürüldü (Şekil 1.4 ve 1.5). Bilinen kromatik hematoksilen ve DAB Cx, ton-doygunluk-yoğunluk (HSD) dönüşümünden sonra Cy koordinatlarına dayanarak, önceki çalışmalarda leke vektörleri elde edilmiştir [26, 27]. Bu leke vektörleri, yapay parlak alan IHC (Şekil 1.5) için kırmızı-yeşil-mavi değerlerini şu şekilde hesaplamak için kullanıldı:

CR ile, st tayfın kırmızı kısmındaki boyanın ışık emilimi st. B ve G değerleri benzer şekilde hesaplandı.

Görüntü analizi

İlgi alanları (ROI'ler)

Otomatik slayt analiz platformu yazılımı (ASAP; sürüm 1.9, GitHub'da açık kaynaklı yazılım olarak mevcut) kullanılarak kohorttaki her vaka için ilgi bölgeleri (ROI'ler) açıklandı. Bu ROI'ler kortikal tubulointerstitiumdan oluşur, dolayısıyla kapsül, glomerül ve arterler hariçtir. Renal subkapsüler bölgelerdeki inflamasyon transplant patolojisinde nonspesifik olarak kabul edildiğinden, bu çalışmadaki biyopsiler öncelikle subkapsüler bölge (kapsülün 400 µm altı olarak tanımlanır) hariç tutularak analiz edilmiştir. İkincil olarak subkapsüler bölgeyi de içeren analizleri tekrarladık. ROI'lerin görsel örnekleri Ek Şekil 4'e dahil edilmiştir.

Lenfosit tespiti CNN I

CD3, CD4, CD8 ve CD20 boyamasını temsil eden yapay parlak alan IHC görüntüleri, U-Net mimarisine sahip mevcut bir CNN kullanılarak analiz edildi [22, 28]. Bu ağ, IHC'de sitoplazmik lenfosit belirteçlerinin saptanması için özel olarak tasarlanmıştır. CNN performansı kesinlik, hatırlama ve F1- puanı ile ifade edilebilir, burada:

CNN, test setinde {{0}}}.76 kesinlik, 0.79 geri çağırma ve 0.78 F1-puan elde etti. geleneksel IHC WSI'dan oluşan orijinal makalede kullanılmıştır. Bireysel pozitif hücrelerin tespiti, CNN çıktısının eşiklenmesini ve ardından son işlemeyi gerektirir. mTSA panelindeki CD3 boyaması, CD4, CD8 ve CD20 ile karşılaştırıldığında daha güçlü olduğundan, son üç (0.4) için daha düşük bir nesne algılama eşiği ve CD3 için orijinal nesne algılama eşiği (0.7) kullanıldı. Bu çalışmada yapay parlak alan IHC WSI'lerinde CNN performansını değerlendirmek için, bu çalışmada test seti olarak dört yapay parlak alan IHC WSI (iki hastadan CD8 ve CD20) kullanıldı. Nokta açıklamaları (n=1115) ASAP yazılımı kullanılarak oluşturulmuştur. Ağ uygulandıktan sonra, CNN performansını değerlendirmek için kesinlik, geri çağırma ve F1- puanı hesaplandı. Tespitler, kesin bilgi notundan 4 µm (ortalama lenfosit çapı) içinde bulunursa gerçek pozitif olarak kabul edildi. 4 µm aralığında iki algılama bulunduğunda, yalnızca ek açıklamaya en yakın olan algılama gerçek pozitif olarak kabul edildi. Daha sonra, sitoplazmik lenfosit belirteçlerini (CD3, CD4, CD8 ve CD20) temsil eden tüm yapay parlak alan IHC WSI'nin analizi için lenfosit saptama CNN I kullanıldı.

Lenfosit tespiti CNN II

DAPI ve CD4'ü temsil eden nükleer boyama modelleriyle (T-bet ve GATA3 tarafından sunulan) yapay parlak alan IHC WSI'nin analizi, bir WSI'da birleştirilmek üzere seçildi (4). Önceki çalışmalarda elde edilen leke vektörleri, DAPI sinyalini mavi (hematoksilin) ​​ve CD4 sinyalini kahverengi (DAB) yapay olarak renklendirmek için kullanıldı, bu da yapay bir parlak alan IHC WSI (5) ile sonuçlandı.

yeni bir CNN için gerekli eğitim, doğrulama ve test. Bu amaçla böbrek, tonsil ve apendiks FFPE kontrol dokusundan dokuz slayt kesildi. Bu slaytlar, anti-Tibet (klon 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, US) ve anti-GATA3 (klon L50-823, CM) ile IHC ile boyanmıştır. -405B, Biocare Medical, Hollanda) antikorları. Slaytlar, 0.12 μm/piksel çözünürlükte bir Pannoramic 250 Flash II dijital slayt tarayıcı kullanılarak dijitalleştirildi. İki gözlemci, ASAP yazılımını kullanarak farklı bölgelerde 5726 nokta açıklama üretti. Beş slayttan gelen açıklamalar, piksel boyutu 0.49 μm/ piksel olan 256 × 256 piksellik yamalar kullanılarak bir U-Net mimarisi CNN'yi eğitmek için kullanıldı. CNN'nin doğrulanması ve nesne algılama eşiğinin (0.4) belirlenmesi için iki WSI kullanıldı. Geleneksel IHC WSI üzerindeki CNN performansı, iki IHC WSI'dan oluşan bir gizli test setinde değerlendirildi. Yapay parlak alan üzerindeki CNN performansı IHC WSI, 1082 nokta açıklamalı dört yapay parlak alan IHC WSI'den (iki hastadan Tibet ve GATA3) oluşan ikincil bir test setinde değerlendirildi. Her iki test setindeki performansı değerlendirmek için kesinlik, geri çağırma ve F1-puanı hesaplandı. Tespitler, kesin bilgi notundan 4 µm içinde bulunursa gerçek pozitif olarak kabul edildi. 4 µm aralığında iki algılama bulunduğunda, yalnızca ek açıklamaya en yakın olan algılama gerçek pozitif olarak kabul edildi. Daha sonra, nükleer (lenfosit) belirteçleri (Tibet ve GATA3) temsil eden tüm yapay parlak alan IHC WSI'lerinin analizi için lenfosit saptama CNN II kullanıldı.

Makrofaj algılama CNN

Lenfosit tespitinin aksine, bireysel makrofajların tanımlanması kesin değildir. Özellikle kümelenmiş sahnelerde, önemli düzeyde gözlemci değişkenliği beklenebilir. Bu nedenle, CD68 plus ve CD163 plus makrofajların tespiti için özel bir üçüncü CNN'yi eğitmek için çok daha fazla sayıda vaka ve insan açıklamaları kullanıldı. Doğal ve transplant böbrek dokusundan IHC ile boyanmış slaytlar (n=111) toplandı. IHC boyamaları, anti-CD68 (klon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Danimarka veya klon KP1, M0876, Dako, Danimarka) veya anti-CD163 (klon MRQ) kullanılarak yapıldı. -26 veya 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) antikoru. IHC slaytları, panoramik bir 250 Flash II dijital slayt tarayıcı veya bir Aperio AT2 Slayt Tarayıcı (Leica Biosystems, Wetzlar, Almanya) kullanılarak 0.24 veya 0 çözünürlükte dijitalleştirildi. .25 μm/piksel, sırasıyla. Dört gözlemci, ilk pilot deneylerden sonra üzerinde anlaşmaya varılan makrofaj açıklamaları için bir protokol kullanarak, WSI'lerde birden fazla ROI'de 37.709 nokta açıklama üretti. 101 slayttan gelen açıklamalar, bir YoloV2 mimarisi CNN'yi eğitmek için kullanıldı [29]. Yolo, özellikle tespit görevlerini hedefleyen görevler için uygundur. Yedi evrişim katmanından oluşan ağ, 21 μm'lik sınırlayıcı kutularla (ortalama makrofaj boyutuna göre) 0.98 μm/piksel çözünürlükte çıkarılan 256 × 256 piksellik yamalar üzerinde eğitildi. CNN'nin doğrulanması ve nesne algılama eşiğinin (0.45) ve maksimum olmayan bastırma parametrelerinin (0.05) belirlenmesi için on WSI kullanıldı. Geleneksel IHC WSI üzerindeki CNN performansı, on IHC WSI'dan oluşan bir gizli test setinde değerlendirildi. Yapay parlak alan üzerindeki CNN performansı IHC WSI, 1033 nokta açıklamalı dört yapay parlak alan IHC WSI'den (iki hastadan CD68 ve CD163) oluşan ikincil bir test setinde değerlendirildi. Her iki test setindeki performansı değerlendirmek için kesinlik, hatırlama ve F1 puanları hesaplandı. Tespitler, gerçek bir bilgi notundan 21 µm (ortalama makro-faj çapı) içinde bulunurlarsa gerçek pozitif olarak kabul edildi. 21 µm aralığında daha fazla tespit bulunduğunda, yalnızca açıklamaya en yakın olan tespit gerçek pozitif olarak kabul edildi. Daha sonra, makrofaj belirteçlerini (CD68 ve CD163) temsil eden tüm yapay aydınlık alan IHC WSI'nin analizi için makrofaj saptama CNN kullanıldı.

cistanche tuboloza testosteron

çift ​​pozitiflik

İki işaret için hücrelerin pozitifliği (çift pozitiflik), farklı kanallardaki hücre saptamaları arasındaki piksel sayısı belirlenerek değerlendirildi. İki lenfosit tespiti arasındaki mesafe<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

ROI'ler içinde hücre sayıları hesaplandı ve hücre yoğunlukları, hücre sayımına ve açıklamalı ROI alanına dayanıyordu.

Mekansal ilişkiler

WSI'da otomatik hücre algılama, hücreler arasındaki uzamsal ilişkilerin araştırılmasına olanak tanır. Her iki hasta grubu için panel I'in WSI'sindeki CD68 artı hücreler ve CD3 artı , CD3 artı CD8 artı ve CD20 artı hücreler için ve CD163 artı hücreler ve CD4 arasında ortalama en kısa mesafe (subkapsüler bölge hariç bölgelerde) belirlendi. plus , CD4 plus Tbet plus ve CD4 plus GATA3 plus her iki hasta grubu için WSI'da.

peritübüler kapiller kapsam

Peritübüler kapiler kapsamı değerlendirmek için, CD34 kanalını temsil eden karışmamış WSI'ler Fiji'de (ImageJ sürüm 2.0.0, ABD, makrolar ve eklentiler: "Aç ve Çoğalt", "ASAP" analiz edildi. ROI Okuyucu") [30]. Pozitif pikseller, otomatik eşikleme yoluyla belirlendi ve ardından ROI içindeki toplam piksel sayısının yüzdesi olarak ifade edildi.

istatistiksel analiz

Aşağıdaki hücre popülasyonlarının yoğunlukları 6 haftalık biyopsilerde hesaplanmıştır: T-lenfositler (CD3 artı), sitotoksik T-lenfositler (CD3 artı CD8 artı), B-lenfositler (CD20 artı), makrofajlar (CD68 artı , paneller I ve II), polarize makrofajlar (CD68 artı CD163 artı , CD163 artı ), T yardımcı 1 lenfositler (CD4 artı Tbet artı ) ve T yardımcı 2 lenfositler (CD4 artı GATA3 artı ). Spearman'ın korelasyon katsayıları, T-helper 1 ve T-helper 2 lenfosit yoğunluğu (CD4 artı Tbet plus , CD4 artı GATA3 artı ) ve polarize makrofaj yoğunluğu (CD68 artı CD163 artı veya CD163 artı ) arasında bir korelasyon olup olmadığını değerlendirmek için hesaplandı. Panel I'in yapay CD4 (florofor 520 nm) IHC'lerinde CD68 sinyali (florofor 540 nm) gözlemledik. Bu nedenle, ayrıca CD3 artı CD8− hücreleri için hücre yoğunluklarını da rapor ediyoruz. Farklı IFTA sonuçları olan hasta grupları arasındaki farklılıkları değerlendirmek için grup başına medyan, minimum ve maksimum hücre yoğunluğu değerlerini rapor ediyoruz. Gruplar arasında hücre yoğunluğu ve peritübüler kılcal yayılımdaki (CD34-pozitif piksel yüzdesi olarak tanımlanan) önemli farklılıklar, bağımsız numuneler için Mann-Whitney's U testi kullanılarak değerlendirildi. Farklı IFTA sonuçları olan hastaların önemli ölçüde farklı CD3 artı CD8-/CD3 artı CD8 artı hücre oranları gösterip göstermediği bağımsız numuneler için bir t-testi kullanılarak değerlendirildi. CD68 plus ve CD163 plus hücrelerinin diğer immün hücrelerle uzamsal ilişkilerinde hasta grupları arasındaki farklar, bağımsız numuneler için Mann-Whitney's U testi kullanılarak önem açısından değerlendirildi.

Sonuçlar

IHC pozitif hücrelerin CNN tabanlı tespiti

Orijinal olarak parlak alan mikroskobu için geliştirilmiş olan mevcut CNN'leri uygulamak için mTSA floresan görüntüleri yapay parlak alan görüntülerine dönüştürüldü. Karşılık gelen yapay parlak alan IHC görüntüleri ile mTSA lekeli bölgelerin örnekleri Şekil 2'de verilmiştir. Bir yapay parlak alan IHC WSI örneği Ek Şekil 4'te gösterilmektedir. Çok çözünürlüklü WSI'ler dijital slayt görüntülemede açılabilir ve görüntülenebilir ASAP ve Aperio ImageScope [v12.4.3.5008] gibi yazılımlar. Şekil 2'de görselleştirildiği gibi, yapay parlak alan IHC WSI, orijinal olarak geleneksel IHC WSI için geliştirilmiş olan CNN'ler tarafından otomatik analiz için uygundu.

6 haftalık mTSA lekeli transplant biyopsilerinde enflamatuar hücrelerin kantitatif değerlendirmesi için üç CNN kullanıldı: sitoplazmik (CNN I) ve nükleer (CNN II) IHC boyaması ile lenfosit tespiti ve makrofaj tespiti için. Tablo 2, hem DAB lekeli IHC WSI'lerin hem de yapay parlak alan IHC WSI'lerin bekleme setleri için CNN performansını (kesinlik, hatırlama ve F1-skorları) göstermektedir. CNN performansı tipik olarak, deneyimli manuel gözlemcilerle karşılaştırılabilir performansa sahip olduğu gösterilen (F1-0.78 F1-puanıyla) temel CNN kadar veya ondan daha iyiydi [22] . Lenfosit tespiti CNN II, gerçek DAB görüntülerine (CNN'nin eğitim aldığı) kıyasla sanal parlak alan görüntülerinde biraz daha düşük performans gösterirken, makrofaj tespiti için CNN için bunun tersi gözlemlendi.

Başarılı bir otomatik çift pozitiflik değerlendirmesi örneği Şekil 3'te verilmiştir.

Farklı hücre tiplerinin korelasyonu

En güçlü korelasyon, CD4 artı GATA3 artı hücre yoğunluğu ile CD163 artı hücre yoğunluğu (Spearman katsayısı 0.75, p < 0.001)="" arasında="" gözlemlendi.="" 6="" haftalık="" biyopsi="" (ek="" şekil="" 5a).="" bu="" korelasyon,="" cd4="" artı="" tbet="" artı="" hücre="" yoğunluğu="" ile="" cd163="" artı="" hücre="" yoğunluğu="" arasında="" daha="" zayıftı="" (spearman="" katsayısı="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (ek="" şekil="" 5b)="" .="" hücre="" popülasyonu="" çift="" pozitif="" makrofajlarla="" (cd68="" artı="" cd163="" artı="" )="" sınırlandırıldığında,="" spearman'ın="" korelasyon="" katsayısı="" cd4="" artı="" gata3="" artı="" hücrelerle="" 0.65="" (p="">< 0.01)="" ve="" cd4="" ile="" 0.66="" (p="">< 0.01)="" idi.="" artı="" tbet="" artı="" hücreler="" (ek="" şekil="" 5c,="" d).="" subkapsüler="" bölgenin="" analizlere="" dahil="" edilmesi="" sonuçları="">

arasında inflamatuar infiltratların karşılaştırılmasıIFTA'ya ilerleyen hastalar ve IFTA olmayan hastalar

6 ayda IFTA'ya ilerleyen hastalar, transplantasyondan 6 hafta sonra alınan biyopsilerde (medyan 505 hücre/mm2), IFTA'ya ilerlemeyen hastalara kıyasla (medyan 370 hücre/mm2; p=0) önemli ölçüde daha yüksek CD163 artı hücre yoğunlukları sergilemiştir. .043) (Tablo 3). Subkapsüler bölgenin dahil edilmesi, bu etkide hafif bir azalmayla sonuçlandı (p=0.051). Her iki panelde de CD68 ve CD4 kullanılmıştır. mTSA panel I ile boyanan slaytlar, mTSA panel II ile boyanan slaytlardan daha fazla CD68 pozitifliği gösterdi. CD4 hücre yoğunluğu, mTSA panel II'de mTSA panel I'e kıyasla daha yüksektir (Tablo 3).

Peritübüler kapiller yayılım, farklı IFTA sonuçları olan (Tablo 3) DGF hastalarının 6 haftalık biyopsilerinde, hem subkapsüler bölge hariç tutulduğunda (p=0.74) hem de subkapsüler bölge dahil edildiğinde (p=0.90) benzerdi. analizden/içinde.

CD3 artı CD8-/CD3 artı CD8 artı hücre oranlarının değerlendirilmesi, hastalığı olan hastalarda önemli ölçüde daha yüksek bir oran gösterdi.<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

CD68 artı hücrelerden CD3 artı , CD3 artı CD8 artı ve CD20 artı hücrelere (panel I) ve CD163 artı hücrelerden CD4 artı , CD4 artı Tbet artı ve CD4 artı GATA3 artı hücrelere (panel II) ortalama en kısa mesafe hasta grupları arasında anlamlı farklılık göstermez. Sonuçlar Şekil 4'te görselleştirilmiştir.

cistanche özü: böbrek fonksiyonunu ve fiziksel gücü iyileştirir

Tartışma

Bu çalışmada, DGF'li böbrek nakli hastalarının greft biyopsilerinde inflamatuar hücre sızıntılarının doğru ve objektif nicelleştirilmesi için böbrek biyopsi materyalinin kapsamlı seri kesilmesini engelleyen bir yöntem geliştirdik. Bu amaçla, multipleks IHC, tiramid sinyal amplifikasyonu, multispektral görüntüleme ve CNN'lerle nicelleştirmeyi birleştirdik. Döşenmiş multispektral verileri hücre işaretçisi başına tek bir yapay kromojenik görüntüye dönüştüren ilk biz olduk, bu da WSI analizini ve parlak alan IHC için tasarlanmış CNN'lerin uygulanmasını kolaylaştırdı. Nükleer lekeli lenfositlerin ve makrofajların tespiti için iki yeni CNN tasarladık ve geleneksel IHC WSI üzerinde geliştirilen CNN'lerin yapay parlak alan IHC WSI'ye genelleştirilebilirliğini gösterdik. Yöntemimizin uygulanabilirliği, transplantasyondan 6 ay sonra IFTA gelişimi ile DGF hastalarının 6 haftalık biyopsilerinde inflamatuar mikro-ortamın korelasyonlarını incelemek için CNN'ler tarafından elde edilen nicel sonuçlar kullanılarak gösterildi.

Transplantasyondan 6 hafta sonra elde edilen sürveyans biyopsilerinde immün hücreleri ve peritübüler kılcal damarları görselleştirmek için multipleks IHC için ticari olarak mevcut bir manuel boyama kiti kullandık. Multipleks boyama prosedürü, çoklu yıkama, inkübasyon ve doku kaynatma adımlarından oluşuyordu ve birkaç reaktif solüsyonu içeriyordu. Kapsamlı yöntem validasyonları ve kalite kontrolleri bu nedenle büyük önem taşır ve tutarlı boyama yoğunluğu sağlayan spesifik antikorların kullanılması önerilir. Gerçekleştirilen doğrulama adımlarına rağmen, mTSA panel I ve II'den slaytların CD4 kanallarında makrofaj benzeri boyama desenleri görüldü. CD4 ve CD68 boyama döngüleri art arda gerçekleştirilmedi, bu nedenle bu fenomen, CD68 antikorunun eksik soyulmasından kaynaklanamadı (Ek Tablo 1). CD4 ile makrofaj ikili pozitifliğinin nadir oluşumları tanımlanmış olmasına rağmen [31], daha makul bir açıklama, her ikisi de kapsanan CD4 (520 nm) ve CD68 (540 nm) görselleştirme için kullanılan floroforların emisyon spektrumlarının yakınında yatmaktadır. floresan mikroskobunun FITC filtre küpü ile. Bu, güçlü CD68 sinyalinin CD4 kanalına "akmasına" neden olabilir. Genel T yardımcı hücre analizi için yalnızca CD3 ile çift pozitif olan CD4 artı hücreler kullanıldığından, bu sinyalin çoğu panel I'deki analizden çıkarıldı. Bununla birlikte, bir yedek olarak CD3 artı CD8− kullanarak genel T-yardımcı hücreleri de dolaylı olarak değerlendirmeye karar verdik. Panel II'de CD4 yalnızca Tibet ve GATA3 ile kombinasyon halinde kullanıldı ve yanlış pozitif tespitlerin kullanılması riskini sınırladı.

Panel II'de panel I'e kıyasla daha düşük CD68 pozitifliği gözlendi. Bunun, CD163'e ("şemsiye etkisi") ait tiramid birikimi ile sterik inhibisyonun sonucu olduğunu varsayıyoruz [32]. Çalışılan kohortta, sterik inhibisyonu kontrol etmek için kullanılan bademcik dokusundan önemli ölçüde daha fazla CD163-pozitif hücre gözlemledik, bu muhtemelen bu etkinin doğrulama sırasında neden keşfedilmediğini açıklıyor.

Multipleks IHC, çeşitli onkoloji çalışmalarında tümör mikroçevresinin incelenmesi ve son zamanlarda böbrek allogreft reddinin analizi için multispektral görüntüleme ile birleştirilmiştir [33-35]. mTSA slaytlarındaki tüm belirteçlerin katkısını çıkarmak için kesitler, bir Vectra sistemi veya multispektral bir kurulumla benzer bir floresan mikroskobu ile görüntülenir. Düşük büyütmeli bir genel bakış görüntüsü kaydettikten sonra, Vectra sistemi dokuyu karolara böler ve karoları otomatik olarak multispektral olarak tarar. Bu, birden fazla katkıda bulunan spektruma sahip görüntü döşemeleriyle sonuçlanır. Tek floroforların spektrumları önceden kaydedilmiş spektral "kütüphaneden" bilindiği için, mültipleks karoları her bir floroforun ("karışmayan") katkısını temsil eden çoklu tekli karolara ayrıştırmak mümkündür. Çoğu çalışmada, karıştırılmamış görüntüler daha sonra ticari yazılımlarla analiz edilir. Çoğu durumda, bu programlar WSI analizini desteklemez, kümelenmiş hücreleri analiz etmede güçlük çeker ve genellikle artefaktlara ve boyama varyasyonlarına karşı dirençli değildir. Karıştırılmamış karoları yapay parlak alan IHC WSI'lerine dönüştürmek, IHC'de [22] lenfosit tespiti için özel olarak tasarlanmış mevcut bir CNN'yi (lenfosit tespiti CNN I olarak anılır) uygulamamızı sağladı. Bu ağ, tek tek ve kümelenmiş lenfositleri, arka plan boyamaya karşı dirençliyken yüksek doğrulukla saptayabilir (Şekil 2, CD3). Ek olarak, nükleer boyama desenli hücrelerin (Tibet, GATA3) (lenfosit tespiti CNN II) tespiti ve makrofajların tespiti için iki yeni CNN'yi eğittik. Makrofajları, dağınık boyama desenleri nedeniyle tespit etmek oldukça zordur. Makrofaj tespiti CNN bu nedenle dört farklı uzmanın açıklamaları kullanılarak eğitildi. Açıklamalar yapılmadan önce, makrofajlara açıklama ekleme kriterlerinin tartışıldığı ve değerlendirildiği çoklu toplantılar planlandı. Bu, spesifik olmayan boyama için sağlam iken makrofajları tekrarlanabilir bir şekilde tespit edebilen bir ağ ile sonuçlandı (Tablo 2, Şekil 2 ve Ek Şekil 6). Bildiğimiz kadarıyla bu, taranan histopatolojik kesitlerde makrofaj tespiti için ilk algoritmadır. Her üç ağın performansını geleneksel IHC WSI'den oluşan bir test setinde (eğitim sırasında kullanılanlara benzer) ve çoklu spektral olarak kaydedilen görüntülerden oluşturulan yapay parlak alan IHC WSI'den oluşan ikincil bir test setinde test ettik. Tüm CNN'ler, birincil test setlerinde çok iyi performans ve ikincil test setlerinde benzer F1- puanları gösterir. Lenfosit tespiti CNN I'in performans ölçümleri normal doku, artefaktlar ve hücre kümeleri üzerinde hesaplandı. İkinci test setinin yapay parlak alan IHC'si hiçbir doku artefaktı ve daha az hücre kümesi içermiyordu. Bu, ikinci test setinde bu ağın genel olarak daha iyi performansını açıklayabilir. Makrofaj tespiti CNN, dört farklı yorumlayıcıdan gelen açıklamalar üzerinde eğitildi ve test edildi. Açıklama kriterleri özellikle tartışılırken, açıklama tarzında farklılıklar gözlendi. CNN'nin duyarlılığı bu nedenle muhtemelen açıklama stili aşırılıklarının ortasında bir yerdedir. İkinci test seti için ek açıklamalar, CNN duyarlılığıyla görünüşte eşleşen bir açıklayıcı tarafından üretildi.

Tanımlanan CNN'leri kullanmak, DGF'li transplant hastalarının titizlikle seçilmiş erken gözetim biyopsilerinden oluşan benzersiz bir dizide inflamatuar infiltrasyonu benzeri görülmemiş bir doğrulukla araştırmamızı sağladı.

Ne yazık ki, çoğu teşhis çalışmasından sonra yetersiz kalan doku nedeniyle birden fazla numunenin analizden çıkarılması gerekmiştir. Veri setinin sınırlı boyutuyla bile, IFTA gelişimine ilerleyen DGF hastalarının biyopsilerinde, bu hücrelerin potansiyel olarak profibrotik rolü ile uyumlu olarak, önemli ölçüde daha yüksek CD163 artı hücre yoğunlukları bulduk [11]. Gözlenen eğilim yayınlanmış verilerle tutarlı olsa da, daha önce diğer böbrek nakli hasta grupları için rapor edilmiş olan CD68 artı makrofajların erken varlığının zararlı etkisini doğrulayamadık [7, 36, 37]. CD4 artı GATA3 artı hücrelerin ve CD163 artı hücrelerin yoğunlukları arasında pozitif bir korelasyon bulduk, bu da T-yardımcı 2 lenfositlerin pro-fibrotik bir mikro çevreye katkısını doğrulayabilir. Bu çalışmada DGF hastalarında IFTA gelişimi için yeni bir öngörücü biyobelirteç bulunmamakla birlikte, transplant biyopsileri gibi seyrek dokudaki inflamatuar infiltratın doğru, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir değerlendirmesi için yöntemleri başarıyla geliştirdik. Bu yöntemler, histopatolojik dokudaki inflamasyon üzerine gelecekteki nicel çalışmalar için değerlidir.

Adrenal yorgunluğunu cistanche ile gidermek için daha fazla bilgi almak için buraya tıklayın

Veri kullanılabilirliği

Bu çalışmada sunulan verilerin kullanımını içeren işbirliği talepleri, ilgili yazara (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) veya FF'ye (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de) iletilebilir.

Teşekkür

Mark Gorris ve Kiek Verrijp'e mTSA boyama ve görüntüleme konusundaki tavsiyeleri için, Merijn van Erp'e özelleştirilmiş ImageJ işlevselliği geliştirdikleri için ve Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg ve Martijn Otten'e makrofaj algılama ağı için temel gerçeği ürettikleri için teşekkür ederiz. Ayrıca, klinik veri toplama konusundaki yardımları için Irina Scheffner'e teşekkür ederiz.

Yazar KatkılarıMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH ve JAWML

çalışmayı tasarladı. Hasta materyali ve klinik veriler toplandı ve JS, WG ve FF tarafından sağlandı. FF, MHH'de gerçekleştirilen çalışmaları koordine etti. JHB, EJS ve JK, IFTA yüzdesi için PAS slaytını puanladı. MH, mTSA boyamalarını, panel I ve II'nin doğrulamalarını ve panel I'in görüntülenmesini ve karıştırılmamasını gerçekleştirdi. VV görüntülü ve karıştırılmamış panel II. DJG, mTSA karolarını yapay parlak alan WSI'ye dönüştürmek için yöntemler geliştirdi. MH dönüşümleri gerçekleştirdi. ZS-C, lenfosit tespit CNN'lerini geliştirdi ve lenfosit miktar tayini için komut dosyaları yazdı. JL, makrofaj algılama CNN'lerini geliştirdi ve makrofaj nicelemeleri için komut dosyaları yazdı. MH, hücre ve kılcal kantifikasyonları gerçekleştirdi. NSS hücre mesafelerini hesapladı. MH, BS, LBH ve JAWML verileri analiz etti. MH rakamları yaptı ve kağıdın taslağını çizdi. Makalenin son hali revize edildi ve tüm yazarlar tarafından onaylandı.

FinansmanBu çalışma, Avrupa Birliği'nin ZonMw tarafından sunulan Ufuk 2020 Çerçeve Programının bir parçası olarak ERACoSysMed girişimi (proje SysMIFTA) tarafından desteklenmiştir (hibe no. 9003035004), Alman Araştırma ve Eğitim Bakanlığı (BMBF), hibe no. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) ve FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML, Philips'ten (Hollanda) danışmanlık ücreti aldı ve

ContextVision, Philips (Hollanda) ve Sectra (İsveç), gönderilen çalışmanın dışında. JK, Hollanda Böbrek Vakfı'ndan mali destek aldı (DEEPGRAFT projesi, Hibe No. 17OKG23).

Etik standartlara uygunluk

çıkar çatışmasıYazarlar, rekabet eden çıkarlar beyan etmemektedir.

Etik onay ve katılım onayıVeri toplama ve analiz, bilgilendirilmiş hasta onamı ve Hannover Tıp Fakültesi etik kurulunun (no. 2765) onayı ile gerçekleştirilmiştir.

Yayıncının NotuSpringer Nature, yayınlanmış haritalardaki ve kurumsal bağlantılardaki yargı iddiaları konusunda tarafsız kalır.

Açık ErişimBu makale Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisansı ile lisanslanmıştır ve orijinal yazar(lar)a uygun şekilde atıfta bulunduğunuz sürece herhangi bir ortamda veya biçimde kullanım, paylaşım, uyarlama, dağıtım ve çoğaltmaya izin verir. ) ve kaynak, Creative Commons lisansına bir bağlantı sağlayın ve değişiklik yapılıp yapılmadığını belirtin. Bu makaledeki resimler veya diğer üçüncü şahıs materyalleri, materyalin kredi limitinde aksi belirtilmedikçe makalenin Creative Commons lisansına dahildir. Materyal, makalenin Creative Commons lisansına dahil değilse ve kullanım amacınız yasal düzenlemeler tarafından izin verilmiyorsa veya izin verilen kullanımı aşarsa, doğrudan telif hakkı sahibinden izin almanız gerekir.

Referanslar

1. Siedlecki A, İrlandalı W, Brennan DC. Böbrek naklinde gecikmiş greft fonksiyonu. J Nakli miyim. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Kronik allogreft disfonksiyonu olan renal transplant alıcılarında uzun süreli greft kaybının risk faktörleri. Exp Clin Nakil. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Gecikmiş greft fonksiyonu ile allogreft ve hasta sağkalımı arasındaki ilişki: sistematik bir gözden geçirme ve meta-analiz. Nefrol Kadran Nakli. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Gecikmiş böbrek greft fonksiyonu: mekanizmadan translasyona. Böbrek İnt. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. Toplam inflamasyonun skorlanması, renal allogreftlerde sonucu ve moleküler bozukluğun derecesini öngörmede mevcut Banff inflamasyon skorundan üstündür. J Nakli miyim. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

doktor. Erken sürveyans biyopsilerinden böbrek allogreft fonksiyonunda müteakip düşüşü tahmin etmek. J Nakli miyim. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. Transplantasyondan sonraki ilk yılda insan renal allogreft fibrozunun gelişiminde makrofajların rolü. J Nakli miyim. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. Kronik böbrek allogreft hasarının patogenezinde alternatif olarak aktive edilmiş makrofajlar. Pediatr Nefrol. 2015;30:1007– 17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Makrofaj plastisitesi ve lenfosit alt grupları ile etkileşim: paradigma olarak kanser. Nat İmmünol. 2010;11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Renal mikro-ortamlar ve makrofaj fenotipleri, renal inflamasyon ve fibrozisin ilerlemesini veya çözülmesini belirler. Böbrek İnt. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Organ transplantasyonunda makrofajlar. Sınır İmmünol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. Gecikmiş greft fonksiyonu olan böbrek nakli hastalarında T yardımcı 1, 2 ve 17 hücre alt grupları. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Tümör infiltre eden lenfositlerin skorlanması: görsel tahminden makine öğrenimine. Seminer Kanser Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Kronik allogreft hasar indeksi parametrelerinin nicelleştirilmesi için görüntü analizine dayalı bir yöntem. AMPS. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, Garcia-Sagredo JM, et al. Kümelenmiş çekirdeklerin segmentasyonuna havza algoritmaları uygulamak. sitometri. 1997;28:289-97.

16. Lai YK, Rosin PL. Verimli dairesel eşikleme. IEEE Trans Med Görüntüleme. 2014;23:992– 1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Tıbbi görüntü analizinde derin öğrenme üzerine bir anket. Med Görüntü Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Dijital patolojide görüntü analizi ve makine öğrenimi: zorluklar ve fırsatlar. Med Görüntü Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Meme kanserli kadınlarda lenf nodu metastazlarının tespiti için derin öğrenme algoritmalarının tanısal değerlendirmesi. JAMA. 2017;318:2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Böbrek dokusunun derin öğrenmeye dayalı histopatolojik değerlendirmesi. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.