Birincil ve Metastatik İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinin Reaktif Oksijen Türleri Aracılı Apoptozu

GİRİİŞ

Kolorektal kanser dünya çapında en sık görülen kanserlerden biridir (Brennerve ark., 2014) ve modern beslenme ve yaşam tarzının yanı sıra azalan fiziksel aktivite nedeniyle 2035 yılında tahmini 2,4 milyon vakayla görülme sıklığı sürekli artmaktadır. Mevcut çabalar mevcut kolorektal kanser salgınıyla mücadele etmek için yeterli değildir ve bu nedenle etkili önleme ve tedavi için Fitoterapötikler (Weidner) gibi daha güvenli alternatif müdahalelerle birlikte yaşam tarzı değişiklikleri de dahil olmak üzere yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır.ve ark., 2015). Şifalı bitkilerin hastalıkların tedavisinde kullanılması anlamına gelen fitoterapi, eski insanlık tarihinin kaçınılmaz bir parçası olmuştur. Geleneksel tıpta kullanılan antikanser ajanların yüzde altmışından fazlasını temsil eden şifalı bitkiler uzun süredir kanserler için alternatif tedavi kaynakları olarak kullanılmaktadır (Balunas ve Kinghorn, 2005; Saibu).ve ark., 2015). En iyi bilinen örneklerden bazıları şunlardan alıntılardır:Catharanthus gülüG.Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) ve Camptotheca acuminat Decne (Nyssaceae) (Cragg ve Newman, 2005; da Rocha)ve ark., 2001). Çeşitli bitkisel ekstraktların ve fitokimyasalların kolorektal kanserde reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin indüklenmesine ve kanser hücrelerinin ilişkili apoptozuna atfedilen antitümör etkileri gösterdiği gösterilmiştir.Melissa officinalis(Weidnerve ark., 2015)

Fitoterapötik adaylar arasında,Cistanche tubulosaAfrika, Asya ve Akdeniz bölgesinin kurak ve yarı kurak bölgelerinde yaygın olarak dağıtılan bir Orobanchaceae parazit çöl bitkisi olan (Jiang ve diğerleri, 2009) değerli tıbbi özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir. Cistanche tubulosa geleneksel tıpta yaygın olarak kullanılmaktadır ve böbrek yetmezliği, morbid lökore, metroraji, kadınlarda kısırlık ve yaşlılık kabızlığında iyileştirici etkilere sahip olduğu ileri sürülmektedir (Jiang ve ark., 2009).Geleneksel tıbbi kullanımlarına ek olarak, önemli tıbbi kullanımlara ek olarak, önemli tıbbi Cistanche Tubulosa'nın özellikleri, damar gevşetici (Yoshikawa ve diğerleri, 2006), hepatoprotektif (Morikawa ve diğerleri, 2010), anti-hiperglisemik ve hipolipidemik etkiler (Xiong ve diğerleri, 2013) dahil olmak üzere son on yılda yoğun bir şekilde incelenmiştir. Cistanche Tubulosa'nın ayrıca bağışıklık sisteminin güçlü bir güçlendiricisi, kemik oluşumunun destekleyicisi ve yaşlanma karşıtı ve yorgunluk önleyici bir madde olduğu öne sürüldü (Xu ve diğerleri, 2014). Ayrıca Cistanche tubulosa ekstraktının Alzheimer hastalığı modelinde amiloid birikimini bloke ettiği gösterilmiştir (Wu ve diğerleri, 2015). Çeşitli terapötik kullanımlarına rağmen Cistanche Tubulosa'nın potansiyel bir antikanser ajanı olarak etkisi henüz araştırılmamıştır.

Bu çalışmada Cistanche Tubulosa'nın iki primer ve iki metastatik kolon kanseri hücre dizisi üzerindeki antikanser etkisini ve bu etkinin altında yatan potansiyel mekanizmaları araştırdık.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Bitki ekstraktının toplanması ve hazırlanması

Cistanche tubulosa örnekleri 2014 yılında Katar'ın çöl bölgelerinden toplanmış ve bitkinin orijinalliği herbatolog tarafından doğrulanmıştı. Kupon örnekleri ADLQ'nun Toksikoloji ve Çok Amaçlı Departmanında arşivlenmektedir. Güneşte kurutulan bitki örnekleri Retsch Knife Mill Grindomix GM300 ile ince toz haline getirildi. Yirmi gram toz, 200 mL ultra saf su ile gece boyunca 37 derecede, 200 rpm'de döner bir çalkalayıcıda ekstre edildi. HamCistanche tubulosa özleri (CTE)çözünmeyen bileşiklerin pellet haline getirilmesi için 8000 rpm'de 30 dakika süreyle santrifüjlendi, süpernatan toplandı ve bir Labconco Freezone 6 plus Freeze kurutucu kullanılarak dondurularak kurutuldu. Kurutulan ekstrakt, Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamında (DMEM, SIGMA, Almanya) 20 mg/mL'lik bir konsantrasyona kadar yeniden oluşturuldu ve 0.2- mikronluk bir membran filtreden steril olarak filtrelendi.

Hücre hatları ve hücre bakımı

İnsan kolon karsinomu hücre dizileri CaCo2, SW620 ve LoVo, Cell Lines Service'den (CLS, Eppelheim, Almanya) elde edilirken, HCT 116 hücre dizisi, Katar Üniversitesi Biyoloji ve Çevre Bilimleri Bölümü'nden bir tür hediyeydi. CaCo2 ve HCT11 kolon karsinomunun birincil bölgesinden türetilirken SW620 ve LoVo metastatik bölgeden türetildi. SW620, HCT116 ve LoVo hücreleri kültürlendi ve DME Ortamında tutuldu, CaCo2 hücreleri ise Eagle's Minimum Essential Medium'da (EMEM, SIGMA, Almanya) tutuldu. Hücreler, %5 karbon dioksit içeren nemli bir atmosferde, %10 fetal sığır serumu (FBS, SIGMA, Almanya) ve %1 Penisilin/Streptomisin (SIGMA, Almanya) ile desteklenmiş ilgili ortamda 37 derecede kültürlenen tek katmanlı olarak büyütüldü.

Hücre canlılığı deneyi

{{0}}[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum (MTT) tahlili, sitotoksik aktivitesini değerlendirmek için kullanıldı. CTE, daha önce açıklandığı gibi (Jaganjac ve diğerleri, 2010). 96-kuyu plakalarında kültürlenen CaCo2, HCT116, SW620 ve LoVo hücrelerinin tohumlama yoğunluğu, yuva başına 104 hücreydi. Hücreler, tedaviden 24 saat önce %10 FBS ile desteklenmiş ilgili ortamda kaplandı. 24 saat sonra ortam çıkarıldı ve hücreler, %5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 derecede 24, 48 ve 72 saat boyunca 0, 0,25, 0,5, 1 ve 2 mg/mL CTE ile işlendi. CTE tedavisinin ardından ortam çıkarıldı ve her bir oyuğa 40 uL MTT çözeltisi (0,5 mg/mL) ilave edildi.

3 saatlik inkübasyonun ardından MTT çözeltisi çıkarıldı, formazan ürünü dimetilsülfoksit (DMSO, SIGMA, Almanya) içerisinde çözüldü ve absorbans, bir mikroplaka okuyucu (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, İsviçre) ile 590 nm'de ölçüldü. .

Apoptoz tahlili

CaCo2, HCT116, SW620 ve LoVo hücrelerinde apoptoz, hayati bir boya (Becton) olarak 7-Amino-Aktinomisin D (7-AAD) içeren PE Annexin V Apoptoz Tespit Kiti I kullanılarak tespit edildi Dickinson International, Belçika) üreticinin talimatlarına göre. Kısaca, hücreler, CTE'nin eklenmesinden önce (0, 0,5) 24 saat boyunca %10 FBS ile desteklenmiş ilgili bir ortamda 5x104 hücre/kuyu yoğunluğunda 24-kuyu plakalarına ekildi. veya 1 mg/mL). 24 CTE inkübasyonunun ardından hücreler toplandı, iki kez soğuk fosfat tamponlu salinle yıkandı ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca Phycoerythrin (PE) Annexin V ve 7-AAD ile boyandı. Lekeli hücreler, FACS kullanılarak akış sitometrisi ile 1 saat içinde analiz edildi. Minimum 104 hücreli düşük akış hızında Aria III akış sitometresi ve FACSDiva yazılımı (Becton Dickinson). Hücrelerin 4 saat süreyle 6 uM kamptotesin (SIGMA) ile işlenmesi, test için pozitif kontrol olarak kullanıldı.

Hücre içi ROS üretimi

Hücre içi ROS üretimi, 2,7- diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA, SIGMA, Almanya) kullanılarak incelenmiştir. DCFH-DA, hücre içi ROS ile floresan bileşik 2,7- diklorofloresein (DCF)'ye oksitlenen, floresan olmayan bir probtur (Poljak-Blazi ve diğerleri, 2011). DCFH DA tahlili, daha önce tanımladığımıza benzer şekilde gerçekleştirildi (Cindric ve diğerleri, 2013; Poljak-Blazi ve diğerleri, 2011). Kısaca, 96-kuyucuklu siyah plakalarda kültürlenen CaCo2, HCT116, SW620 ve LoVo hücrelerinin tohumlama yoğunluğu, kuyucuk başına 104 hücreydi. Hücreler, 24 saat boyunca %10 FBS ile desteklenmiş ilgili ortamda kaplandı. Tedaviden önce hücreler, 10 uM DCFH-DA ile 37 derecede 30 dakika boyunca %5 CO2 / %95 hava içerisinde inkübe edildi. Hücreler daha sonra yıkandı ve fenol kırmızısı içermeyen ortamda 0, 0,5 ve 1 mg/mL CTE ile işlendi. Hücre içi ROS oluşumu, üst floresans ve gaz kontrol modülüne sahip bir mikroplaka okuyucu (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, İsviçre) kullanılarak 37 derece ve %5 CO2'de 25 saat boyunca sürekli olarak izlendi. Floresan yoğunluğu, 500 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 529 nm'de emisyon tespiti ile ölçüldü. Rasgele birimler, bağıl floresans birimleri (RFU), doğrudan floresans yoğunluğuna dayanıyordu.

BÖBREK FONKSİYONUNUN GELİŞTİRİLMESİ İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitokondriyal süperoksit üretimi

CTE'nin mitokondri yoluyla süperoksit oluşumunu indükleme yeteneği, hücre geçirgen, mitokondri hedefli MitoSOX Kırmızı probu (Life Technologies) ve nükleer boyama için Hoechst 33342 (Life Technologies) kullanılarak tahmin edildi. CaCo2, HCT116, SW620 ve LoVo hücreleri, 24 saat boyunca %10 FBS ile takviye edilmiş ilgili bir ortamda, kuyucuk başına 104 hücre yoğunluğunda 96-kuyu plakalarına ekildi . Hücreler daha sonra 20 dakika boyunca 4 uM MitoSOX ve 2 uM Hoechst 33342 ile yüklendi, fazla boya yıkandı ve kuyucuklar, 37 derecede ve %5 C02'de 24 saat boyunca 0, 0.5 ve 1 mg/mL CTE ile işlendi. Floresan yoğunluğu, MitoSOX için 510 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 580 nm'de emisyon tespiti ve Hoechst 33342 için 350 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 461 nm'de emisyon tespiti ile üst floresanslı bir mikroplaka okuyucu (Infinite 200 PRO, Tecan Trading) kullanılarak ölçüldü. AG, İsviçre)

İstatistiksel analiz

Tanımlayıcı istatistikler ortalama +/− SD olarak gösterildi. Gruplar arasındaki farkların önemi, Öğrenci t-testi ve Ki-kare testi kullanılarak değerlendirildi. İkiden fazla grup karşılaştırıldığında, uygun post hoc testlerle birlikte tek taraflı ANOVA kullandık. Mircosoft Windows için SPSS 11.01 kullanıldı. P'nin 0,05'ten küçük olduğu farklar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

SONUÇLAR

CTE'nin insan kolon kanseri hücre hatlarının çoğalması üzerindeki etkisi Şekil 1'de gösterilmektedir. Test edilen tüm CTE konsantrasyonları, konsantrasyona ve zamana bağlı bir şekilde CaCo2 hücre hattı üzerinde güçlü bir inhibitör etki göstermiştir (Şekil 1A). Yetmiş iki saatlik CTE tedavisi, CaCo2 hücrelerinin büyümesini kontrole kıyasla %60'den daha fazla inhibe etti (tüm konsantrasyonlar için p < 0.05). CTE tedavisinin HCT116 hücre büyümesi üzerindeki önemli etkisi aynı zamanda en yüksek iki konsantrasyonda (1 mg/mL ve 2 mg/mL) tüm zaman noktalarında tespit edildi ve ikinci konsantrasyonda %70'den daha yüksek bir azalmaya ulaştı (Şekil 1B, p <0,05). Her ne kadar iki düşük CTE konsantrasyonu (0,25 ve 0,5 mg/mL), 24 saat sonra hücrelerin HCT116 büyümesini önemli ölçüde azaltmış olsa da (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). CTE ile çoğalmanın zamana ve konsantrasyona bağlı inhibisyonu, LoVo hücrelerinde en yüksek konsantrasyonda %60'den daha fazla bir oranda doğrulandı (p < 0.05) (Şekil 1C), ve test edilen dört CTE konsantrasyonunun tümü, 48 saat sonra SW620 hücrelerinin büyümesini azalttı (Şekil 1D, tümü için p < 0.05). 72 saatlik tedaviden sonra aynı etki yalnızca en yüksek iki konsantrasyonda (p < 0,05) gözlenirken, 0,25 ve 0,5 mg/mL konsantrasyonlar kontrole kıyasla anlamlı bir etki göstermedi (p > 0,05). 0,5 ve 1 mg/mL CTE tedavisinin apoptozun indüksiyonu üzerindeki etkisi, dört hücre hattının tümünde ayrıca test edildi (Şekil 2). 0,5 mg/mL ile 24-saatlik tedavinin ardından HCT116 ve LoVo'da erken apoptozda hücre sayısında artış tespit edildi (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Şekil 1:EtkisiCistanche tubulosakolon kanseri hücre hatlarının canlılığı üzerine. (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ve (D) SW620 hücrelerinin MTT tahlili ile ölçülen hücre canlılığı, kontrol, tedavi edilmemiş kolon kanseri hücre hattının yüzdesi olarak sunulur. Temsili deneyin 5 kopyası için ortalama değerler (±SD) verilmiştir: (*) anlamlılık p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Şekil 2: Cistanche tubulosa su ekstraktı insan kolon kanseri hücrelerinde apoptozu indükler. (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ve (D) SW620 hücrelerinin Annexin-V-FITC akış sitometri analizleri, tedavi edilmemiş kontrol kolon kanseri hücre hattının yüzdesi olarak sunulur. Temsili deneyin 3 kopyası için ortalama değerler (±SD) verilmiştir: (*) anlamlılık p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Şekil 3: Cistanche tubulosa su ekstraktı, zamana ve doza bağlı olarak hücre içi ROS üretimini indükler. (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ve (D) SW620 hücrelerinde DCFH-DA tahlili ile ölçülen ROS üretimi, ilgili 5-kopyaları için ortalama RFU değerleri (±SD) olarak sunulur. temsili bir deney. (*) Anlamlılık p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Şekil 4: Cistanche tubulosa su ekstraktı, insan kolon kanseri hücrelerinde mitokondriyal süperoksit üretimini indükler. A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ve (D) SW620 hücrelerindeki mitokondri hedefli MitoSOX Red probunun floresans yoğunluğu, tedavi edilmemiş kontrol kolon kanseri hücre hattının yüzdesi olarak sunulur. Temsili deneyin 5 kopyası için ortalama değerler (±SD) verilmiştir: (*) anlamlılık p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

TARTIŞMA

Her ne kadar daha önceki çalışmalarda Cistanche tubulosa'nın çok sayıda tıbbi özelliği bildirilmiş olsa da, bu, onun malign hücrelerde anti-proliferatif etkisine ilişkin ilk rapordur. Oldukça polar bir solvent olan suyla ekstrakte edilen Cistanche tubulosa biyoaktif bileşikleri, güçlü antikanser biyoaktivite gösterdi. Daha önce suda çözünen Cistanche tubulosa'nın etkinliğini metanol ve etil asetat gibi diğer çözücülerle karşılaştırmıştık, ancak su ekstraktları en umut verici antikanser aktivitelerini sergiledi (veriler gösterilmemiştir).

1 mg/mL ve 2 mg/mL CTE'nin hem primer hem de metastatik kolon kanseri hücre hatlarının büyümesini %60 oranında inhibe etme yeteneğini gösterdik ve bu da CTE'nin potansiyel olarak önemli bir rolünü ortaya çıkardı.Cistanche tubulosakolon kanseri tedavisi olarak. Normal hücrelerle karşılaştırıldığında, kanser hücreleri genellikle redoks homeostazındaki bir bozuklukla karakterize edilir ve mevcut antikanser tedavilerinin ortak stratejisi, hücresel oksidatif stresi arttırmaktır (Yang ve diğerleri, 2013). Her ne kadar fizyolojik olarak düşük ROS seviyeleri sinyal molekülleri olarak önemli bir role sahip olsa da, aşırı ROS üretimi kanser istikrarsızlığına ve maligniteye katkıda bulunabilir (Liou ve Storz, 2010). Paradoksal olarak hücresel redoks homeostazisindeki bu dengesizlik, kanser hücrelerini ROS kaynaklı hücre ölümüne karşı daha savunmasız hale getirir (Jaganjac ve diğerleri, 2008; Nogueira ve Hay, 2013). Bu çalışmada bildirilen CTE'nin anti-proliferatif etkisine, ekstrakt içindeki bilinen ve bilinmeyen bileşiklerin çeşitli hücre dışı ve hücre içi mekanizmaları aracılık edebilir ve apoptozda önemli rol oynayan birden fazla yolu hedefleyebilir. Farklı hücre ölümü modları arasında ayrım yapmak için, gözlemlenen CTE kaynaklı sitotoksisiteden sorumlu potansiyel mekanizmayı araştırdık.

CISTANCHE TUBULOSA ÖZÜ Anti Alzhermer PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Verilerimiz CTE'nin hücre içi ROS üretimini ve dolayısıyla ROS kaynaklı hücre ölümünü arttırdığını göstermektedir. Hücrenin Redoks durumu aynı zamanda apoptozun düzenlenmesinde de önemli bir rol oynar ve mitokondriyal elektron taşıma zinciri, hücresel ROS üretiminin ana bölgelerinden biridir (Trachootham ve diğerleri, 2008). Ayrıca hücre içi ROS, hem mitokondriye bağımlı hem de bağımsız yollar yoluyla hücresel apoptoza neden olabilir (Sinha ve diğerleri, 2013). Aslında, verilerimiz ayrıca CTE'nin neden olduğu fosfatidilserin dışsallaşmasının, hem birincil hem de metastatik kanser hücre hatlarında apoptozda ortak bir etki olduğunu göstermektedir; bu, CTE'nin neden olduğu ölüm mekanizmasının nekrozdan ziyade apoptozun aracılık ettiğini düşündürmektedir. Kanser hücrelerinde apoptozun aktivasyonu, düzeltici bir stratejidir ve birçok antikanser ilacı, kanser hücrelerinde apoptotik etkiler gösterebilir.

Bu nedenle kanser hücrelerinde pro-apoptotik aktiviteye sahip bileşikler veya ekstraktlar, antikanser ilaç araştırmalarında potansiyel olarak faydalıdır (Wong, 2011). CTE'nin neden olduğu pro-apoptotik etkiye mitokondrinin neden olduğu ROS mekanizmasının aracılık edip etmediğini belirlemek için, CTE ile tedavi edilen hücrelerde mitokondri hedefli bir floresan prob kullanarak süperoksit üretimini ölçtük. Verilerimiz, CTE'nin mitokondriyal süperoksit üretimini uyardığını açıkça göstermektedir; bu, Cistanche tubulosa antikanser aktivitesinin en azından kısmen mitokondri kaynaklı ROS mekanizması aracılığıyla aracılık ettiğini öne sürmektedir.

SONUÇLAR

Sonuç olarak verilerimiz, çöl bitkisi Cistanche tubulosa'nın su ekstraktının, kolon kanserinin önlenmesi ve tedavisi için diğer geleneksel tedavilerle kombinasyon halinde antikanser yaklaşımı için umut verici bir adayı temsil edebileceğini göstermektedir. Ayrıca bitki ekstraktının kanser hücrelerine karşı toksisitesine artan hücre içi ROS üretiminin ve en azından kısmen mitokondriyal bağımlı apoptozun aracılık ettiğini gösterdik. Antikanser aktivitesinden sorumlu biyolojik olarak aktif bileşenlerin izole edilmesi ve karakterize edilmesi için ileri çalışmalar devam etmektedir.

Bu ekstraktın etkili bir kemopreventif ajan olarak potansiyel kullanımını değerlendirmek ve kolon kanseri hücreleri üzerindeki etki mekanizmalarını moleküler düzeyde anlamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Gözlenen yararlı sağlık etkilerini doğrulamak için daha fazla klinik öncesi ve klinik çalışmalara da ihtiyaç vardır.Kanserin önlenmesi için Cistanche tubulosa.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE KAHVE BELLEĞİ GELİŞTİRİR Yorgunluk Önleyici PHGS75% ECH 30% ACT 12%