Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

İletişim: joanna.jia@wecistanche.com

Soyut

LC Teknolojisi, geleneksel Çin ilaçlarının (TCM) kalitesini değerlendirmek için dünya çapında kullanılan tanınmış bir yöntemdir. TCM'nin kalitesi, etkinliği üzerinde doğrudan bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, TCM'nin etkinliğini nasıl uyguladığını tam olarak ortaya çıkarmak için, her şeyden önce, etkinliği için malzeme temelini anlamak ve ardından aktif bileşiklerin kalitesini kontrol etmek gerekir. Spektrum-etki ilişkisi yönteminin uygulanması, farmakolojik materyal temelinin belirlenmesi için çok önemlidir. Bu makalenin amacı, kimyasal profiller ve östrojenik aktivite arasındaki temel korelasyonları araştırmaktı.cistanche, aktif bileşikleri ortaya çıkarmak için. kimyasal profillericistancheHPLC/Q-TOF-MS/MS kullanılarak kaydedildi ve östrojenik aktivite Uterus büyüme testi ve MTT testi ile belirlendi. Daha sonra iki değişkenli analiz, temel bileşen analizi ve gri korelasyon analizi yönteminin sonuçları birleştirilerek on beş aktif bileşik belirlendi. Bunlar 8-epiloganik asit, salidrosid, syringalide A 3'- -l-rhamnopyranoside, cistanoside A,ekinakozit, cistanoside F, cistanoside B, cistanoside C, osmanthusid B, acteoside, isoacteoside, tubuloside B, 2'-acetylacteoside ve iki bilinmeyen bileşik. Bu çalışma, in vivo çalışmalar için bir temel oluşturmaktadır.cistancheve klinik uygulamasının geliştirilmesi için.

Cistanche östrojeni artırabilir, daha fazlasını öğrenmek için buraya tıklayın

Anahtar Kelimeler:cistancheçöl çiçeği; LC/Q-TOF-MS; östrojenik aktivite; temel bileşen analizi (PCA); Rahim büyüme testi.

Kısaltmalar

TCM: Geleneksel Çin Tıbbı

HPLC/Q-TOF-MS: Yüksek performanslı sıvı kromatografisi/dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometrisi

BA: iki değişkenli analiz

PCA: temel bileşen analizi

GCAM: gri korelasyon analizi yöntemi

MTT :Tripsin, 3-(4, 5-Dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazoliumbromür

DMSO: dimetil sülfoksit

RPMI1640 Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640

1. Giriş

Son zamanlarda, TCM, klinikte stabil terapötik etkileri ve düşük toksisitesi nedeniyle Asya ve Batı ülkelerinde giderek daha popüler hale geldi. Sonuç olarak, yeni TCM türleri geliştirmek ve klinik uygulamaları sırasında kullanılan etkili kompozisyonları anlamak gerekir [1-6].

İlk olarak, kromatografik parmak izi ile farmakodinamik etkinlik arasındaki ilişkiyi ayırt etmek için spektrum-etki ilişkisi incelenmiştir. Ardından, TCM'de etkili bileşenleri aramak ve iç kalitelerini yansıtmak için kontrol standartlarını formüle etmek için ilişkiyi kullanmak. Spektrum-etki ilişkisi, tek ve bileşik TCM'nin malzeme temeli, bileşen uyumluluğu, işleme mekanizması, farmakolojik etki tahmini ve teknoloji optimizasyonu gibi TCM araştırmasının birçok alanında uygulanmıştır [7-12]. Spektrum-etki ilişkisi, aktif maddelerin araştırılması, formüllerin optimize edilmesi, hazırlama süreçlerinin iyileştirilmesi, hedef içeriklerin izlenmesi ve ayrılması ve yeni TCM ilaçlarının geliştirilmesi için yeni fikirler ve yöntemler ortaya koymak için kullanılır [13-17].

cistancheCinsel işlev bozukluğu, kabızlık, prostatit ve böbrek yetmezliği tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Östrojenik etki, yaşlanma karşıtı, antioksidasyon ve bağışıklık etkisi [18-19] dahil olmak üzere geniş bir biyoaktivite yelpazesine sahiptir. Genel olarak, feniletanoid glikozitler (cistanosid A, tubulosit A ​​gibi), lignanlar ve iridoid glikozitler, Cistanche ve ürünlerinin kalite kontrolü için farmakolojik bileşenler ve kimyasal belirteçler olarak kabul edildi [20-21]. kimyasal spektrumlarıcistancheFarklı alanlardan alınan yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) [22-23] kullanılarak kaydedildi. Bu çalışmada, östrojenik aktivitelerini değerlendirmek için uterus büyüme testi ve MCF7 hücre proliferasyon testini seçiyoruz. Östrojenik aktiviteyi tek tek bileşenlerle ilişkilendirmek için temel bileşen analizi, iki değişkenli analiz ve gri korelasyon analizi yöntemleri kullanıldı. Bu çalışma, in vivo östrojenik etkilerden sorumlu Cistanche'nin biyoaktif bileşiklerini tanımlamayı amaçlamıştır. Çalışma, derinlemesine araştırmalar için bir temel oluşturmaktadır.cistanche.

Tüm deneysel prosedürler, Harbin Ticaret Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.

cistancheçöl çiçeği(cd-20120227-005) ilaç pazarından satın alınmış ve Prof. Zhang Delian (Harbin Ticaret Üniversitesi) tarafından tanımlanmıştır. Dietilstilbestrol, HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD'den satın alındı. Fenol kırmızısı içermeyen RPMI1640 ve RPMI1640, HyClone Company'den (ABD) satın alındı. MTT ve DMSO'nun tümü Sigma-Aldrich Co. LLC'den (St Louis, ABD) satın alındı. İnsan meme kanseri MCF7 hücre dizisi, Yaşam Bilimleri ve Çevre Bilimleri Araştırma Merkezi (Harbin Ticaret Üniversitesi) tarafından sağlandı. Kullanılan standartlar şu şekildeydi: acteoside (111530- 200505), ekinakozid (111670-200503) ve salidrosid (110736-200628), Ulusal Farmasötik ve Biyolojik Ürünlerin Kontrolü Enstitüsü'nden (Pekin) elde edildi. , Çin). Asetonitril, metanol ve formik asit MS dereceliyken su ultra saftı. Diğer reaktifler analitik derecedeydi ve ticari olarak mevcuttu.

Ekinakozitiçindecistanchetubulosa'nın birçok etkisi vardır

2 Deneysel Prosedür

2.1 Malzemeler

Analitik kimya deneyleri ve veri işleme için Agilent 1290 HPLC sistemi, Agilent 6530 Serisi Dört Kutuplu Uçuş Süresi LC/MS (Q-TOF) sistemi ve Chemical HPLC-3D iş istasyonları kullanıldı. Numunelerin ve standartların hazırlanmasında Milli-Q ultra saf su kullanılmıştır. Ek araçlar arasında elektronik Analitik Terazi AR1140 (Ohaus International Ltd), 680 Mikroplaka Okuyucu (Bio-Rad Corporation) ve 64R Yüksek Hızlı Santrifüj (Beckman Coulter Allegra) bulunuyordu.

(12 ± 2) g ağırlığındaki olgunlaşmamış dişi Kunming fareleri (doğumdan yaklaşık 21 gün sonra, sütten kesilmiş) Changchun Ulusal Biyolojik Endüstri Üssü Laboratuvar Hayvan Merkezi'nden (Changchun, Çin) satın alındı. Fareler, yiyecek ve suya sınırsız erişimi olan, sıcaklığı ayarlı bir odaya (22 ± 2 derece) yerleştirildi. Beş günlük iklimlendirmeden sonra hayvan deneyleri başlatıldı. Fareler, test çözeltilerini uygulamadan önce suya serbest erişim ile gece boyunca aç bırakıldı. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakım ve Kullanım Kılavuzundaki tavsiyelere sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir.

2.2 Örnek çözeltinin hazırlanması

Cistanche örnekleri, Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan ve Hubei Eyaleti olmak üzere on farklı habitattan toplandı.

Cistanche örneğinin solüsyonu (1.0 g/mL), oral uygulama için distile su içinde hazırlandı. Dietilstilboestrol konsantrasyonu 20ug/mL idi ve pozitif kontrol solüsyonu olarak kullanıldı. Cistanche örneğinin solüsyonu (1.0 g/mL) yüzde 50 asetonitril içinde hazırlandı. Acteoside, echinacoside ve salidroside (her biri 2.0 mg), 10 mL yüzde 50 asetonitril çözeltisi içinde çözündürüldü. Hem numune hem de standart çözeltiler, analizden önce 0.45-μm filtre kullanılarak filtrelendi.

2.3 LC-MS koşulları

Örnekleri analiz etmek için bir Waters Simetri Kalkanı RP18 (3.9 mm×150 mm, 5μm; Waters Corporation, Milford, MA, ABD) kullanıldı. Mobil faz, asetonitril (A) ve yüzde 0.2 (h/h) formik asit sulu çözeltisinden (B) oluşuyordu ve 0.5 mL/dakikalık bir akış hızında pompalandı. Her numunenin enjeksiyon hacmi 10 μL idi. Gradyan elüsyon programı aşağıdaki gibidir: Mobil faz A yüzde 5'te başlatıldı ve lineer olarak 35 dakikada yüzde 23'e yükseltildi. A solüsyonu daha sonra yüzde 25'e yükseltildi (35 ila 65 dakika). Mobil faz A daha sonra çalışmanın son 5 dakikasında (65 ila 70 dakika) yüzde 5'e düşürüldü. Kolon sıcaklığı 30 derecede tutuldu. Kromatogramlar 254 nm'de izlendi. Atomizasyon gazı basıncı 30 psi ve kılcal voltaj 3.5 kV idi. Kuru gazın akış hızı, 30 derecelik bir sıcaklıkta 8 L/dk'ya ayarlandı. Kütle spektrumları 100- 3,000 Da tarama aralığında kaydedildi ve negatif iyon tarama modundaydı.

2.4 Parmak izi değerlendirmesi

10 farklı seriden toplanan örneklerin LC parmak izleri oluşturuldu ve TCM'nin Kromatografik Parmak İzi için Benzerlik Değerlendirme Sistemi (versiyon 2012; Çin Farmakopesi Komitesi, Pekin, Çin) kullanılarak otomatik olarak eşleştirildi. Ayrıca, medyan yöntemi kullanılarak referans kromatogram haritası oluşturulmuştur. Ayrıca, on farklı habitattan alınan örneklerin kalitesini değerlendirmek için küme analizi uygulandı.

2.5 Temel bileşen analizi (PCA)

PCA çok değişkenli bir istatistiksel yöntemdir. Veri toplamadan yeterli bilgiyi tutabilir. Bu çalışmada, LC kromatogramlarından elde edilen karakteristik pikler, PCA ile daha fazla tarandı ve spektrum-etki ilişkisine dayalı olarak aktif bileşikleri tanımlamayı amaçladı.

2.6 Rahim büyüme testi

Fareler 12 gruba ayrıldı (grup başına 10). Cistanche'den hazırlanan örnek çözeltiler, on farklı habitattan toplandı ve günde iki kez (sabah ve akşam) dört gün boyunca 30 g/kg vücut ağırlığı dozunda gavaj yoluyla uygulandı. Kör ve pozitif kontrol gruplarına eşit hacimlerde distile su ve dietilstilboestrol solüsyonu dahil edildi ve dört gün boyunca günde iki kez uygulandı. Beşinci günde, anestezi uygulanmış farelerden ilaç içeren kan örnekleri alındı. Örnekler santrifüjlendi (5,000 rpm, 10 dakika) ve süpernatanlar (ilaç içeren serum örnekleri) ayrıldı. İlaç içeren serum örnekleri, 56 derecede su banyosunda 30 dakika ısıtılarak inaktive edildi ve MTT testinden önce 0.22-μm filtreden süzüldü. Eşzamanlı olarak, farelerin rahimleri hemen kesilip çıkarıldı ve rahim ağırlık indekslerini hesaplamak için tartıldı. Beş günlük iklimlendirmenin ardından hayvan deneyleri başlatıldı. Fareler, test çözeltilerinin uygulanmasından önce suya serbest erişim ile gece boyunca aç bırakıldı. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitülerinin Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzunun tavsiyelerine sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm deneysel prosedürler, Harbin Ticaret Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Potansiyel olarak stresli tüm prosedürler sodyum pentobarbital anestezisi altında yapıldı.

2.7 MTT tahlili

MCF7 hücreleri, dört gün boyunca fenol kırmızısı olmadan (yüzde 5 CDT-FBS içeren) RPMI 1640 ile birlikte kültürlendi. Hücreler 96-yuvalı plakalara 2,000 hücre/kuyu yoğunluğunda ekildi. Yapışkan bir kültür elde edildi ve 72 saatlik kültürün ardından hücreler, Cistanche ile tedavi edilen farelerden alınan serum numunelerini içeren RPMI 1640 ortamında birlikte kültürlendi. Deneyler altı tekerrürlü olarak gerçekleştirilmiştir. Daha sonra her bir kuyucuğa 20 μL MTT solüsyonu (PBS içinde 5 mg/mL) ilave edildi ve hücreler 4 saat inkübe edildi. Ortamın uzaklaştırılmasının ardından, formazan ürününü üretmek için 150 uL DMSO ilave edildi ve plakalar, tamamen çözünmesi için karanlıkta çalkalandı. Absorbans, bir Mikroplaka Okuyucu kullanılarak 570 nm'de ölçülmüştür. Çoğalma hızı, ilaç içeren serum grubunun ortalama absorbans değerinin, boş kontrol grubunun (serumsuz RPMI 1640'ta birlikte kültürlenen hücreler) ortalama absorbans değerine bölünmesiyle hesaplandı.

2.8 İstatistiksel analiz

Boş kontrol ve deney gruplarındaki değerler arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları belirlemek için eşleştirilmiş örnek t testi (iki kuyruklu) kullanıldı. Farklılıklar yüzde 95 güven düzeyinde önemli kabul edildi (p <>

PCA, on farklı habitattan alınan örneklerin kromatogramlarındaki karakteristik pik alanlarını değerlendirmek için kullanıldı. Pik alanlarının korelasyonunu ve östrojenik aktivitelerini değerlendirmek için iki değişkenli analiz ve Gray korelasyon analizi kullanıldı. Korelasyon, SPSS istatistik yazılım istatistikleri (Windows 21 için SPSS.0, SPSS Inc., ABD) ile hesaplandı. Farklılıklar, yüzde 95 güven düzeyinde (iki uçlu) önemli kabul edildi.

Etik onay: Yapılan araştırma, insan veya hayvan kullanımı ile ilgili değildir.

cistanche acteoside'ın birçok işlevi var

3. Sonuçlar ve tartışma

3.1 Küme analizi ve benzerlik değerlendirmesi

Tutma süresinin ve karakteristik tepe noktalarının tepe alanının göreli standart sapması, kesinlik için yüzde {{0}}.58 ve 0.34, 0.52 ve {{8} idi. yeniden üretilebilirlik için yüzde },31 ve istikrar için sırasıyla yüzde {{10}}.19 ve 0.13. Bu bulgular, LC parmak izi belirleme yöntemimizin makul ve güvenilir olduğunu gösterdi. On numunenin kromatogramlarının benzerlikleri 0.9'dan büyüktü. Tüm numuneler için ortak pikler, pik kaybedilmiş olabileceğinden, Cistanche'nin karakteristik bileşenlerini tam olarak temsil edemezdi. Bu nedenle, daha doğru bir kromatogram haritası elde etmek için numune eşleştirme sayısı 26'dan 20'ye ayarlandı. Toplam 26 tepe elde edildi ve bunların alanlarının toplamı, numunedeki genel tepe alanı ile karşılaştırıldığında 0.8'den büyüktü. Bu nedenle, bu kromatografik piklerin Cistanche'nin ana kimyasal bileşenlerini etkili bir şekilde yansıtabileceği sonucuna vardık. Kümeleme analizinin sonuçları Şekil 1'de gösterilmiştir. Toplam on farklı habitat aşağıdaki gibi üç kategoriye ayrılmıştır: (A) 2, Guizhou; 3, Çinghay; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Sincan ve 6, Siçuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia ve 5, Alaşan. (C) 9, Hubei. Küme analizi eğilimi, şifalı bitkilerin yaşam alanlarının eşiğin altındayken benzer olduğunu göstermiştir. Ancak eşiğin artmasıyla, habitatların iklim ve büyüme koşulları yakındır. Kümeleme analizinin sadece farklı habitatları iyi ayırt etmekle kalmayıp, aralarındaki yakınlıkları da yansıttığını göstermektedir.

3.2 Kimyasal bileşenlerin tanımlanması

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Öz yükünün mutlak değeri ne kadar yüksek olursa, bileşiklerin östrojenik endeksler üzerindeki etkisi o kadar yüksek olur.

Cistanche kromatogramları ve standart numuneler, aynı LC-MS koşulları altında ayrı bileşenleri tanımlamak için karşılaştırıldı. Tablo 1'de gösterildiği gibi, saklama süresine ve MS verilerine [24-26] dayalı olarak toplam 26 bileşen tanımlanmıştır. Geleneksel Çin tıbbı terapötik bir rol oynamak için bir karışım şeklinde olduğundan, aktif maddeler monomerler yerine karışımlar şeklinde ağızdan verilir. Tek tek ayrıldıktan sonra tek bir bileşiğin rol oynadığı görülmedi. Amacımız, Cistanche'nin [23-30] bilinen bileşenlerinde östrojenik aktiviteye sahip olan ve bu nedenle kimliklerini doğrulamak için NMR ve diğer teknik araçları seçmeyen bileşikleri ortaya çıkarmaktır. Zirve 1, geniposidik asidin elementel bileşimi ile aynı olan 373 (C16H22O10) m/z oranına sahip baskın bir protonsuz iyonu gösterdi. Bu, 211'lik bir m/z oranına sahip bir fragman iyonu veren bir glikoz parçasının kaybıyla desteklenmiştir. Tepe 2, elemental bileşim ile aynı olan 461 (C20H30O12) m/z oranına sahip baskın bir protondan arındırılmış iyonu göstermiştir. 315 m/z oranı ile bir parçalanma oluşturan bir ramnosil parçasının kaybı ile desteklenmiştir. Zirve 4, 375'lik bir m/z oranıyla (C16H24O10) baskın bir protondan arındırılmış iyonu göstermiştir. 8-epiloganik asidin elementel bileşimi. 213'lük bir m/z oranıyla bir parçalanma oluşturan bir glikoz parçasının kaybı, çıkarımı daha da destekledi. Zirve 6, m/z oranı 607 (C29H36O14) olan baskın bir protonsuz iyonu gösterdi; bu, syringalide A3'- - l-rhamnopiranosidin temel bileşimiyle aynıydı.

445'lik bir m/z oranına sahip bir parça iyon oluşturan bir kaf parçasının kaybı, çıkarımı daha da destekledi. Zirve 8, sistanoside A'nın elementel bileşimi ile aynı olan, m/z oranı 799 (C36H48O20) olan baskın bir protonsuz iyonu gösterdi. Bir caff parçasının kaybı, m/z oranı 637 olan bir fragman iyonu oluşturdu, çıkarımı daha da desteklemiştir. Zirve 11, m/z oranı 487 (C21H28O13) olan baskın bir protonsuz iyonu gösterdi; bu, cistanosid F'nin elemental bileşimiyle aynıydı. Bu, m/z'li bir parça iyon veren bir ramnosil parçasının kaybıyla desteklendi. 341 oranı ve başka bir caff parçasının kaybı, m/z oranı 179 olan bir fragman iyonu oluşturdu ve çıkarımı daha da destekledi. Zirve 12, m/z oranı 813 (C37H50O20) olan baskın bir protonsuz iyonu gösterdi ve bu, sistanoside B'nin temel bileşimiyle aynıydı. Bir glikoz parçasının kaybı, m/z oranı 651 olan bir parça iyonu oluşturdu. çıkarımı daha da desteklemiştir. Zirve 13, tübülozit A'nın temel bileşimi ile aynı olan 827 (C37H48O21) m/z oranına sahip baskın bir protonsuz iyonu gösterdi. Bir ramnosil parçasının kaybı, 681'lik bir m/z oranı ile bir parçalanma oluşturdu, ayrıca çıkarımı destekledi. Zirve 14, m/z oranı 637 olan (C30H38O15) baskın bir protonsuz iyonu gösterdi; bu, cistanosid C'nin temel bileşimiyle aynıydı. Bir ramnosil parçasının kaybı, m/z oranı 491 olan bir fragman iyonu oluşturdu, çıkarımı daha da desteklemiştir.

Zirve 15, osmanthusid B'nin temel bileşimi ile aynı olan 591 (C29H36O13) m/z oranına sahip baskın bir protonsuz iyonu gösterdi. Bir ramnosil parçasının kaybı, m/z oranı 445 olan bir fragman iyonu oluşturdu, çıkarımı daha da desteklemiştir. Tepe 16, asteositin temel bileşimi ile aynı olan 623 (C29H36O15) m/z oranına sahip baskın protonsuz bir iyonu gösterdi. Bir kaf parçasının kaybı, m/z oranı 461 olan bir fragman iyonu oluşturdu,çıkarımı daha da desteklemiştir. Zirve 18, izoakteositin temel bileşimiyle aynı olan 623 (C29H36O15) m/z oranına sahip baskın protonsuz bir iyonu gösterdi. Bir kaf parçasının kaybı, ön pik15, osmanthusid B'nin elementel bileşimi ile aynı olan 591 (C29H36O13) m/z oranına sahip baskın bir protonsuz iyonu gösterdi. Bir ramnosil parçasının kaybı, m/z oranı 445 olan bir fragman iyonu oluşturdu. çıkarımı destekledi. Tepe 16, asteositin temel bileşimi ile aynı olan 623 (C29H36O15) m/z oranına sahip baskın protonsuz bir iyonu gösterdi. Bir caff parçasının kaybı, 461'lik bir m/z oranına sahip bir fragman iyonu oluşturdu ve çıkarımı daha da destekledi. Pik 17, cis-acteoside elementel bileşimi ile aynı olan 623 (C29H36O15) m/z oranına sahip baskın bir protonsuz iyonu gösterdi. Bir kaf parçasının kaybı, bir parça oluşturdu.461 m/z oranına sahip da fragman iyonu, çıkarımı daha da destekledi. Pik 21, kampneosidin Ⅰ elementel bileşimi ile aynı olan 653 (C30H38O16) m/z oranına sahip baskın bir protonsuz iyonu gösterdi.

Bir caff parçasının kaybı, m/z oranı 491 olan bir fragman iyonu oluşturdu ve başka bir ramnosil parçasının kaybı, 345'lik bir m/z oranına sahip bir fragman iyonu oluşturdu ve bu da çıkarımı daha da destekledi. Pik 22, m/z oranı 665 (C31H38O16) olan baskın bir protonsuz iyonu gösterdi ve bu, tubulosit B'nin elementel bileşimiyle aynıydı. Bir CH3CO parçasının kaybı, m/z oranı 623 olan bir fragman iyonu oluşturdu, ve başka bir caff parçasının kaybı, 461'lik bir m/z oranına sahip bir fragman iyonu oluşturmuş ve bu da çıkarımı daha da desteklemektedir. Tepe 23, kampneosidin temel bileşimi ile aynı olan 639 (C29H36O16) m/z oranına sahip baskın protonsuz bir iyonu gösterdi. Bir ramnosil parçasının kaybı, 493'lük bir m/z oranına sahip bir fragman iyonu oluşturdu, çıkarımı daha da destekledi. Zirve 24, 2'-asetillaktosidin elementel bileşimi ile aynı olan 665 (C31H38O16) m/z oranına sahip baskın protonsuz bir iyonu gösterdi. Bir Ac parçasının kaybı, m/z oranı 623 olan bir fragman iyonu oluşturdu ve başka bir caff parçasının kaybı, m/z oranı 461 olan bir fragman iyonu oluşturdu ve bu da çıkarımı daha da destekledi. Pik 25, m/z oranı 445 (C20H30O11) olan ve cistanosid G'nin temel bileşimiyle aynı olan baskın protonsuz bir iyonu gösterdi. Bir ramnosil parçasının kaybı, m/z oranı 299 olan bir fragman iyonu oluşturdu, çıkarımı daha da desteklemiştir. Bileşiklerin yapıları Şekil 2'de listelenmiştir.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Bu pikler şu şekildeydi: 9, 12, 14 ve 15. Sonuç olarak, östrojenik aktivite için temsili değişkenler olarak toplam 4 pike karşılık gelen ekinakozit, cistanosid B, osmanthusid B ve acteoside seçildi (Şekil 3).

.

3.4 Östrojenik aktivitenin belirlenmesi

Rahim ıslak ağırlığının her farenin vücut ağırlığına oranı hesaplandı (Şekil 4). Dokuz habitattan Cistanche'ye maruz kalan hayvanlar, boş kontrol grubundaki farelere kıyasla uterus ağırlıklarını artırarak önemli östrojenik aktiviteler sergilediler. Şekil 4 ayrıca Cistanche ile tedavi edilen farelerin serumu ile tedavi edilen MCF7 hücrelerinin çoğalma hızını gösterir. On habitattan Cistanche uygulanan farelerin serumları ile tedavi edilen hücreler, tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek büyüme sergilemiştir.

3.5 İki değişkenli analiz

Bu çalışmada, olgunlaşmamış dişi Kunming farelerinin rahim ağırlıklarının arttığını ve MCF7 insan meme kanseri hücrelerinin çoğalmasının desteklendiğini gözlemledik. Bu bulgular, Cistanche'nin östrojenik aktivitesini doğruladı. Şekil 5, bu bileşenlerin uterus indekslerini ve MCF7 hücre proliferasyon oranlarını gösterdi. Numunelerin östrojenik aktivitesine karşılık gelen nispi pik alanlarını hesaplamak için Pearson korelasyon katsayısı kullanıldı. 0.3'ten yüksek korelasyon katsayıları anlamlı kabul edilirken (p < 0.05),="" 0.5'ten="" yüksek="" korelasyon="" katsayıları="" yüksek="" düzeyde="" anlamlı="" kabul="" edildi="" (p="">< 0.05)="">< 0.01).="" sonuçlara="" dayanarak,="" cistanche'nin="" östrojenik="" aktiviteye="" sahip="" olduğu="">

Toplam dokuz bileşik, rahim ağırlığındaki artışla (p < {{0}}.05)="" önemli="" ölçüde="" ilişkiliyken,="" on="" bileşik="" mcf7="" hücresel="" proliferasyonu="" ile="" önemli="" ölçüde="" ilişkiliydi="" (p="">< 0.05).="" rahim="" ağırlığı="" ve="" hücre="" proliferasyonu="" ile="" önemli="" ölçüde="" ilişkili="" olan="" bileşikler,="" 8-epiloganik="" asit,="" salidrosid,="" syringalide="" a3'-="" -="" l-rhamnopyranoside,="" cistanoside="" a,="" cistanoside="" b,="" cistanoside="" c,="" osmanthusid="" b,="" acteoside,="" isoacteoside,="" tubuloside="" idi.="" b,="" 2'-acetylacteoside="" ve="" iki="" bilinmeyen="" bileşik="" (şekil="" 5).="" bu="" on="" üç="" bileşik,="" östrojenik="" aktiviteler="">

3.6 Gri korelasyon analizi yöntemi

Şekil 6, 26 bileşiğin karakteristik piklerinin rahim indeksleri ile nispi korelasyonunu gösterir ve Şekil 7, 26 bileşiğin karakteristik piklerinin hücre proliferasyon oranları ile nispi korelasyonunu gösterir. Toplam üç bileşik, rahim indeksleri ile en yüksek korelasyonu sergiledi, yani 8-epiloganik asit, cistanosid F ve asteosit (azalan sırada Şekil 6); MCF7 hücre proliferasyonu ile en yüksek korelasyon sergileyen altı bileşik ise ekinakozit, cistanosid F, cistanosid B, osmanthusid B, izoacteoside ve tubulosit B idi (Şekil 7, azalan sırada). Ekinakozid, osmanthusid B, acteoside ve isoacteoside'ın nispi korelasyonları 0.5'ten daha yüksekti.

3.7 LC-MS koşullarının optimizasyonu

Daha iyi bir kromatogram haritası elde etmek için metanol ve asetonitril karşılaştırıldı. Son olarak, sulu formik asit (0.2 yüzde, v/v) - asetonitril kombinasyonu, ayırma için en iyi mobil fazdı. 200-400nm tam dalga boyu tarama aralığında, 254nm optimal olarak seçildi. Ayrıca MS parametreleri de iyileştirildi. Negatif iyon tarama modu, Cistanche'deki çoğu bileşenin tepki değerlerini iyileştirdiği için seçildi.

4. Sonuç

Cistanche'nin östrojenik aktif bileşenlerini tanımlamak için LC-Q-TOF-MS teknolojisi kullanıldı. Bu çalışma, 8-epiloganic acid, salidroside, syringalideA3'- -l-rhamnopyranoside, cistanoside A, echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, cistanoside C, osmanthuside B, acteoside, isoacteoside, tubuloside 2'-acetylacteoside ve bilinmeyen iki bileşik, Cistanche'nin ana aktif bileşenleriydi. Bununla birlikte, bu bulgular, bileşenlerin in vivo etkilerini ve etki mekanizmalarını araştırmak için daha fazla çalışma gerektirir.

cistancheActeoside, bağışıklık sistemini güçlendirmek gibi birçok işleve sahiptir.

Teşekkür:

Bu proje Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81073015), Heilongjiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZD2017014) ve Heilongjiang Eyaletindeki Kolejin Genç yenilikçi yetenek eğitim planı (UNPYSCT-2017209) tarafından desteklenmiştir. . Yazarlar, bu makalenin yayınlanmasıyla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Referanslar

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fitokimya, farmakoloji , kalite kontrol ve Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: Bir inceleme, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Entegre ve global pseudotargeted metabolomik strateji uygulandı Citrus TCM'lerin kalite kontrol belirteçleri için taramaya, Anal. Biyoanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Parmak İzi-ROC-SVM " Geleneksel Çin Tıbbı Enjeksiyonlarının Kalite Analizine Uygulanan Strateji: Bir Vaka Çalışması Olarak KuDieZi Enjeksiyonunun Kullanılması, Molecules., 2017, 22(7). Kişisel Bilgiler: E1237.

[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Ultra yüksek performans arasındaki ilişkiye dayalı QiShenYiQi damlayan hapların biyoaktif kalite kontrol belirteçlerinin taranması sıvı kromatografi parmak izi ve vasküler koruyucu aktivite, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Çin tıbbının kalite kontrolünde çok değişkenli istatistiksel analiz ve düşüncenin uygulanması, Zhongguo. Zhong. Evet. Za. Zhi., 2014, 39 (21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Dai J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS odaklı karakteristik bileşen verileri karmaşık TCM müstahzarlarının bütünsel kalite kontrolü için set ve kemometrik analiz: Örnek olarak Niuhuang Shangqing hapı, J. Pharm. Biyomedikal. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, Yüksek Negatif Tahmin Değeri, Düşük Prevalans ve Spektrum Etkisi: Yorumda Dikkat, Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Euodia rutaecarpa'da Hepatotoksik Bileşenlerin Taranması Spektrum-Toksisite İlişkisine Dayalı UHPLC-QTOF/MS, Molecules., 2017, 22(8). Kişisel Bilgiler: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Evodia rutaecarpa'da spektrum-etki ilişkisine ve UPLC-Q-TOFMS'ye dayalı hepatotoksik bileşenin taranması ve tanımlanması, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Screening Test Performance for Screening Test Performance Amnestik Hafif Bilişsel Bozukluk: Klinik Etkiler Nelerdir?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Geleneksel Çin tıbbı araştırmalarına sistematik bir yaklaşım olarak Spektrum-etki ilişkileri: mevcut durum ve gelecek perspektifleri, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., UPLC parmak izleri ile Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) ham ikincil köklerinin biyoaktiviteleri ve mitokondriyal büyüme üzerindeki üç işlenmiş ürününün kanonik korelasyon analizi ile birleştiğinde spektrum-etki ilişkileri, J. Ethnopharmacol., 2014,153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Kimyasal Parmak İzleri Arasındaki Spektrum-Etki İlişkileri Lonicerae Japonicae Flos ve Lonicerae Flos Base'in UPLC ve Mikrokalorimetri Üzerine Antibakteriyel Etkileri, Ön. Eczacılık., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Risk tahmini, tarama ve tanı testlerinde spektrum etkisi, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Spektrumla Flos Sophorae'deki toplam flavonoidlerin ısıtma ürünlerinden yeni hemostatik bileşiklerin izlenmesi -etki ilişkileri ve kolon kromatografisi, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Da-Huang-Fu- UHPLC-ESI-Q-TOF-MS yöntemiyle sıçanlarda Zi-Tang, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Rhizoma Rhei, korteks Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus ve formüllerinin spektrum etkisi ilişkisi üzerine çalışma, J. Chromatogr. Bilim, 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Yumurtalıkları alınmış sıçanlarda ekinakozidin antiosteoporotik aktivitesi, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Cistanche tubulosa'nın tip 2 diyabetik DB/DB farelerinde anti-hiperglisemik ve hipolipidemik etkileri, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., Acylated feniletanoid glikozitler Cistanche tubulosa kaynaklı echinacoside ve acteoside, farelerde glukoz toleransını geliştirir, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Tarim çölünde yetiştirilen Cistanche Deserticola'nın gövdelerinden elde edilen anti-inflamatuar aktivitelere sahip Phenylethanoid glikozitler, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Cistanches Herba'nın diyot dizisi tespiti ve yüksek- kemometrik yöntemlerle birleştirilmiş çözünürlük kütle spektrometrisi, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Yapısal karakterizasyon ve feniletanoid glikozitlerin Cistanches Deserticola YC Ma'dan tanımlanması UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Lagotis brevituba Maxim, Phytother'dan İzole Edilen Fenilpropanoidlerin Antiproliferatif Aktivitesi . Araş., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Geniş polarite ve içerik aralıklarına sahip bileşenlerin eşzamanlı belirlenmesi Seri bağlı ters faz-hidrofilik etkileşim kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi kullanılarak Cistanche tubulosa, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Farklı parçaların ayrımı için 1H NMR tabanlı metabolomiklerin uygulanması ve Cistanche Deserticola için yeni bir işleme iş akışının geliştirilmesi, Acta. Eczacılık Günah. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Taze Cistanche tubulosa'nın bileşenleri ve biyoaktivitesi üzerine çalışmalar, Ph.D. tez, Shenyang Eczacılık Üniversitesi, Shenyang, Çin, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., İnsan veya sıçan bağırsak bakterileri veya in vitro olarak kullanılan bağırsak enzimi tarafından üretilen acteosidin metabolik profili UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Ekinakozit ve akteozit metabolitlerinin Cistanche tubulosa'dan sıçan plazması, safrası, idrarı ve dışkısına dayalı sistematik karakterizasyonu UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi/ dört kutuplu uçuş süresi tandem kütle spektrometrisi, Rapid. Komün. Kütle Spektromu., 2017(4), 371-380.