Salgılanan Nötrofil Jelatinazla İlişkili Lipokalin, ADPKD Hücrelerinin Kist Genişlemesini, Salgılanmayan Formla Karşılaştırıldığında Daha Güçlü Engelleme Yeteneği Gösteriyor Ⅲ

3.4. mNGAL'in 3D Kültürde 2L3 Hücrelerinin Kist Oluşumu Üzerine Etkileri

Hücre çoğalması2L3 farelerinde anormal şekilde artar ve kist oluşumuna ve büyümesine yol açar [17]. mNGAL'in inhibe ettiği önceki sonuçlara dayanarak2D kültürde 2L3 hücre çoğalması(Şekil 3), mNGAL'in 2L3 hücrelerinde kist oluşumunu daha da inhibe edebileceğini tahmin ettik. mNGAL'in 2L3 hücrelerinde kist oluşumunu engelleyip engellemediğini araştırmak için Matrigel ile kist oluşumu için uygun bir ortam sağlayan bir 3 boyutlu kültür platformu kurduk (Şekil 6). Hücreler, önceden oluşturulmuş Matrigel'in üzerine gece boyunca 96-kuyucuklu plakalara (1000 hücre/kuyucuk) ekildi. Hücreler jele bağlandıktan sonra sandviç benzeri bir desen oluşturmak için hücrelere daha fazla Matrigel eklendi (Şekil 6A). Hücreler kist oluşturmak için en az 5 gün boyunca 37 ◦C ve %5 CO2'de 3 boyutlu kültürde tutuldu. 3D kültürdeki kistler, uzun bir kültür süresiyle daha da büyüdü(Şekil 6B). 3D kültürde gözlemlenen küresel yapıların lümenli kistler olduğunu doğrulamak için bunları sırasıyla hücre çekirdeklerini, hücre-hücre yapışmasını ve apikal membranı tanımlamak üzere DAPI ve E-kadherin ve aktin antikorlarıyla sabitledik ve boyadık. 3D kültürde 2L3 kistin üstten (katman 1) ortaya (katman 5) kadar farklı optik z bölümleri konfokal mikroskopi ile gözlendi ve küresel kist içinde lümen doğrulandı (Şekil 6C, Ek malzeme)

Fare NGAL (NP_032517.1) ve insan NGAL (NP_005555.2) sırasıyla 200-aa ve 198-aa proteinleridir ve her ikisi de bir {{6'ya sahiptir }} NGAL proteininin N terminalinde yer alan salgılama için bir sinyal peptidi (Şekil 7A). Dizi karşılaştırması, fare NGAL'si ile insan NGAL'i arasında %62 özdeşlik ve %80 pozitiflik gösterdi. Fare NGAL'inin, aa 81 ve 85'te asparajin üzerinde iki N-bağlantılı glikozilasyon bölgesine (Asn, N) sahip olduğu gösterilirken, insan NGAL'inin aa 85'te bir bölgeye sahip olduğu (Şekil 7A) posttranslasyonel modifikasyonda aralarındaki farkı ortaya koymaktadır.

Şekil 7. pN + LS ve pN - LS ile transfeksiyonun 2L3 hücrelerinde NGAL ekspresyonu ve hücre proliferasyonu üzerindeki etkileri. (A) Fare NGAL (NP{_032517.1) ve insan NGAL (NP_005555.2) proteinlerinin hizalanması. 20-aa sinyal peptidleri mavi renkle gösterilmiştir. Fare NGAL'inin aa 81 ve 85'inde Asn (N) üzerinde ve insan NGAL'inin aa 85'inde bir tanesinde rapor edilen iki N-bağlantılı glikozilasyon bölgesi bir yıldız işareti (*) ile işaretlenmiştir. Kimlikler: düz çizgi; pozitifler: eşleştirilmiş noktalar. Yukarıdaki dizi bilgisi Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) web sitesindeki BLASTP programından alınmıştır. (B) pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd vektöründe salgılanan Igκ lider dizisinin (pN + LS) olduğu veya (pN − LS) olmadığı bir mNGAL diyagramı oluşturun. (C) Jel ​​elektroforezinin sonucu, NheI ve NotI tarafından sindirilen pN + LS (647 bp) ve pN - LS (587 bp) yapısını doğruladı. (D) Enfeksiyonun zaman çizelgesi ve pN + LS ile 2L3 hücrelerinin seçimive sırasıyla pN - LS. 2L3 hücreleri, 1. günde 6a kuyucuklu plakada pN + LS veya pN - LS ile enfekte edildi. Blastisidin ile seçim 2. günde başladı ve ortam, her 3 günde bir değiştirildi. Bir hafta boyunca seçimden sonra hücreler RT-QPCR, western blot ve ELISA ile analiz edilmek üzere toplandı. (E) 2. Günde pN + LS ve pN - LS'nin transfeksiyon verimliliğini incelemek için raportör eGFP ifadesinin saptanması. Hücrelerin yaklaşık %10'una GFP yapısı bulaştı. Ölçek çubuğu: 50 µm. RT – qPCR sonuçları, pN + LS ve pN - LS'nin her ikisinin de kontrol grubuyla karşılaştırıldığında daha yüksek Lcn2 (toplam NGAL seviyesini temsil eden) (F) ve c-myc (transfekte eksojen NGAL seviyesini temsil eden) (G) ekspresyonuna sahip olduğunu gösterdi. (H) Gruplar arasında Slc22a17 (NGAL-R) açısından anlamlı bir fark yoktu. RQ: bağıl niceliklendirme=2−∆∆Ct; Her numunenin iç kontrolü olarak Gapdh kullanıldı. Değerler kontrol grubuna normalize edildi. (I) Western blot sonuçları, pN + LS ve pN - LS'nin, kontrol grubuna göre daha yüksek NGAL ekspresyonuna sahip olduğunu gösterdi. (J) ELISA, pN + LS ve pN - LS hücrelerinin her ikisinin de olduğunu gösterdikontrol grubuna göre önemli ölçüde daha yüksek NGAL salgılarken, pN - LS hücrelerinin salgılanan NGAL miktarı pN + LS hücrelerine göre önemli ölçüde daha azdı. (K) BrdU birleşimi, pN + LS ve pN - LS hücrelerinin kontrol grubuna göre daha düşük hücre çoğalma oranına sahip olduğunu, pN - LS hücrelerinin ise pN + LS hücrelerinden daha yüksek olduğunu gösterdi. İki grup arasındaki anlamlılığı belirlemek için Öğrenci t testi yapıldı (RT–qPCR ve ELISA'da n=3, western blot ve BrdU birleşiminde n=4). *p < 0.05; ** p < {{10}}.01; *** her grupta p < 0,001 ve 2L3; # p < 0,05; ### p < 0,001 vs. pN + LS grubu; ns: anlamlı bir fark yok.

Bu çalışmada, eksojen mNGAL proteininin artan salgılanmasını sağlamak için mNGAL'in orijinal sinyal peptidi yerine bir fare Igκ zinciri lider dizisi (LS) [44] kullandık. Salgılanan veya salgılanmayan NGAL'i aşırı ifade etmek için, pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd vektörlerinde LS'li veya LS'siz NGAL, yani pN + LS ve pN − LS kullanılmış ve Şekil 7B'de gösterilmiştir. İki proteinin, NGAL-c-myc-His6 ve eGFP'nin bağımsız ekspresyonunu yönlendirmek için iki promoter, pCMV ve hPGK kullanıldı. Yapının yerleştirilmesini sağlamak amacıyla, iki plazmidi sindirmek için Nhel ve NotI kullanıldı ve jel elektroforezi sonuçları, pN + LS'den bir 647-bp bandı ve pN − LS'den bir 587-bp bandı gösterdi. (bir 60-bp lider dizisinin bulunmamasından dolayı) (Şekil 7C).

pN + LS ve pN-SP'nin 2L3 hücrelerine enfeksiyonu için hücrelere polibren ve lentivirüs eklendi ve 37 °C'de 24 saat inkübe edildi, ardından blastisidin ile seçim yapıldı (Şekil 7D). GFP ekspresyonunun tespiti enfeksiyondan sonra floresan mikroskobu ile gerçekleştirildi (Şekil 7E). Enfekte olmuş hücreler, NGAL ekspresyonu seviyesini analiz etmek için RT-qPCR, western blot ve ELISA için blastisidin seçiminden bir hafta sonra toplandı (Şekil 7F-J). RT–qPCR sonuçları, 2L3 hücrelerinin pN + LS ve pN − LS ile enfeksiyonunun, toplam seviyelerini temsil eden Lcn2 (Şekil 7F) ve Lcn2-c-myc (Şekil 7G) ekspresyonunun artmasına yol açtığını gösterdi. ve eksojen NGAL sırasıyla, Slc22a17 (NGAL-R) ekspresyonu seviyelerinde ise herhangi bir fark yoktu (Şekil 7H). Western blot sonuçları, pN + LS ve pN - LS hücrelerinin, kontrol 2L3 hücrelerine göre daha yüksek düzeyde hücre içi NGAL ekspresyonuna sahip olduğunu gösterdi (Şekil 7I). Hücre süpernatantı için ELISA sonuçları, pN + LS ve pN - LS hücrelerinin her ikisinin de, 2L3 hücre kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha yüksek düzeyde salgılanan NGAL'ye sahip olduğunu gösterdi (Şekil 7J). Ek olarak, pN - LS hücreleri tarafından salgılanan NGAL miktarı, pN + LS hücreleri tarafından salgılanandan önemli ölçüde daha azdı (Şekil 7J), iki grup da benzer NGAL ekspresyon seviyelerine sahipti (Şekil 7I). Bu bulgu, bir sinyal peptidi (pN - LS) olmadan NGAL'in aşırı ekspresyonunun, yüksek düzeyde hücre içi NGAL varlığına rağmen NGAL salgılanmasını sınırladığı yönündeki öngörümüzü destekledi. Salgılanmayan NGAL yerine salgılanan NGAL'in hücre proliferasyonunu inhibe edip etmediğini araştırmak için bir BrdU birleştirme tahlili yapıldı; bu, pN + LS ve pN - LS hücrelerinin kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha düşük proliferasyona sahip olduğunu gösterdi (Şekil 7K). Ek olarak, pN - LS hücreleri, pN + LS hücrelerine göre önemli ölçüde daha yüksek çoğalmaya sahipti (Şekil 7K). Bu sonuçlar, hücre proliferasyonunu inhibe etmek için 2L3 hücrelerinden NGAL salgılanmasının gerekli olduğunu gösterdi.

3.6. 2L3 Hücrelerinde Sinyal Yollarına Yol Açan Zihinsel Aşırı İfadenin Etkileri

mNGAL'in 2L3 hücrelerinde ERK ve AKT yollarını inhibe edebildiğini (Şekil 4) ve hücre çoğalmasını (Şekil 3) ve kist büyümesini (Şekil 6) daha da azaltabildiğini gösteren önceki sonuçlarımıza dayanarak, ERK ve AKT'nin olup olmadığını analiz etmek için western blotlamayı kullandık. pN + LS ve pN - LS hücrelerinde yollar etkilendi (Şekil 8). Western blot sonuçları, pN + LS ve pN - LS gruplarının p-ERK (T202/Y204)/ERK oranının kontrol grubuna göre anlamlı derecede düşük olduğunu ve pN - LS grubunun p-ERK oranının daha yüksek olduğunu gösterdi. (T202/Y204)/ERK, pN + LS grubuna göre daha yüksektir (Şekil 8A). p-AKT (S473)/AKT oranı pN + LS grubunda kontrol grubuna göre daha düşüktü, pN - LS hücreleri ise kontrol ve pN + LS gruplarındakilerden önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 8B). p-CREB (S133)/CREB oranı pN - LS grubunda pN + LS grubuna göre anlamlı derecede yüksekti, ancak ne pN + LS ne de pN - LS kontrol grubuna göre anlamlı bir fark göstermedi (Şekil 8C). Bu sonuçlar, pN + LS ve pN - LS'nin p-ERK/ERK oranında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklara sahip olduğunu (Şekil 8A), pN + LS grubunun ise AKT (Şekil 8B) ve CREB'de daha iyi bir etki göstermediğini gösterdi (Şekil 8A). Şekil 8C) aktivasyonu.

mNGAL uygulamasının 2L3 hücrelerinde apoptozu (Şekil 3) ve otofajiyi indükleyebildiğini (Şekil 5), hücre çoğalmasını (Şekil 3) ve kist büyümesini (Şekil 6) azaltabildiğini gösteren önceki sonuçlara göre, apoptoz üzerindeki etkisini araştırmak için western blot yöntemini kullandık. ve pN + LS ve pN - LS hücrelerinde otofaji (Şekil 9). Western blot sonuçları, pN + LS hücrelerinin, kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha yüksek bölünmüş-/pro-kaspaz-3 (Şekil 9A) ve bölünmüş-/pro-PARP (Şekil 9B) oranına sahip olduğunu gösterdi; pN - LS hücreleri, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında bölünmüş-/pro-kaspaz-3 (Şekil 9A) ve bölünmüş-/pro-PARP (Şekil 9B) oranında ve bölünmüş-/pro-PARP oranında anlamlı bir fark göstermedi. /pro-caspase-3, pN + LS grubundakilerden önemli ölçüde düşüktü (Şekil 9B). Bu sonuçlar, salgılanmayan NGAL yerine salgılanan NGAL'in aşırı ekspresyonunun, 2L3 hücrelerinde apoptozu indüklediğini gösterdi.

Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında pN + LS hücrelerinde daha yüksek bir LC3B II/LC3B I oranı (Şekil 9C) ve daha düşük bir p62/GAPDH oranı (Şekil 9D) tanımlandı; pN - LS hücrelerinin, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında LC3B II/LC3B I (Şekil 9C) ve p62/GAPDH (Şekil 9D) oranında anlamlı bir farkı yoktu ve LC3B II/LC3B I oranı, gruptakinden önemli ölçüde düşüktü. pN + LS grubu (Şekil 9C). Bu sonuç, salgılanmayan NGAL yerine salgılanan NGAL'in aşırı ekspresyonunun, 2L3 hücrelerinde otofajiyi tetiklediğini ortaya çıkardı.

3.7. mNGAL'in Aşırı Ekspresyonunun 3D Kültürde 2L3 Hücrelerinin Kist Oluşumu Üzerindeki Etkileri

mNGAL'in sırasıyla 2D ve 3D kültürde 2L3 hücre proliferasyonunu ve kist büyümesini inhibe ettiği önceki sonuçlara dayanarak (Şekil 3 ve 6), salgılanan NGAL'in aşırı ekspresyonunun, hücre proliferasyonunu inhibe ederek 2L3 hücrelerinin kist büyümesini daha da inhibe edebileceğinden şüphelendik (Şekil 3 ve 6). Şekil 7K).

2L3 hücrelerinde NGAL aşırı ekspresyonunun kist oluşumu üzerindeki etkilerini araştırmak için 2L3 kontrolü, pN + LS ve pN - LS hücreleri, kist oluşumunu tetiklemek için 1-3. Günlerde forskolin ile tedavi edildi. Kist çapları, alanı ve sayıları forskolin indüksiyonundan sonra günlük olarak ölçüldü (Şekil 10A). 3D kültürdeki 2L3 kontrolü, pN + LS ve pN - LS hücrelerinin kistleri, kültür günlerine bağlı bir şekilde büyüdü (Şekil 10B) ve 4. günden 8. güne kadar kist boyutunda belirgin farklılıklar gösterdi. pN + LS grubunda 4. günden 8. güne kadar kontrol grubuna göre kist çapları (Şekil 10C) ve alanları (Şekil 10D) önemli ölçüde daha küçükken, pN - LS grubu 6. ve 8. günlerde kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha küçük kist çaplarına sahipti (Şekil 10C). Kontrol ve pN – LS grupları arasında kist alanı açısından anlamlı bir fark yoktu. Ek olarak pN - LS grubu 8. Günde pN + LS grubuna göre önemli ölçüde daha büyük kist çaplarına ve alanlarına sahipti (Şekil 10C, D). Kontrol, pN + LS ve pN - LS hücreleri (Şekil 10E) arasında kist sayısı artış oranında anlamlı bir fark olmamasına rağmen, pN + LS ve pN - LS gruplarının her ikisi de önemli ölçüde daha düşük büyük (çap > 4 ila 8. Günler arasında kontrol grubuna göre (Şekil 10F) kistler (Şekil 10F). Bu sonuçlar, pN + LS ve pN - LS'nin her ikisinin de kist büyümesini inhibe ettiğini, pN - LS'nin inhibitör etkisinin ise pN + LS'ninkinden daha zayıf olduğunu gösterdi. . Bu bulgu, salgılanan mNGAL'in aşırı ekspresyonunun, 3D kültürde 2L3 hücrelerinin kist büyümesini engelleme konusunda, salgılanmayan mNGAL'e göre daha üstün bir yeteneğe sahip olduğunu ortaya çıkardı.

-Gruplar (n=3) arasındaki anlamlılığı belirlemek için bir test yapıldı. * p < 0.05; *** p < 0.001 ve kontrol grubu; # p < 0,05 vs. pN + LS grubu

kaspaz{{0}} (A) ve bölünmüş-/pro-PARP (B), salgılanan mNGAL tarafından apoptozun indüksiyonunu temsil eden kontrol grubuna göre. pN - LS hücreleri, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında bölünmüş-/pro-kaspaz-3 ve bölünmüş-/pro-PARP oranında anlamlı bir fark göstermedi. pN + LS hücreleri, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında daha yüksek bir LC3B II/LC3B I (C) oranına ve daha düşük p62 (D) oranına sahipti. pN −LS hücrelerinin LC3B II/LC3B I ve p62 oranında kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı bir farkı yoktu. Her numunenin iç kontrolleri olarak Tubulin, Vinculin ve GAPDH kullanıldı. Değerler kontrol grubuna normalize edildi. Gruplar (n=3) arasındaki anlamlılığı belirlemek için student's t testi yapıldı. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001, kontrol grubuna göre; # p < 0,05; ## p < 0,01 vs.pN + LS grubu.

Şekil 9. mNGAL proteininin aşırı ekspresyonunun 2L3 hücrelerinde apoptoz ve otofaji üzerindeki etkileri. Western blot sonuçları, pN + LS hücrelerinin, apoptozun indüksiyonunu temsil eden, kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha yüksek bölünmüş-/pro-kaspaz-3(A) ve bölünmüş-/pro-PARP (B) oranına sahip olduğunu gösterdi. mNGAL tarafından salgılanır. pN −LS hücrelerinin bölünmüş-/pro-kaspaz-3 ve bölünmüş-/pro-PARP oranında kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı bir fark yoktu. pN + LS hücreleri, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında daha yüksek bir LC3BII/LC3B I (C) oranına ve daha düşük p62 (D) oranına sahipti. pN - LS hücrelerinde, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında LC3B II/LC3B I ve p62 oranı açısından anlamlı bir fark yoktu. Her numunenin iç kontrolleri olarak Tubulin, Vinculin ve GAPDH kullanıldı. Değerler kontrol grubuna normalize edildi. Gruplar arasındaki anlamlılığın belirlenmesi için student's t-testi yapıldı.

(n{{0}}). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001, kontrol grubuna göre; # p < 0,05; ## p < 0,01 vs. pN + LS grubu