Sirtuins Modülasyonu: HIV ile İlişkili Nörobilişsel Bozukluklar İçin Umut Verici Bir Strateji Bölüm 1

Soyut:

HIV ile ilişkili nörobilişsel bozukluk (HAND), bu popülasyonun %40'ında devam ettiği için en büyük endişelerden biridir. Günümüzde EL nöropatogenezinin, beyin-kan bariyerini geçen ve hücresel süreçlerin bozulmasına yol açacak şekilde nöronlara salgılanıp içselleştirilebilen viral proteinler üreten enfekte hücrelerden kaynaklandığı düşünülmektedir.

Son yıllarda yapılan çalışmalar viral proteinlerin hafızayla yakından ilişkili olduğunu ortaya koydu.

Birincisi, viral proteinler beyin nöronlarının büyümesini ve gelişimini teşvik edebilir, nöronların bağlantısını ve esnekliğini artırabilir ve böylece hafızayı geliştirebilir.

İkincisi, viral proteinler beyindeki nöronları aktive edebilir, daha fazla nöronun uyarılmasını teşvik edebilir, nöronlar arasındaki bağlantıyı ve bilgi aktarımını teşvik edebilir ve hafızayı ve öğrenme yeteneğini güçlendirmeye yardımcı olabilir.

Ek olarak, viral proteinler aynı zamanda insan bağışıklık sistemini de etkileyebilir, vücudun normal metabolizmasını destekleyebilir ve vücut dengesinin korunmasına yardımcı olabilir, böylece insanların zihinsel durumunu etkileyebilir ve insanların hafızasını geliştirebilir.

Ancak uzun süre yüksek baskı altında kalan kişilerin bağışıklığın azalmasına yatkın olduğunu da belirtmek gerekir. Bu nedenle stresin makul düzeyde kontrol edilmesi ve iyi yaşam alışkanlıklarının sürdürülmesi de hafızanın geliştirilmesinde önemli faktörlerdir.

Özetle, viral proteinlerin insan vücudu üzerindeki etkisi çok yönlüdür ancak genel olarak insan hafızası üzerinde destekleyici bir etkiye sahiptir. Günlük yaşamda sağlığın korunmasına, direncin arttırılmasına ve viral proteinlerin rolünün en iyi duruma getirilmesine dikkat etmeliyiz. Aynı zamanda olumlu bir tutum sergilemeli, hayata ve işe iyimser bir tavırla yaklaşmalı, hafızamızı geliştirip daha iyi sonuçlar elde edebileceğimize inanmalıyız. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche birçok benzersiz etkiye sahip geleneksel bir Çin tıbbıdır ve bunlardan biri hafızayı geliştirmektir. Cistanche'nin etkisi içerdiği tanik asit, polisakkaritler, flavonoid glikozitler vb. gibi çeşitli aktif bileşenlerden gelir. Bu bileşenler beyin sağlığını birçok yönden geliştirebilir.

Kısa Süreli Belleğin nasıl geliştirileceğini bilin'e tıklayın

Kanıtlar, Tat gibi viral proteinlerin nöronal değişime ve dolayısıyla HAND'a neden olan ajan olduğuna işaret ediyor. Tat kaynaklı nörodejenerasyonun ayırt edici özellikleri endoplazmik retikulum stresi ve mitokondriyal fonksiyon bozukluğudur.

Sirtuinler (SIRT'ler), mitokondri biyogenezinde, katlanmamış protein tepkisinde ve içsel apoptoz yolunda rol oynayan NAD+-bağımlı deasetilazlardır. Tat'ın bu deasetilazlarla etkileşimi SIRT1 ve SIRT3'ün inhibisyonuna neden olur. Araştırmalar, SIRT aktivasyonunun Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklarda nöroproteksiyona yardımcı olduğunu ortaya çıkardı.

Bu nedenle, bu derleme, HAND ile mücadelede terapötik bir strateji olarak SIRT'leri temel düzenleyiciler olarak içeren Tat kaynaklı nörotoksisite mekanizmalarına ve bunların modülasyonuna ve dolayısıyla HIV ile yaşayan insanların yaşam kalitesini iyileştirmeye odaklanmaktadır.

Anahtar Kelimeler: sirtuin; SIRT1; SIRT3; SIRT2; HIV; resveratrol; ER stresi; mitokondriyal fonksiyon bozukluğu;nörodejenerasyon; EL.

1. Giriş

2020 yılında insan immün yetmezlik virüsü (HIV) dünya çapında 37 milyondan fazla insanı enfekte etti ve bu popülasyonun %73'ü antiretroviral tedavi altındaydı [1]. Bu kombine antiretroviral tedavi (cART) yaşam süresini uzattı.

Bununla birlikte, merkezi sinir sisteminde (CNS) değişikliklere neden olan eşlik eden hastalıklar ortaya çıkmıştır. Nörogörüntüleme teknikleri, HIV (PLWH) ile yaşayan insanların beyinlerindeki morfolojik değişikliklere dair kanıtlar sağlamıştır.

Ek olarak, raporlar, kanda viral yük tespit edilemese bile, beyin omurilik sıvısında ve ölüm sonrası beyin dokularında HIV'in varlığını gösterdi [2].

Toplu olarak, bu değişiklikler HIV ile ilişkili nörobilişsel bozukluklar (HAND) olarak adlandırılır ve Frascaticriteria'ya göre şiddete bağlı olarak asemptomatik nörobilişsel bozukluk (ANI), hafif nörobilişsel bozukluk (MND) veya HIV ile ilişkili demans (HAD) olarak kategorize edilir [3] . HAND'ın küresel prevalansının %40 civarında olduğu tahmin edilmektedir; daha hafif form, HAND hastaları arasında en yaygın olanıdır [4,5].

Frascati kriterleri, HAND'ın her seviyesini tanımlamak için kapsamlı bir şekilde kullanılmıştır; nöropsikolojik testler uygularlar ve bilişsel bozukluklara neden olabilecek herhangi bir eşlik eden durumu dışlarlar.

ANI ve MND tanısı, en az iki bilişsel alanın performansı ortalamanın en az 1 SD altında olduğunda, en az beş bilişsel alan değerlendirilerek konur; bunlar arasında dikkat, dil, yürütme ve motor işlevler, çalışma belleği, bilgi işleme hızı ve bilişsel işlevler yer alır. öğrenme. Ancak ANH'de günlük aktiviteler etkilenmezken, MNH hastalarında günlük aktivitelerde hafif bozulmalar görülür.

Son olarak, HAD tanısı alan kişilerin iki bilişsel alanda ortalamanın 2 SD altında bir performansı vardır ve günlük aktivitelerin başarılmasında belirgin zorluklar vardır [3,6].

HAND geniş bir yelpazede bilişsel bozulma, motor işlev bozukluğu, davranışsal ve emosyonel bozukluklara neden olur [7-14]. HAND geliştirme riski, ÇH4+ sayısına, enfeksiyonun zamanına, plazma viral yüküne ve AIDS geçmişine bağlıdır. -hastalığın tanımlanması [15]. Günümüzde HAND'ın ya enfekte hücreler tarafından salgılanan viral proteinler olan cART'ın nörotoksisitesinden ya da her ikisinin bir kombinasyonundan kaynaklandığı düşünülmektedir [2].

HIV nöronu enfekte edemez, ancak nörotoksisiteyi tetikleyen viral proteinler üreten enfekte monositler aracılığıyla BBB'yi geçebilir [16]. Hayvan modellerinde ve hücre hatlarında, transkripsiyon transaktivatörünün (Tat) CNS'de değişikliklere neden olduğu gözlemlenmiştir [17 –21].

Tat kaynaklı nörodejenerasyonun ayırt edici özelliği, endoplazmik retikulum (ER) stresi [22,23] ve mitofaji [18], mtDNA [20], füzyon ve fisyon [24] ve enerji metabolizmasında [25, 26]. NAD+-bağımlı deasetilazlar olan SIRT'ler, bu mitokondriyal süreçlerin moleküler mekanizmalarında rol oynarlar [27,28].

Ayrıca veriler, Tat ve SIRT'ler arasında onların inaktivasyonuna neden olan bir çapraz etkileşimi ortaya çıkarmıştır [29-31]. Bu derlemede, Tat viral proteininin SIRT'lerin düzenlediği yolların bozulması yoluyla nörotoksisiteyi tetiklemek için kullandığı yaklaşımlara odaklanıyoruz.

Bunun tersine, PLWH'deki bilişsel eksiklikleri iyileştirmek için ART ile birlikte olası bir terapötik strateji olarak NAD+ öncülleri gibi SIRT modülatörlerinin ve doğal ve sentetik bileşiklerin kullanılmasını öneriyoruz; dolayısıyla şu anda bu hastalığın üstesinden gelmek için etkili bir tedavi yoktur (Şekil 1). 1).

2. EL ve SANAT'a Uzun Süreli Maruziyet

ART çağında bile HAND'ın yaygınlığı, dikkatleri daha yüksek CNS penetrasyon etkinliğine (CPE) sahip antiretrovirallere yöneltmiş ve bu sınıflandırmanın sorunu çözeceği beklentisine yol açmıştır [32].

Bununla birlikte, bu özelliğe sahip tedavilerin HAND ile, özellikle de efavirenz ile ilişkili olduğu kanıtlanmıştır [33-35]. Ayrıca, farklı CPE'ye sahip diğer antiretrovirallerin nörotoksik ajanlar olduğu rapor edilmiştir [36-38].

ART kaynaklı nörotoksisiteyi yöneten mekanizmalar ilacın sınıfına bağlıdır. Başlangıçta, nükleosid analog ters transkriptaz inhibitörlerinin (NRTI'ler), HIV ters transkriptazın aktif bölgesi ile mtDNA replikasyonunun inhibisyonuna neden olan DNA polimeraz gama (PolG) arasındaki analojiye bağlı olarak mtDNA'nın tükenmesi yoluyla mitokondriyal sapmalara neden olduğu bulunmuştur. ], mitokondriyal biyogenezin bozulmasıyla ilişkili olabilir. Ek olarak, lopinavir gibi proteaz inhibitörlerine maruz kalma, nöral hücrelerde yüksek ROS seviyelerinin aracılık ettiği inoksidatif streste bir artış ve endojen antioksidan tepkinin aktivasyonunu göstermiştir [38].

Ritonavir durumunda, endoplazmikretikulum (ER) stresini ve mitokondriyal dış membran geçirgenliğini (MOMP) indüklediği bulunmuştur [40]. Son olarak, ART aracılı bilişsel performans iyileşmesini öne süren veriler hala tartışmalıdır [38,41,42] ; dolayısıyla bazı çalışmalar yararlı bir ilişki bulamadı, Siangphoe ve ark. [42] bir meta-analizde ART'ın HAND gibi nöronal bozuklukların gelişme riskini azalttığı sonucuna varmıştır. Bununla birlikte, çalışma her hastanın ART tipini analize dahil etmemiştir; bu da herhangi bir spesifik antiretroviralin veya bunların bir kombinasyonunun herhangi bir nörobilişsel bozukluğa neden olup olmadığı konusunda soruyu gündeme getirmektedir.

Ek olarak, HAND tanısının aynı ölçekle yapılmaması, bu durumların tanımlanması anında ve bilişsel testin ANI'yi tespit etme duyarlılığında olası farklılıklara yol açmaktadır [42].

Yukarıda tartışıldığı gibi, HIV ile yaşamak, ART'ye maruz kalma ve toksisitesi ile birleşen nörobilişsel bozukluğun gelişimine katkıda bulunuyor gibi görünmektedir. Bu nedenle, sadece ART'nin yan etkileri değil aynı zamanda Tat gibi viral proteinlerin neden olduğu eşlik eden hücre değişiklikleri de dikkate alınarak, HAND'a karşı uygun önleme veya tedavi için adjuvan ilaçlara özel dikkat gösterilmelidir.

3. Transkripsiyon Tat İşlemcisi

Küçük bir düzenleyici protein olan Tat, HIV genomunun geninde, alternatif birleştirme sonrasında iki ayrı ekzon tarafından kodlanır ve protein tamamen üretilebilir. Uzunluk, 86 ile 101 arasında değişen viral suşa bağlıdır. amino asitler. N-terminal asidik veya prolin açısından zengin, sistein açısından zengin, hidrofobik çekirdekten oluşur; temel ve glutamin açısından zengin alanlar; ve bir RGD motifi.

Bu, konak proteinleri ve gen ekspresyonu üzerinde çeşitli aktivasyon ve inhibitör sonuçlara neden olan kalıntı değişkenliğine sahiptir. Yalnızca W11 kalıntısı ve 49RKKRRQRRR57 dizisi, Tat'ın yanında bulunan hücrelerin salgılanması ve alımının temel işlevi nedeniyle iyi korunmuş kalıntılardır [43].

Tat'ın Salgılanması ve İçselleştirilmesi

Kan-beyin bariyerine (BBB) ​​nüfuz eden enfekte hücreler, Golgi aparatı veya endoplazmik retikulum boyunca geçiş yapacak bir sinyal peptidinden yoksun olduğundan, Tat olarak viral proteini alışılmadık bir şekilde serbest bırakabilir [44].

Tat hücre zarına alındıktan sonra, temel alanı ve W11 kalıntısı fosfatidilinositol-4,5-bisfosfat (PI(4,5)P2) ile etkileşime girer [45]. Daha sonraki mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır. Bir yandan, raporlar Tat'ın oligomerleşebildiğini ve plazma zarında gözenekler oluşturabildiğini göstermiştir.

Diğer taraftan, PI(4,5)P2'ye bağlanma, W11 kalıntısının hücre zarına yerleştirilmesine izin verir; daha sonra belirsiz bir süreçle hücre dışı matrikse taşınır [44-46]. Son olarak, çalışmalar Tat içeren eksozomları bildirmiştir [44,47]; yine de eksozomal Tat nörotoksisite özelliğini kaybetmiş gibi görünmektedir [19].

Hücre dışı Tat hücreye endositoz yoluyla girer. İçselleştirmeden sonra Tat, hücre sitoplazmasına yer değiştirir. Düşük pH'ın bir sonucu olarak konformasyonel değişiklik meydana gelir ve endozomal membran ile etkileşime giren W11 kalıntısının açığa çıkmasına izin verir [48].

Ek olarak, endolizozomda yerleşik iki gözenekli kanallardan gelen kalsiyum, Tat'a endolizozomun kaçması konusunda yardımcı olur [49]. Ayrıca Ruiz ve ark. temel alandaki (R57S) ikamenin aracılık ettiği seyirci hücreler tarafından Tat alımında %70'lik bir azalma bulmuş, bu da R57 kalıntısının Tat'ın hücresel içselleştirilmesindeki önemli ilişkisini kanıtlamıştır [50].

Tanget al. Tat'ın neden olduğu sinaptik hasarı, hücre zarlarına nüfuz etme kabiliyetine bağlamıştır [19]. Aslında, Tat'ın kısa bir dizisi, kanser gibi diğer hastalıklarda ilaç sağlamak için hücreye nüfuz eden bir peptit olarak kullanılmaktadır [51].

Tat'ın hücrenin içine girip çıkmak için farklı stratejiler kullandığı görülüyor, bu da onu nöronal değişikliklerin önlenmesinde önemli bir hedef haline getiriyor. Bu nedenle aşağıdaki bölümlerde yer alan mekanizmaları ayrıntılı olarak açıkladık.

4. Tat ve Mitokondri

Mitokondri, oksidatif fosforilasyon tarzında enerji üretimi, apoptoz sinyali, kalsiyum homeostazisi [52] ve hücresel yaşlanma düzenlemesi [53] dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerde yer alan organellerdir.

Çalışmalar, yalnızca Parkinson hastalığında (PD) veya Alzheimer hastalığında (AD) değil, aynı zamanda HAND'da da [55] nöronal bozukluklarda mitokondrinin rolüne odaklanmıştır. Sanna ve ark. [56], HIV hastalarının beyin bölgelerinde düşük TCA döngüsü ve oksidatif fosforilasyon proteini seviyeleri tarafından belirlenen, yüksek HIV RNA yükünün aracılık ettiği mitokondriyal fonksiyon bozukluğunun varlığını gösterdiler [56].

Tat'ın mitokondrinin yakınında kaldığı gözlendi [57,58], bu da hücresel dağılımın organel değişiklikleriyle ilişkili olduğunu düşündürmektedir. Buna göre, diğer bulgular, Tat'a maruz kalan hücrelerin mtDNA hasarı [20,59] ve metilasyon modellerinde değişiklik [60], mitokondriyal membran potansiyelinde azalma [23], organelin boyutu ve morfolojisinde değişiklikler, füzyon-fisyon tetiklemesinin [24] arttığını ortaya çıkardı. mitokondriyal ROS [61,62], mitofaji bozulması [17,57], mitokondriyal fonksiyonların düzensizliği [17,61] kalsiyum homeostazının bozulması [61,63,64] ve apoptoz aktivasyonu [23,58,61,65,66].

4.1. Tat ve Füzyon-Fisyon Dinamiği

Mitokondri, işlevsel süreçleri sürdürmek için füzyon ve bölünmeye uğrayan son derece dinamik bir organeldir. Nöronlarda enerji talebi, aksonlara ve dendritlere mitokondrifüzyon/fisyon aracılı dağıtımı tetikler.

OMM'nin füzyonu GTPazlar mitofusin 1 ve 2 (MFN1, MFN2) tarafından düzenlenirken, iç mitokondriyal membranın (IMM) füzyonu optik atrofi proteini 1 (OPA1) tarafından kontrol edilir.

Bu arada, mitokondriyal bölünme olaylarına, dinamin süper ailesinden bir GTPaz olan dinaminle ilişkili protein 1 (DRP1) aracılık eder. Drp1 ve Mnf2 nakavt farelerinde hücrelerin mitokondriyi düzgün bir şekilde dağıtamadığı gözlemlenmiştir [67].

Tat-Tg fareleri küçük parçalanmış mitokondri gösterdi ve Tat'a maruz kalan kortikal nöronlar, DRP1 ve kalsinörinde bir artış sergiledi; bu, Tat'ın, kalsinörin aracılı DRP1 aktivasyonunu tetikleyen Ca2+ homeostazisinin düzensizliği yoluyla mitokondriyal parçalanmayı indüklediğini düşündürmektedir [24].

4.2. Mitofaji Bozulması

Mitokondri hücrenin güç merkezidir ve bu nedenle bunların bakımı hücresel fizyoloji için çok önemlidir. Hasar görmüş mitokondri, mitokondri ağını ve enerji metabolizmasını eski haline getirmek için kalite kontrol yollarını tetikler.

İşlevsel olmayan mitokondri kalıcı olduğunda hücreler, anormal organellerin parçalanmasını içeren mitofajiye girerler [68]. Fosfataz ve tensin homologunun (PTEN) indüklediği varsayılan kinaz 1 (PINK1), mitofajinin önemli bir düzenleyicisidir. Bazal koşullar sırasında PINK1, iç mitokondriyal membrana aktarılır ve parçalanır.

Bununla birlikte, mitokondriyal membran potansiyeli kaybı altında PINK1, mitofagozom oluşumunu başlattığı OMM'de birikir. İşlevsel olmayan mitokondriyi etiketlemek için PINK1 otofosforile eder ve parkini mitokondri yüzeyine toplar.

Daha sonra, OMM'de proteinlerin her yerde bulunması, parkin E3 ligaz aktivitesi ve ardından hasarlı mitokondriyi mitofagosom içine kapatmak için sekestome 1 (SQSTM1) gibi otofaji reseptörlerinin mobilizasyonuyla gerçekleşir [68]. Fare mikrogliasında Tat, PEMBE ekspresyonunu arttırır, mitofajinin aktivasyonunu gösterir.

Ek olarak, veriler yalnızca daha yüksek mitofaji sensör proteini seviyelerini değil aynı zamanda bunların Tat'a maruz kalan insan birincil nöronlarındaki mitokondriye aktif translokasyonunu da gösterdi [57]. floresan raportör sistemi tarafından gözlemlenen mitofagozom birikimi [57].

Eksik mitofajinin, olgunlaşmamış fagozomların oluşması nedeniyle lizozomların mitofagozomlara füzyonunun bloke olması veya hücrelerin bunların bozunmasını oluşturuldukları hızda dengeleyememeleri nedeniyle ortaya çıkabileceği öne sürülmektedir [17]. Hasar görmüş mitokondrinin temizlenmesindeki engelin nedenini açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç olduğu görülmektedir.

Mitokondri kalite kontrolünün bloke edilmesi, nöroinflamasyona katkıda bulunan proinflamatuar sitokinlerin üretimine yol açar. Bununla birlikte, pink1 geninin susturulması, HIV-Tat kaynaklı mitofajinin önlenmesine ve dolayısıyla mitofagosomların birikmesine neden olur, ancak ATP üretim hızının eski haline getirilmesinde başarısız olur [17].

Bu bağlamda, mitofaji belirteçlerinin manipülasyonu, mitokondri fonksiyonlarının restorasyonuyla sonuçlanmadığından, bu da nörodejenerasyonu tetiklediğinden, düzensiz hale gelebilecek mitofaji proteinlerinin anahtar düzenleyicisinin araştırılması gereklidir.

4.3. Tat Kaynaklı Apoptoz

Bildirilen veriler, Tat'a maruz kalan hücrelerin dışsal [65] ve içsel apoptoz yollarına [23] maruz kaldığını göstermektedir. Birincisinde sinyalleşme süreci hücre zarında başlar ve ölüm reseptörlerinin uyarılmasıyla tetiklenir, ardından kaspazların aktivasyonuyla hücre ölümü başlatılır.

İçsel apoptoz yoluna aynı zamanda mitokondrialapoptotik yol da denir çünkü MOMP, sapoptozu indükleyen kaspaz sinyalini tetiklemek için gereklidir [54].

Son zamanlarda çoğu çalışma, Tat kaynaklı apoptozda mitokondriyal yolun önemli rolünü ve bunun ER stresi ve katlanmamış protein tepkisi (UPR) ile çapraz etkileşimini kabul etmiştir [23,69,70]. Hücre, apoptotik uyaranların varlığında BCL{'yi translokasyona uğratır. {4}}ilişkili X proteini (BAX) sitoplazmadan OMM'ye kadar oligomerize olur ve pro-apoptotik aktivatörlerle bağlandıktan sonra gözenek görevi gören BCL-2 antagonisti/öldürücü (BAK) ile etkileşime girer [71].

BH3-yalnızca BCL-2- ile etkileşime giren hücre ölümü aracısı (BIM), BH3-etkileşimli alan ölüm agonisti (BID) ve p53-apoptozun yukarı regüle edilmiş modülatörü ( PUMA), B hücreli lenfoma 2 (Blc-2) ailesinin pro-apoptotik üyeleridir ve BAK ve BAX ile etkileşime girerek sitokrom c ve dolayısıyla MOMP gibi zarlar arası boşluk proteinlerinin salınmasına yol açar [71].

Sonuç olarak, bu proteinler apoptoza yol açan kaspaz aktivasyonunu başlatır. MOMP'nin yalnızca apoptotik yolun başlatılmasında rol almadığını, aynı zamanda mtDNA salınımı ve proinflamatuar sinyallemeyle de ilişkili olduğunu unutmayın. Hayatta kalma mekanizması, BCL-2 ve ekstra büyük B hücreli lenfoma (BCL-XL) gibi aynı Bcl-2 ailesinden anti-apoptotik proteinler tarafından düzenlenir.

Bu moleküller proapoptotik proteinlere bağlanarak BAX/BAK ile etkileşimlerinden ve gözenek oluşumundan kaçınırlar [71]. Dolayısıyla BCL-2 proteinlerinin düzensizliği, mitokondriyal fonksiyon bozukluğunun yanı sıra içsel apoptotik yolun da bir göstergesidir.

Tat'a maruz kalan eritrolösemik hücre soyunda (K562) [58], insan retinal mikrovasküler endotelyal hücrelerinde [69], astroglioma hücrelerinde [66] ve insan nöroblastoma hücresinde [18], BCL-2'nin mRNA seviyeleri, aşağıdakilerle karşılaştırıldığında daha düşüktü: kontroller. Che ve ark. ayrıca BAX, BAK ve sitokrom c protein seviyelerinin Tat insan dışı retina pigment epitel hücreleri (ARPE-19) tarafından artırıldığını da buldu [69].

Bu bulgulara göre Tat, pro-apoptotik bir molekül gibi davranarak, OMM'de makro gözenek oluşumuna neden olarak MOMP'yi arttırır ve bu, mitokondriyal membran potansiyelinin bozulduğu raporlarıyla da doğrulanır [23,58,70].

For more information:1950477648nn@gmail.com