Fosforla İlgili Bir Molekül olan SLC37A2, Kalsifiye Aormadaki Düz Kas Hücrelerinde Artar

Damar kalsifikasyonuönemli bir kaynağıdırkalp-damar hastalığıkronik böbrek hastalığı olan hastalarda.Hiperfosfatemidamar düz kas hücrelerinde osteoblast benzeri hücrelerin artmasına yol açan hücre içi fosfor akışının artmasına yol açar. PiT-1, vasküler düz kas hücrelerinde fosfatın geçişini sağlar. Ancak damar kalsifikasyonunun mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma, PiT-1 dışındaki aday fosforla ilgili molekülleri araştırdı. Fosforla ilgili moleküllerin aşağıdakilere ait olduğu hipotezini kurduk:çözünen taşıyıcı(SLC) süper ailesi vasküler kalsifikasyonda rol oynayabilir. DNA mikroarray analizi sonucunda SLC37A2'ye odaklandık ve bu hücrelerin mRNA ekspresyonunun kalsifiye aort düz kas hücrelerinde (AoSMC) arttığını gösterdik. SLC37A2'nin hem glikoz-6-fosfat/fosfat hem de fosfat/fosfat değişimlerini taşıdığı rapor edilmiştir. İn vitro analiz, SLC37A2 ekspresyonunun AoSMC'deki inflamasyondan etkilenmediğini gösterdi. SLC37A2 mRNA ve proteinin ekspresyonu kalsifiye AoSMC'de arttı. İn vivo analiz, aortta SLC37A2 mRNA ekspresyonunun olduğunu gösterdi.kronik böbrek hastalığısıçanlar osteojenik işaretleyici genlerle ilişkilendirildi. Ayrıca SLC37A2, vasküler kalsifikasyon alanında eksprese edildi.kronik böbrek hastalığı sıçanları. Sonuç olarak SLC37A2'nin artan moleküllerden biri olduğunu gösterdik.damar kalsifikasyonuin vitro ve in vivo.

Anahtar Kelimeler: SLC37A2,damar kalsifikasyonuaort düz kas hücreleri,kronik böbrek hastalığı, hiperfosfatemi

BÖBREK İŞLEVLERİNE YÖNELİK %25 EKİNAKOSİT VE %9 AKTEOSİT İÇEREN DOĞAL ORGANİK SİSTANŞ EKSTRATINI ALMAK İÇİN BURAYA TIKLAYIN

Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Hasta sayısı arttıkçakronik böbrek hastalığı(KBH) arttıkça hasta sayısı artıyordiyaliz gerektirenda artacaktır. Tedavi gören hastalarda en çok ölümdiyaliznedeniylekardiyovasküler hastalıklarörneğinkalp yetmezliği, serebrovasküler bozukluklarveya miyokard enfarktüsü. (,2) Önemli bir kaynakkalp-damar hastalığıektopik kalsifikasyon,() yumuşak dokularda kalsiyum fosfat kristallerinin oluşumu ve birikmesinden kaynaklanan bir anormalliktir. (4 6) Enflamasyon gibi çeşitli faktörler. oksidatif stres ve plazma kalsiyum (Ca) ve fosfor (P) seviyelerindeki artışlar vasküler kalsifikasyonun ilerlemesinde rol oynar. Bu faktörler arasında hiperfosfatemi en güçlü şekilde vasküler kalsifikasyonla ilişkilidir. (7.8) Hiperfosfatemi, böbrek fonksiyonunun azalması durumunda aşırı P alımından kaynaklanır. Bu nedenle diyalize giren hastaların P alımını sınırlamaları gerekmektedir. (79-12) Ancak,damar kalsifikasyonudiyaliz başlatıldığında zaten ilerleme kaydediyor; hiperfosfateminin belirgin olmadığı erken evre KBH hastalarında da görülmüştür. (3) Sonuç olarak erken evre KBH hastalarında vasküler kalsifikasyonun önlenmesi yaşam prognozunun iyileştirilmesi açısından önemlidir.

bu da P'nin vasküler düz kas hücrelerine (VSMC) akışının artmasına neden olur. P akışı, VSMC'nin hücre zarı yüzeyindeki bir taşıyıcı olan PiT-1 aracılığıyla gerçekleştirilir. PiT-, SLC20A1.04 tarafından kodlanan bir sodyum fosfat taşıyıcıyı içeren çözünen taşıyıcı (SLC) süper ailesinin bir üyesidir. PiT-, fosfatı Na'ya bağımlı hücre zarları boyunca taşır ve ardından yüksek p seviyeleri nedeniyle matris mineralizasyonunu taşır.s) Hücre içi olarak P seviyeleri artar, VSMC, runt ile ilişkili transkripsiyon faktörü 2(Runx2)(16) gibi osteojenik transkripsiyon faktörlerini eksprese etmeye başlar. Bu etkiyi, osteopontin ve osteokalsin gibi osteoblast spesifik genlerin artan ekspresyonu takip eder. Ayrıca düz kaslara özgü proteinlerin ekspresyonu da azaldı. düz kas proteini 22-0 (SM22-0) gibi oluşur. Sonuç olarak VSMC, osteoblast benzeri hücrelere dönüşür. (1718)Son klinik çalışmalar kandaki kalsiyum seviyelerinin arttığını göstermiştir. Kalsiyum fosfat koloidal parçacıklarını temsil eden protein parçacıkları (CPP), böbrek fonksiyonu azaldıkça artar. (19-21)Ayrıca kandaki CPP ve P seviyeleri ile korelasyonlar da rapor edilmiştir.2o2i) CpP'nin vasküler kalsifikasyonun ilerlemesini tetiklemesi mümkündür.22-24)

Ancak plazma P düzeyleri normal olan erken evre KBH hastalarında vasküler kalsifikasyon gözlenmiştir. (13) Ek olarak PiT-1 mRNA tüm dokularda her yerde bulunur. Böylece başka bir molekül öncelikli olarak vasküler kalsifikasyon alanında etki gösterebilir. Öyle raporlar var kiiltihaplanmaVasküler kalsifikasyonu teşvik eder. İnterlökin (IL)-1B, IL-6 ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-a) gibi inflamatuar faktörler, VSMC'nin osteoblast benzeri hücrelere (2s26) farklılaşmasını tetikledi. TNF-a, vasküler kalsifikasyonu indükler osteoblast farklılaşmasında rol oynayan cAMP yolu yoluyla.2728) IL-6, ayrıca VSMC2-31)'nin vasküler kalsifikasyonuna yol açan çeşitli yolları düzenler. IllB, IL-6 ve TNF-a da yüksek p seviyelerinin neden olduğu artan vasküler kalsifikasyonla ilişkili faktörlerdir.3233) Ancak. mevcut veriler vasküler hasarın mekanizmasını tam olarak açıklayamamaktadır.

Bu faktörlerin neden olduğu kalsifikasyon. Vasküler kalsifikasyonda rol oynayan SLC süper ailesindekiler gibi P ile ilişkili başka moleküllerin de olabileceğini varsaydık. SLC süper ailesindeki membran proteinlerine odaklandık ve vasküler kalsifikasyona katılım açısından PiT-1 dışında P ile ilişkili potansiyel aday molekülleri araştırdık. Ayrıca aday moleküller ile vasküler kalsifikasyon arasındaki ilişkiyi video ve in vivo olarak inceledik.

Malzemeler ve yöntemler

Hücre kültürü. Normal insanaortik düz kas hücreleri (AoSMC), Lonza'dan (Basel, İsviçre) elde edildi. AoSMC, üreticinin talimatlarına göre kültürlendi. AoSMC bir büyüme ortamında (%5 fetal sığır serumu (FBS), epidermal büyüme faktörü, insülin, fibroblast büyüme faktörü-B ve gentamisin/amfoterisin-B ile desteklenmiş düz kas hücresi bazal ortamı) muhafaza edildi. Medya her gün değiştirildi. AoSMC, nemlendirilmiş %5 CO2 kuluçka makinesinde 37 derecede büyütüldü ve birleşme noktasına ulaşılıncaya kadar muhafaza edildi ve ardından deneylerde kullanıldı.

Kalsifiye AoSMC. AoSMC'nin kalsifikasyonu daha önce açıklandığı gibi indüklendi.435) AOSMC, %15 FBS ve penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamında kültürlendi ve 3, 6, 9, 12 ve 14 gün boyunca 2,6 mM P ile kültürlendi. P konsantrasyonu, P tamponu NaH, PO/Na ve HPO ile ayarlandı. pH 7.2). Diğer AoSMC'ler 2,6 mM P ile kültürlenmedi.

DNA mikrodizisi. 2,6 mM P ile kültürlenen ve kültürlenmeyen AoSMC numunelerinin toplam RNA'sı kullanıldı. Toplam RNA 5.0 ug, bir DNA mikrodizisi (Agilent Technologies, Tokyo, Japonya) kullanılarak analiz edildi. SurePrint G3 İnsan GE 8 x 60k ver. 2 Mikrodizi yaklaşık 26000 geni incelemek için kullanıldı. Oran, 12 gün boyunca 2,6 mM ile kültürlenen AoSMC'nin ekspresyon seviyesinin, 2,6 mM P ile kültürlenmemiş AoSMC'nin ekspresyon seviyesine bölünmesiyle hesaplandı.

DNA mikrodizisi

2,6 mM P ile kültürlenen ve kültürlenmeyen AoSMC numunelerinin toplam RNA'sı kullanıldı. Toplam RNA 5.0 ug, bir DNA mikrodizisi (Agilent Technologies, Tokyo, Japonya) kullanılarak analiz edildi. SurePrint G3 İnsan GE 8 x 60k ver. 2 Mikrodizi yaklaşık 26000 geni incelemek için kullanıldı. Oran, 12 gün boyunca 2,6 mM ile kültürlenen AoSMC üzerindeki ekspresyon seviyesinin, 2,6 mM P ile kültürlenmemiş AoSMC üzerindeki ekspresyon seviyesine bölünmesiyle hesaplandı. Vasküler enflamasyonda SLC37A2'nin ekspresyonu. AoSMC'de bir inflamatuar tepki oluşturmak için hücreler, birleşme noktasına ulaşana kadar büyüme ortamı ile kültürlendi ve daha sonra 24 ve 72 dakika boyunca 1 ugmL lipopolisakkaritler (LPS) (escherichia coli O111:B4'ten LPS; Sigma, St. Louis, MO) ile işlendi. 2,6 mM P. Diğer AoSMC'ler, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analiziyle kültürlenmedi. Toplam RNA, 24 ve 72 saat boyunca LPS ile işleme tabi tutulan AoSMC'den ve LPS ile işleme tabi tutulmayan hücrelerden ekstre edildi. SYBR yeşil bazlı kantitatif gerçek zamanlı PCR, sentezlenmiş cDNA ve StepOnePlus gerçek zamanlı PCR sistemi (Applied Biosystems, FosterCity, CA) ile her hedef gen için uygun bir primer seti kullanılarak gerçekleştirildi. Primer dizileri şu şekildeydi: insan IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' ve 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; insan SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' ve 5CCATTGGTGTAGTCAGAGAGCG-3'; gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- ve 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 ve SLC37A2 mRNA ekspresyon seviyeleri, GAPDH ile normalizasyondan sonra hesaplandı. Kalsifiye edilmiş SLC37A2'nin ekspresyonu AoSMC. Toplam, 2,6 mM P ile kültürlenmemiş AoSMC'den ve 3, 6, 9, 12 ve 14 gün boyunca 2,6 mM P ile kültürlenmiş AoSMC hücrelerinden ekstre edildi. Sentezlenen cDNA kullanılarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirildi. Primer dizileri şu şekildeydi: şu şekildedir: insan Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' ve 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Runx2 ve SLC37A2 mRNA ekspresyon seviyeleri, APPH ile normalleştirmeden sonra hesaplandı.

Western lekeleme analizi.

Toplam protein, gerçek zamanlı PCR analizi için kullanılanla aynı koşullar altında kültürlenen AoSMC örneklerinden toplandı. Bu numuneler, %5 NP-40 ve %1 proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş Tris tamponlu salin (pH 75) kullanılarak parçalandı. Protein konsantrasyonu numuneleri, BCA Protein Tahlili Kiti (Thermo FisherScientific.Waltham, MA) kullanılarak ölçüldü. ve konsantrasyon western blotlama yoluyla ayarlandı, 10 ug protein, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak %10 poliakrilamid jel içerisinde ayrıldı. Membran, birincil antikorlar olarak SLC37A2 antikoru (Novus Biologicals, Centennial, CO) veya GAPDH antikoru (GeneTex, Irvine, CA) ile muamele edildi; ikincil antikor olarak Tavşan lgG Yaban turpu peroksidaz konjuge antikoru (R&D Systems, Minneapolis, MN) ile inkübe edildi. ve Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, İngiltere) ve ışıldayan görüntü analizörü (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokyo, Japonya) kullanılarak görselleştirildi. Bant lmagel kullanılarak ölçüldü.

Deneysel

Tüm çalışma protokolleri Hyogo Üniversitesi İnsan Bilimi ve Çevre Okulu Etik Kurulu tarafından onaylandı. On iki haftalık erkek Sprague-Dawley sıçanları, Japonya SLC'den (Shizuoka, Japonya) satın alındı. Sıçanlar 12-aydınlık, 12-saat karanlık döngüsünde (09:00-21:00) tutuldu ve yiyeceğe ve ekstra saf suya serbestçe erişmelerine izin verildi.

Deneysel diyetler, bir kontrol P diyetini (%1.0 P, 0.6Ca, %20 protein), bir adenin diyetini (0.75% adenin) içerir , %1.0 P, 0.6%Ca, %2.5 protein), düşük P (LP) diyeti (0.2% P,0 AIN93-G diyetini (Doğu) temel alan %0,6 Ca, %10protein) ve yüksek P (HP) diyeti (%1,0 P, %0,6 Ca, %10 protein) Yeast, Tokyo, Japonya) protein kaynağı olarak kazein ile.3637) Düşük proteinli bir diyetin, adenin kaynaklı böbrek yetmezliği olan sıçanlarda vasküler kalsifikasyonu teşvik ettiği rapor edilmiştir, bu nedenle protein kısıtlaması uygulanmıştır.3738) Gruplandırmadan önce tüm sıçanlar (n)=23) alışmaları için bir hafta boyunca standart bir MF diyetiyle (Doğu Mayası) beslendi. 13 haftalık sıçanlar 2 gruba ayrıldı: kontrol grubu (n=5) ve adenin kaynaklı KBH grubu (n=18). Kontrol grubu 6 hafta boyunca kontrol P diyeti aldı. . Adenin kaynaklı CKD grubu yaklaşık 3 hafta boyunca adenin diyetini aldı ve daha sonra 2 alt gruba daha bölündü: CKD-LP grubu (n=8) veya CKDHP grubu (n=10). CKD-LP grubu ve CKD-HP grubundaki sıçanlar, 3 hafta boyunca sırasıyla LP diyeti ve HP diyeti aldı; deney süresi boyunca gıda alımları günlük olarak kaydedildi. Adenin diyeti sırasında, ikinci haftaya kadar haftada bir kez, daha sonra ise plazma seviyelerini izlemek için 2 günde bir saat 10:00 ile 11:00 AM arasında kuyruk damarından kan örnekleri toplandı. LP diyeti veya HP diyeti sırasında haftada bir kez kan örnekleri toplandı. Haftada bir kez idrar örnekleri toplandı ve idrar hacmi kaydedildi. Sıçanlar izofluran (Wako Pure Chemical Industries, Osaka Japonya) ve laparotomi kullanılarak anestezi ile sakrifiye edildi. Analiz için alt vena kava ve torakoabdominal aortadan alınan kan örnekleri toplandı.

Aortta SLC37A2 ifadesi.

Toplanan torakoabdominal aortun yaklaşık üçte biri kalsifikasyonu görselleştirmek ve immün boyama yapmak için kullanıldı. Aort parafine gömüldü ve 4-um kesitler kesildi. Kesitler, üreticinin talimatlarına göre Kalsiyum Kiti için Von Kossa Yöntemi (Polysciences. Warrington, PA) kullanılarak boyandı. seri kesitlerle immün boyama analizi yapıldı. Kesitler SLC37A2 antikoru ile gece boyunca 4 derecede inkübe edildi ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japonya) ile işleme tabi tutuldu. Daha sonra bölümler bir DABsubstrate kiti (Nichirei) ile işlendi.

Dondurulmuş torakoabdominal aortun geri kalanından toplam RNA ekstre edildi. Sentezlenen cDNA kullanılarak gerçek zamanlı PCR yapıldı. Primer dizileri şu şekildeydi: sıçan osteo-pontin,5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' ve 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' ve; sıçan SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' ve 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Osteopontin mRNA ve SLC37A2 mRNA ekspresyon seviyeleri, GAPDH ile normalleştirmenin ardından hesaplandı.

İstatistiksel analiz.

Veriler ortalama + SE olarak sunulmuştur. Gruplar arasındaki farklar t-testi kullanılarak analiz edildi. Fosfatın neden olduğu kalsifiye AoSMC deneylerinde farklılıklar, tek yönlü bir varyans analizi ve ardından Dunnett yöntemi kullanılarak analiz edildi. CKD modeli deneylerinde farklılıklar Kruskal-Wallis testi ve ardından Steel-Dwass yöntemi kullanılarak analiz edildi. Korelasyon katsayıları (rs), Spearman korelasyon katsayısı sıra testi kullanılarak belirlendi. Tüm testler için. iki kuyruklu p değerleri<0.05 were considered statistically significant.