Sodyum Tiyosülfat Destekli UW Solüsyonu Singeneik Böbrek Nakli Bir Murin Modelinde Renal Greftleri Uzun Süreli Soğuk İskemi-reperfüzyon Hasarına Karşı Korur

İletişim: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang ve diğerleri

Cistanche tubulosa önlerböbrekhastalık, almak için buraya tıklayınürünler ve Cistanche Nz

ÖZ

Giriiş:Soğuk iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI), nakil sonrası komplikasyonları artıran kaçınılmaz bir olaydır. Wisconsin Üniversitesi (UW) solüsyonunun FDA onaylı olmayan hidrojen sülfür (H2S) donör molekülleri ile desteklenmesinin soğuk IRI'yi en aza indirdiğini ve transplantasyondan sonra renal greft fonksiyonunu iyileştirdiğini daha önce göstermiştik. Bu çalışma, FDA onaylı bir H2S donör molekülü olan sodyum tiyosülfatın (STS), klinik olarak ilgili bir singeneik ortotopik sıçan modelinde aynı veya daha üstün etkiye sahip olup olmayacağını araştırmaktadır.böbrektransplantasyon.

Yöntem:Otuz Lewis sıçanına bilateral nefrektomi ve ardından soldaki singeneik ortotopik transplantasyon uygulandı.böbrekUW veya UW artı STS solüsyonunda 4 ◦C'de 24-saat korumadan sonra. Sıçanlar, nakil sonrası 14. güne kadar izlendi ve böbrek fonksiyonunu (idrar çıkışı, serum kreatinin ve kan üre azotu) değerlendirmek için öldürüldü.Böbrekkesitler, akut tübüler nekroz (ATN), apoptoz, makrofaj infiltrasyonu ve nötrofil infiltrasyonunu saptamak için H&E, TUNEL, CD68 ve miyeloperoksidaz (MPO) ile boyandı.

Sonuç:UW artı STS greftleri, transplantasyondan hemen sonra, UW greftlerine kıyasla daha iyi alıcı sağkalımı ile önemli ölçüde iyileştirilmiş greft fonksiyonu gösterdi (p < {{0}}.05).="" histopatolojik="" inceleme,="" uw="" greftlerine="" kıyasla="" uw="" artı="" sts="" greftlerinde="" önemli="" ölçüde="" azalmış="" atn,="" apoptoz,="" makrofaj="" ve="" nötrofil="" infiltrasyonu="" ve="" proinflamatuar="" ve="" proapoptotik="" genlerin="" downregülasyonunu="" ortaya="" koydu="" (p=""><>

Çözüm:STS destekli UW solüsyonunda renal greftlerin korunmasının, apoptotik ve inflamatuar yolları baskılayarak ve böylece greft fonksiyonunu iyileştirip alıcının hayatta kalma süresini uzatarak uzun süreli soğuk IRI'ye karşı koruduğunu ilk kez gösteriyoruz. Bu, uzun süreli soğuk IRI'nin zararlı klinik sonuçlarını en aza indirmek için klinik olarak uygulanabilir yeni bir terapötik stratejiyi temsil edebilir.böbrektransplantasyon.

Anahtar Kelimeler:Sodyum tiyosülfat (STS) İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) Statik soğuk hava deposu (SCS)Böbrektransplantasyon Greft ve alıcı sağkalımı

1. Giriş

Böbrektransplantasyon son dönem için en uygun tedavidirböbrekböbrekhastalığı (ESRD). Diyalize kıyasla,böbrektransplantasyon, daha iyi yaşam kalitesi sağladığı ve maliyet etkinliği ile birlikte önemli bir sağkalım avantajı sağladığı için üstündür [1-3]. Bununla birlikte, donörün böbreklerinin alınması, doğal olarak, transplantasyon sırasında kan akışının kesilmesinin ve ardından yeniden restorasyonunun kaçınılmaz bir sonucu olan iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) ile ilişkilidir [4]. Transplant kaynaklı IRI'yi azaltmak için mevcut strateji, transplant öncesi dönemde 4 °C'de buz üzerinde Wisconsin Üniversitesi (UW) solüsyonu gibi standart koruma solüsyonlarında renal greftlerin statik soğuk depolanmasıdır (SCS). Bununla birlikte, uzamış SCS'nin artan hücre ölümü, iltihaplanma ve sonuçta gecikmiş greft fonksiyonu (DGF), akut tübüler nekroz (ATN) ve azalmış greft insidansı ile sonuçlanan diğer zararlı hücresel ve moleküler olaylarla ilişkili olduğu gösterilmiştir. hayatta kalma [6-10]. Ek olarak, küresel olarak artan ESRD insidansına ve nakil bekleme listelerinde sürekli artan hasta sayısına ayak uydurmak için, birçok nakil merkezi, genel doku hasarına daha fazla katkıda bulunan uzun süreli soğuk iskemik dönemlere sahip böbrek greftlerini kabul etmektedir. SCS'yi takiben, sıcak oksijenli kan soğuk iskemik greft içine geri yüklendiğinde reperfüzyon gerçekleşir. İskemik hasarın efektör fazı olan reperfüzyon, artmış doku hasarı ile karakterizedir [11-13].

sırasında soğuk IRI'yi sınırlamak için potansiyel bir terapötik stratejiböbrektransplantasyon, vazodilatasyon ve hücresel sinyalleşmede önemli fizyolojik roller oynadığı gösterilen endojen olarak üretilen bir gazotransmitter olan hidrojen sülfür (H2S) ile standart koruma solüsyonunun eklenmesini içerir [14-16]. H2S destekli UW solüsyonunda uzun süreli SCS'nin transplant kaynaklı soğuk IRI'yi azalttığını ve singeneik ve allojenik böbrek transplantasyonunun murin modellerinde greft sağkalımını iyileştirdiğini daha önce göstermiştik [17–19,41, 42]. Ancak bu çalışmalarda kullanılan H2S donör molekülleri klinik olarak uygulanabilir değildir. Bu, SDBY hastalarında kalsifilaksiyi, kanser tedavisinde sisplatin kaynaklı toksisiteyi tedavi etmek için Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanan bir H2S donör ilacı olan sodyum tiyosülfatın (STS) kullanılmasının düşünülmesine yol açmıştır. siyanür zehirlenmesi [20–23]. Son çalışmalar, STS'nin IRI'nin hayvan modellerinde koruyucu etkiler gösterdiğini göstermiştir [24–26]. Bununla birlikte, transplant kaynaklı soğuk renal IRI üzerindeki etkisi bilinmemektedir. Bu nedenle, bu çalışma, bir in vitro renal IRI modelinde ve singeneik ortotopik böbrek transplantasyonunun sıçan modelinde STS'nin renoprotektif etkilerini araştırmaktadır.

2. Malzemeler ve yöntemler

2.1. Deneysel in vitro protokol

Renal IRI sırasında STS'nin koruyucu etkilerini değerlendirmek için in vivo soğuk IRI sırasında hücresel koşulları taklit eden bir in vitro soğuk hipoksi ve sıcak reoksijenasyon hasarı modeli kullanıldı. Sıçan böbrek epitel hücreleri (NRK{{0}}E hücre hattı; ATCC, ABD) in vitro deneylerde kullanıldı çünkü bu hücreler iskemik hasara duyarlıdır [27] ve kullanımları sıçan ile tutarlıdır. Bu çalışmanın ikinci amacı için kullanılan transplantasyon modeli. Hücreler, 60 °C'de 20 dakika boyunca ısı ile inaktive edilmiş yüzde 10 fetal bovin serumu (FBS) ve yüzde 1 penisilin/streptomisin (P/S) içeren Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda (DMEM) kültürlendi. Hücreler, 37◦C, yüzde 21 O2 ve yüzde 5 CO2'lik normal büyüme koşullarında inkübe edildi. Kontrol hücreleri, deney öncesi hücreler için olanlarla aynı koşullardaydı. Deneysel hücreler, serumsuz ortam (SF), SF artı 200 nM AP39 veya SF'den elde edilen değişen konsantrasyonlarda (50 uM, 150 uM, 500 uM, 1 mM) sodyum tiyosülfat pentahidrat (STS) ile muamele edildi. 250 mg/mL enjekte edilebilir bir STS çözeltisi (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]). 200 nM AP39 konsantrasyonu kullanıldı çünkü daha önce bu konsantrasyonda AP39'un benzer bir soğuk IRI modelinde aynı hücre hattına karşı sitoprotektif olduğunu göstermiştik [20]. Hücreler daha sonra soğuk iskemik yaralanmayı indüklemek için HypOxystation H85 hipoksi odasında (HYPO2YGEN, ABD) hipoksik koşullar altında (yüzde 5 CO2, yüzde 0,5 O2, yüzde 95 N2) 24 saat 10 ◦C'de inkübe edildi. 10 ◦C'lik bir hipotermik sıcaklık kullanıldı, çünkü bu, yüzde 0,5'lik bir hipoksi seviyesi korunurken teknolojik olarak elde edilebilecek en düşük sıcaklıktı. Hipoksiyi takiben, deney hücreleri içeren ortam kontrol ortamı ile değiştirildi ve hücreler, reperfüzyonu ve bununla ilişkili hasarı simüle etmek için normal büyüme koşulları altında (37 ◦C, yüzde 21 O2 ve yüzde 5 CO2) inkübasyon yoluyla reoksijene edildi. 24 saatlik reoksijenasyonun ardından hücresel canlılık, hücrelerin FITC-konjuge Annexin-V (FITC-Annexin-V; BioLegend, ABD) ve 7-Aminoactinomisin D (7-AAD; BioLegend, ABD) ile boyanması yoluyla değerlendirildi. ), sırasıyla hücresel apoptoz ve nekrozu ölçer. Hücreler, CytoFLEX S (Beckman Coulter, ABD) kullanılarak akış sitometrisi yoluyla analiz edildi. FlowJo sürüm 11 (FlowJo LLC, ABD), verileri istatistiksel analiz için uygun şekilde kapatmak için kullanıldı.

2.2. deney hayvanları

Charles River'dan (St. Constant, QC, Kanada) satın alınan 275-300 g ağırlığındaki otuz erkek Lewis sıçanı, standart koşullar altında Western Üniversitesi'ndeki (Londra, ON) Hayvan Bakım ve Veterinerlik Hizmetleri tesisinde barındırıldı. Hayvan çalışmaları, Western University Council on Animal Care and Animal Use tarafından 2018-155 protokol kimliği ile onaylanmıştır.

2.3. Böbrek nakli modeli

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >yüzde 20 kilo kaybı) veya ölüm. İnsani uç noktalar günde iki kez kontrol edildi ve tüm sıçanlara, yüzde 40'lık bir akış hızında bir bölmede CO2'ye maruz bırakılarak ötenazi yapıldı. Ötenazi sırasında, sonuçlarda farklılıklara neden olabilecek herhangi bir cerrahi komplikasyon yoktu.

2.4. Böbrek fonksiyonunun analizi

Böbrek transplantasyonunu takiben, sıçanlar 14 gün boyunca metabolik kafeslerde izlendi ve sonra kurban edildi. Böbrek fonksiyonu parametrelerini (serum kreatinin, kan üre nitrojeni [BUN], idrar ozmolalitesi ve idrar çıkışı) belirlemek için POD 3, 5, 7, 10 ve 14'te kan ve idrar örnekleri toplandı. BUN ve serum kreatinin, böbrek nakli alıcılarından alındı ​​ve Sham ile ameliyat edilen sıçanlar, IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer makinesi (Markham, ON) kullanılarak ölçüldü. İdrar ozmolalite seviyeleri, 3320 Osmometre makinesi (Advanced Instruments, Norwood, MA) kullanılarak donma noktası ozmometrisi ile belirlendi ve şirket tarafından sağlanan standartlarla karşılaştırıldı.

2.5. Histopatolojik ve morfometrik analiz

Parafine gömülmüş böbrek dokuları 4 µm kalınlığında kesitler halinde kesildi ve histoloji için mikroskobik lamlara yerleştirildi. Kesitler, sırasıyla ATN ve apoptoz derecesini belirlemek için Hematoksilen ve Eosin (H&E), Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik ucu etiketlemesi (TUNEL) ile boyandı. H&E bölümlerine, aşağıdaki şemaya göre kör bir renal patolog tarafından ATN için bir puan verildi: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">Yüzde 75 greft ATN. Böbrek kesitleri ayrıca şu birincil antikorlarla boyandı: böbrek hasarı belirteci (KIM-1), makrofaj yüzey belirteci CD68 ve nötrofil spesifik enzim miyeloperoksidaz (MPO; Abcam®, Toronto, Kanada) ve ikincil antikorlarla görselleştirildi ve Üretici protokolüne göre Dako Envision System (Dako, Glostrup, Danimarka) kullanılarak DAB substrat kromojeni, ardından Eclipse 90i dijital ışık mikroskobu (Nikon® Instruments, New York) altında 10x büyütmede analiz edildi ve ImageJ yazılımı v. 1.8 (Ulusal) ile ölçüldü Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD).

2.6. Kantitatif PCR analizi

Toplam RNA, RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Kanada) kullanılarak POD 3'te elde edilen renal greft dokularından izole edildi ve oligo(dT)12– ile birlikte OneScript® Plus cDNA sentez Kiti (ABM, Kanada) kullanılarak cDNA'ya ters kopyalandı. Üreticinin protokolüne göre 18 primer. İzole edilmiş RNA ve cDNA, kullanımdan önce nanodrop (DeNavix DS-11 Spektrofotometre, Kanada) ile analiz edildi ve sırasıyla A260/280 derecelendirmesi sırasıyla > 1.95 ve > 1.8 oldu. Her qPCR örneğinin reaksiyon karışımı 20 µL hacme sahipti ve Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) protokolüne göre yapıldı ve CFX Connect Real-Time PCR Detection System makinesi (Bio-Rad, Kanada) kullanılarak analiz edildi. . Primer dizileri, beta-aktin, poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP), interferon-gama (IFN-), tümör nekroz faktör-alfa (TNF-), interlökin 6 (IL)'ye karşı Primer-BLAST yazılımı (NCBI) kullanılarak tasarlandı. -6), B hücreli lenfoma 2 (Bcl-2), Bcl-2- ile ilişkili X proteini (BAX), kaspaz 3, BH3 etkileşen alanlı ölüm agonisti (BID), c-Jun N-terminal kinaz 1/2 (JNK1/2), Pparg koaktivatör 1 alfa (PGC-1), mitokondri kompleksi I (NDUFB8), mitokondri kompleksi II (SDHB), mitojenle aktive olan protein kinaz 1/2 (ERK1) /2), nötrofil jelatinaz lipokalin (NGAL) ve böbrek hasarı molekülü-1 (KIM-1) genleri. İlgili tüm genler, beta-aktine karşı normalleştirildi. Gen ekspresyonunun kat değişiklikleri Sham ile çalıştırılan sıçanlarla karşılaştırıldı ve ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı.

2.7. istatistiksel analiz

Tüm istatistiksel analizler GraphPad (La Jolla, CA) Prism istatistiksel yazılım paketi, sürüm 9.0 kullanılarak yapıldı. Hayatta kalma verileri Kaplan-Meier hayatta kalma analizi ve log rank testi kullanılarak analiz edildi, qPCR gen ekspresyonu verileri ise eşleştirilmemiş tek yönlü t-testi kullanılarak analiz edildi. Diğer tüm veriler, gruplar arasındaki istatistiksel farklılıkları belirlemek için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin post-hoc testi kullanılarak analiz edildi. İstatistiksel anlamlılık p'de kabul edildi<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Sonuçlar

3.1. STS destekli serumsuz ortam, soğuk hipoksi/reoksijenasyon sırasında renal tübüler epitel hücre sağkalımını iyileştirir

Apoptoz ve nekroz için boyamadan sonra akış sitometrisi analizi, in vitro soğuk IRI sırasında SF ile tedavi edilen NRK{{0}}E hücrelerinin kontrol (normoksik) hücrelere kıyasla önemli ölçüde azalmış hücre canlılığı sergilediğini gösterdi (Şekil 1A; p < 0.05).="" tüm="" deneysel="" numuneler,="" normoksik="" koşullar="" altında="" büyütülen="" hücrelere="" göre="" önemli="" ölçüde="" daha="" düşük="" renal="" tübüler="" epitel="" hücre="" canlılığı="" gösterirken="" (p="">< 0.05),="" 150="" um="" ve="" 500="" um="" sts="" ile="" takviye="" edilmiş="" sf="" ile="" tedavi="" edilen="" hücreler,="" tedavi="" edilenlerden="" önemli="" ölçüde="" daha="" yüksek="" canlılık="" sergiledi.="" tek="" başına="" sf="" ortamı="" ile="" (şekil="" 1a;="" p="">< 0.05),="" bu,="" tek="" başına="" sf="" ortamı="" ile="" tedavi="" edilen="" hücrelere="" kıyasla="" belirgin="" şekilde="" azaltılmış="" apoptoza="" karşılık="" gelir="" (şekil="" 1b;="" p="">< 0.05).="" ek="" olarak,="" hücre="" canlılığındaki="" artış="" ve="" apoptozdaki="" azalma,="" 150="" µm="" ve="" 500="" µm="" sts="" ile="" optimum="" seviyelere="" ulaşıyor="" gibi="" görünmektedir,="" çünkü="" daha="" yüksek="" bir="" doz="" bu="" eğilimleri="" tersine="" çevirmiştir="" (şekil="" 1a="" ve="">

3.2. UW solüsyonunun STS ile eklenmesi, erken renal greft sağkalımını ve fonksiyonunu iyileştirir

Renal greftlerin STS destekli UW solüsyonunda korunması, özellikle ilk 3 günde yüzde 12,5 hayatta kalma gösteren STS takviyesi olmayan kontrol grubuna kıyasla POD 14'e (kurban günü) kadar yüzde 83 hayatta kalma ile alıcının hayatta kalmasını önemli ölçüde iyileştirdi (Şekil 1a). 2A; p < 0.05).="" ek="" olarak,="" sts="" takviyesi,="" tek="" başına="" uw="" tedavisine="" kıyasla,="" nakil="" sonrası="" erken="" dönemde="" greft="" fonksiyonunu="" belirgin="" şekilde="" iyileştirdi.="" serum="" kreatinin="" ve="" bun="" seviyeleri,="" pod="" 3'te="" hem="" uw="" hem="" de="" uw="" artı="" sts="" gruplarında="" önemli="" ölçüde="" arttı,="" bu="" da="" sham'a="" kıyasla="" azalmış="" idrar="" ozmolalitesi="" ile="" ilişkiliydi="" (şekil="" 2b,="" c="" ve="" 3a;="" p="">< 0.{{25)="" }}5).="" bununla="" birlikte,="" uw="" artı="" sts="" grubundaki="" serum="" kreatinin="" ve="" bun="" seviyeleri,="" uw="" grubuna="" kıyasla="" idrar="" ozmolalitesinde="" karşılık="" gelen="" bir="" artışla="" pod="" 3'te="" önemli="" ölçüde="" azaldı="" (şekil="" 2b,="" c="" ve="" 3a;="" p="">< 0.05).="" ilginç="" bir="" şekilde,="" uw="" artı="" sts="" grubundaki="" serum="" kreatinin="" ve="" bun="" seviyeleri,="" artan="" idrar="" ozmolalitesi="" ile="" birlikte="" pod="" 3'ten="" pod="" 14'e="" istikrarlı="" bir="" şekilde="" düştü="" ve="" sham'inkilerle="" karşılaştırılabilirdi="" (şekil="" 2b,="" c="" ve="" 3a).="" ayrıca,="" uw="" artı="" sts="" grubundaki="" idrar="" çıkışı,="" ameliyat="" sonrası="" ilk="" dört="" gün="" boyunca="" uw="" ve="" sham="" gruplarına="" kıyasla="" anlamlı="" olarak="" daha="" yüksekti="" (şekil="" 3b;="" p="">< 0.05).="" bununla="" birlikte,="" başlangıç="" ​​(sham)="" değerine="" doğru="" istikrarlı="" bir="" şekilde="" azaldı="" ve="" uw="" grubunda="" hayatta="" kalan="" sıçandaki="" idrar="" çıkışı="" pod="" 14'teki="" başlangıç="" ​​değerinden="" daha="" yüksek="" kalırken,="" pod="" 14'teki="" sham'inkiyle="" karşılaştırılabilir="" oldu="" (şekil="">

3.3. UW çözeltisine STS eklenmesi, böbrek transplantasyonundan sonra transplant kaynaklı hücre ölümünü hafifletir

POD 3 ve 14'te elde edilen böbrek kesitleri, apoptotik hücre ölümünün bir ölçüsü olarak TUNEL ile boyandı ve kör bir böbrek patologu tarafından skorlandı (Şekil 4A). UW grubundan böbrek greftleri, UW artı STS ve Sham gruplarından alınan böbreklere kıyasla daha yüksek TUNNEL skoru ile gösterildiği gibi POD 3'te önemli ölçüde daha yüksek apoptotik hücre ölümü sergiledi (Şekil 5A ve b; p < 0).{{11}="" }5).="" uw="" artı="" sts="" grubundan="" alınan="" greftler,="" aynı="" zaman="" noktasında="" ve="" pod="" 14'te="" sham'inkilerle="" karşılaştırıldığında="" önemli="" ölçüde="" farklı="" değildi="" (şekil="" 4b).="" ek="" olarak,="" hem="" uw="" hem="" de="" uw="" artı="" sts="" gruplarından="" alınan="" greftler,="" sham="" grubuna="" kıyasla="" pod="" 3'te="" önemli="" ölçüde="" artmış="" atn="" skorları="" gösterirken="" (şekil="" 5;="" p="">< 0.05),="" uw="" artı="" sts="" greftleri="" uw'ye="" kıyasla="" pod="" 3'te="" azalmış="" atn="" skorları="" gösterdi="" (şekil="" 5;="" p="">< 0.05).="" ayrıca,="" uw="" greftlerinin="" alıcıları="" pod="" 14'e="" kadar="" hayatta="" kalamazken="" ve="" dolayısıyla="" atn="" skorları="" pod="" 14'te="" belirlenemezken,="" uw="" artı="" sts="" greftlerinin="" alıcıları="" pod="" 14'e="" kadar="" hayatta="" kaldı="" ancak="" sham="" grubuna="" kıyasla="" önemli="" ölçüde="" artan="" atn="" skorları="" gösterdi="" (şekil="" 1).="" 5;="" p=""><>

3.4. STS destekli UW solüsyonunda korunan böbrek greftleri, böbrek transplantasyonundan sonra azalmış yaralanma belirteçleri ve inflamatuar infiltrat sergiledi

POD 3 ve 14'te elde edilen böbrek kesitleri, proksimal tübüler hasarın yanı sıra CD68 (makrofaj belirteci) ve MPO'yu (nötrofil belirteci) saptamak için KIM-1 ile boyandı ve kör bir böbrek patologu tarafından skorlandı (Şekil 6A, 7A, ve C). KIM-1, CD68 ve MPO'nun böbrek dokusu ekspresyonu, UW artı STS ve Sham gruplarına kıyasla POD 3'teki UW grubunda önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 6B, 7B ve D; p < {{11}="" }.05)="" uw="" artı="" sts="" greftlerinde="" bu="" belirteçlerin="" ifadesi="" sham="" on="" pod="" 14'e="" kıyasla="" önemli="" ölçüde="" farklı="" değildi="" (şekil="" 6b,="" 7b="" ve="" d;="" p=""> 0.05).

3.5. UW çözeltisine STS takviyesi, proinflamatuar, proapoptotik ve mitokondriyal genlerin renal ekspresyonunu baskıladı

Pro-inflamatuar, pro-apoptotik, mitokondri hedefli ve böbrek hasarı belirteçlerinin gen ekspresyonu, POD 3'te elde edilen transplante böbreklerde qRT-PCR yoluyla belirlendi. Pro-inflamatuar genlerin IFN-, TNF- ve IL ekspresyonu{{8 }}, POD 3'teki UW artı STS greftlerine göre UW greftlerinde belirgin şekilde arttı (Şekil 8A; p < 0.05)="" ve="" pro-apoptotik="" genler="" parp,="" bax="" ile="" aynı="" modeli="" izledi="" ,="" kaspazlar-3,="" bid,="" jnk1="" ve="" jnk2="" (şekil="" 8a;="" p="">< 0.05)="" anti-apoptotik="" bcl-2="" ifadesi="" uw'de="" biraz="" artarken="" artı="" sts="" grubu,="" uw="" grubu="" ile="" karşılaştırıldığında,="" bu="" artış="" istatistiksel="" anlamlılığa="" ulaşmadı="" (şekil="" 8a).="" ek="" olarak,="" uw="" greftlerinde="" mitokondriyal="" genler="" pgc-1="" ,="" ndufb8="" (kompleks="" i)="" ve="" sdhb="" (kompleks="" ii)="" ekspresyonu,="" uw="" artı="" sts="" greftlerine="" kıyasla="" önemli="" ölçüde="" azaldı="" (şekil="" 8b;="" p="">< 0="" .05)="" erk1="" ve="" erk2="" ifadelerinde="" ise="" tersi="" gözlenmiştir="" (şekil="" 8b;="" p="">< 0.05).="" ayrıca,="" uw="" greftlerinde="" kim-1="" gen="" ekspresyonu,="" uw="" artı="" sts="" greftlerine="" kıyasla="" önemli="" ölçüde="" artarken="" (şekil="" 8c;="" p="">< 0.05),="" uw="" artı="" sts="" greftlerinde="" ngal="" ekspresyonundaki="" azalma="" istatistiksel="" anlamlılığa="" ulaşmadı.="" uw="" greftleri="" (şekil="" 8c;="" p=""> 0.05).

4. Tartışma

Bu çalışma, transplant kaynaklı soğuk renal IRI'yi azaltmak, greft kalitesini iyileştirmek ve alıcının sağkalımını uzatmak için klinik olarak uygun bir FDA onaylı H2S donörü olan STS ile standart koruma solüsyonunun eklenmesini ortaya koymaktadır. Renal IRI'nin in vitro modelini ve singeneik ortotopik böbrek transplantasyonunun sıçan modelini kullanarak, uzun süreli SCS sırasında UW solüsyonunun STS ile desteklenmesinin organ koruyucu olduğunu ilk kez gösterdik.

İn vitro modelimizde birincil bulgu, serumsuz ortama STS takviyesinin böbrek epitel hücrelerini soğuk hipoksiden ve sıcak reoksijenasyon kaynaklı apoptozdan koruduğu ve mitokondrinin koruyucu etkilerini gösterdiğimiz önceki çalışmamızla tutarlı olarak canlılığı arttırdığıdır. - Soğuk renal IRI'nin bir in vitro modelinde H2S donör ilacı AP39'u hedeflemek [20]. İlginç bir şekilde, 1 mM'lik daha yüksek bir STS konsantrasyonu, faydalı etkileri tersine çevirmiştir; bu, STS'nin, hormesis olarak adlandırılan, daha yüksek bir konsantrasyonun sitotoksik olduğu, daha düşük bir konsantrasyonun sitoprotektif olduğu, iki fazlı bir doz-yanıt fenomeni sergilediği anlamına gelir. Mitokondriyal hasar, renal IRI'nin önemli bir sonucudur, çünkü mitokondriyal geçirgenlik, adenozin trifosfat (ATP) üretimini inhibe edebilir ve doku hasarının yıkıcı bir aracısı olan reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu artırabilir [13]. Son zamanlarda mitokondrinin STS aktivitesinin birincil bölgesi olduğu öne sürülmüştür. STS'nin sadece glutatyon bağımlı indirgeme yoluyla mitokondride H2S ürettiği ve sülfür oksidasyon yolu yoluyla bunun tersini yaptığı bilinmekle kalmaz, aynı zamanda mitokondriyal ATP sentezini korur, ROS üretimini azaltır ve elektron taşıma zincirindeki (ETC) karmaşık enzim aktivitelerini geliştirir [24]. ,28–30]. Ek olarak, son çalışmalar, STS'nin mitokondriyal biyogenez ve ATP üretiminin pozitif düzenleyicisi olan PGC-1 ifadesini önemli ölçüde arttırdığını göstermiştir ki bu bizim in vivo gözlemimizle uyumludur. Bu moleküler mekanizmalar, böbrek nakli modelimizde mitokondriyal ETC kompleksleri I ve II'nin (sırasıyla NDUFB8 ve SDHB) önemli ölçüde artmış ekspresyonunu, STS destekli UW çözeltisinde korunan böbrek greftlerinde gözlendiği gibi artan hayatta kalma ve fonksiyon ile açıklayabilir.

İn vitro sonuçlarımıza dayanarak, STS'nin koruyucu etkisinin, soğuk IRI'nin greft disfonksiyonuna ve artan nakil sonrası komplikasyonlara önemli bir katkıda bulunduğu bir nakil modeli kullanarak in vivo uygulanabilir olup olmadığını araştırmaya karar verdik. Bulgularımız, STS destekli UW solüsyonunda renal greftlerin uzun süreli (24 saat) SCS'sinin, yalnızca UW solüsyonunda korunan greftlere kıyasla, azalmış serum kreatinin ve BUN seviyeleri, daha yüksek idrar çıkışı ve daha uzun alıcı sağkalımı ile karakterize edilen greft kalitesini ve işlevini önemli ölçüde iyileştirdiğini göstermektedir. . Klinik böbrek transplantasyonundan sonra bile idrar çıkışının aciliyetinin, gecikmiş greft fonksiyonunu (DGF) ele almak için diyalizin gerekli olup olmadığını belirleyen kritik bir sonuç olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, STS'nin transplantasyondan hemen sonra idrar çıkışını artırdığına ve POD 14'teki Sham grubuyla karşılaştırılabilir olduğuna dair gözlemimiz umut verici bir bulgudur. STS destekli UW solüsyonunda korunan greftlerin transplantasyonundan sonra böbrek fonksiyonunda gözlenen iyileşme de önemli bir sağkalım avantajı sağladı. Kantitatif olarak, STS takviyesi greftin ömrünü öyle uzatmıştır ki, UW artı STS greftleri alan sıçanların yüzde 83'ü (5/6) POD 14'e (kurban günü) kadar hayatta kalırken, alıcı sıçanların sadece yüzde 12.5'i (1/8) hayatta kalmıştır. STS takviyesi olmadan UW solüsyonunda korunan greftler. Bu çalışmadan elde edilen bu bulgu, aynı zamanda, H2S (GYY4137) takviyesi olmadan 24 saat boyunca greft alıcı sıçanların sadece yüzde 14'ünün (7'de 1'i) UW çözeltisinde korunduğu, POD 14'e kadar hayatta kaldığı önceki çalışmamızla da uyumludur [20] .

Böbrek fonksiyon parametrelerinde iyileşme göstermenin yanı sıra, STS takviyesi aynı zamanda anti-apoptotik genleri yukarı regüle ederken ve CD68-pozitif makrofajları azaltırken proapoptotik ve proinflamatuar genlerin doku ekspresyonunu aşağı regüle ederek renal greft apoptozu ve inflamasyonu da inhibe etti. Tamamen azaltılmış KIM-1 ekspresyonu ve ATN ile sonuçlanan MPO-pozitif nötrofiller ve nihayetinde korunmuş böbrek morfolojisi. Bu inflamatuar sitokinlerin soğuk IRI sırasında hücre ölümünün aracıları olduğu bilinmektedir [31] ve UW artı STS greftlerindeki azalmaları muhtemelen STS'nin vasküler endotelyal tek tabakadaki endotelyal geçirgenliği azaltmak, sitokin üretimini azaltmak için iyi bilinen özelliklerinden kaynaklanmaktadır. ve anti-inflamatuar sitokinlerin üretimini ortaya çıkarır [32]. Ayrıca, UW solüsyonuna STS takviyesinin, nörolojik hastalıklarda TNF- ve IL-6 düzeylerini azaltarak, STS'nin anti-inflamatuar aktivitesi üzerine önceki bir çalışmayla eşleşen pro-inflamatuar genlerin ekspresyonunu aşağı regüle ettiği bulgumuz [33] ,34]. Mekanik olarak, STS, güçlü hidrojen bağları yoluyla aktif bölgesine bağlanarak ve böylece doğal substratın aktif bölgeye erişimini önleyerek kaspaz-3'ı inaktive eder ve sonuçta apoptozu durdurur [35]. STS ayrıca apoptotik sinyalleşmede kritik bir rol oynayan bir protein olan JNK'nin aktivasyonunu da bloke eder [35], bu da STS'nin kaspaz3 ve JNK üzerindeki aşağı düzenleyici etkisine ilişkin bulgumuzu destekler. Bununla birlikte, bu moleküler mekanizmaları keşfetmek için ek deneyler yapmadığımız için bu tür mekanizmaların bu çalışmada işlevsel olup olmadığını belirleyemiyoruz.

İn vitro deneyimizin önemli bir sınırlaması, kullandığımız 10 ◦C, hipoksik ortamı tehlikeye atmadan teknolojik olarak elde edilebilecek en düşük sıcaklık olduğundan, mevcut standart koruma sıcaklığı 4 ◦C'yi [36] kullanma konusundaki teknik zorluğumuzdur. Bu, hücresel fizyolojik süreçler ve ayrıca koruma teknikleri açısından gerçek bir farktır. Potansiyel bir çözüm, kimyasal olarak indüklenen hipoksiyi plastik bir torbada kullanmak ve SCS'nin klinik ayarlarını yansıtmak için 4 ◦C'lik bir buzdolabına koymaktır. Bununla birlikte, bu anaerobik atmosfer oluşturma torbaları, hipoksik ortamı indükleyen kimyasal bileşikler bu koşul altında işlev gördüğünden, ılık sıcaklıklarda (21–37 ◦C) kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Gelecekteki çalışmalar, klinik SCS ayarlarını taklit etmek için hipoksi odasındaki sıcaklığı optimize etmeyi hedeflemelidir. Hipoksik bir ortamdan ödün vermeden 4 ◦C'lik tutarlı bir sıcaklığa ulaşmak, deneysel in vitro soğuk IRI modelinde gözlenen fenotiplerin tutarlı bir şekilde ifade edilip edilmediğini belirlememize izin verecektir. İn vitro deneyin dışında, sıçan nakli modelimiz de dezavantajlı değil. Klinik böbrek transplantasyonunda yalnızca tek yumurta ikizlerine uygulanabilen, genetik olarak aynı donörler ve immünolojik uyumlu alıcılar olan singeneik böbrek transplantasyonu gerçekleştirdik, oysa çoğu klinik böbrek transplantasyonu allojeniktir (genetik olarak farklı donörler ve alıcılar). Allojenik transplantasyon, transplant alıcılarını, donörün insan lökosit antijenlerini (HLA; immün yanıtı indükleyen ve düzenleyen moleküller) tanımlamak, donörler ve alıcılar arasındaki immünolojik uyumluluğu belirlemek ve organ reddini önlemek için transplantasyondan önce immünolojik testlerden geçmeye zorlar [37,38]. STS kullanan gelecekteki çalışmalar allojenik transplantasyonu dikkate almalıdır. Diğer bir sınırlama böbrek nakli modeli, canlı donörlere odaklandığımız gerçeğidir, kardiyak ölümden sonra (DCD) donörlerden elde edilen optimal olmayan greftler, dünya çapında birçok nakil merkezinde donör böbreklerinin kaynağı olarak giderek daha yaygın hale gelmektedir [39]. DCD, donör organları SCS sırasında soğuk iskemik sürelere ek olarak çeşitli sıcak iskemi periyotlarına maruz bırakır ve canlı donörlere kıyasla artmış DGF oranları ve azalmış greft sağkalımı ile ilişkilidir [40]. Bu nedenle, gelecekteki çalışmalar, bu modelde STS'nin IRI'ye karşı etkisini değerlendirmek için DCD böbrek nakli modelini dikkate almalıdır.

Sonuç olarak, çalışmamız, böbrek greftlerinin uzun süreli SCS'si sırasında standart koruma solüsyonunun klinik olarak uygulanabilir bir H2S donör ilacı ile desteklenmesinin, transplant kaynaklı soğuk renal IRI'ye karşı koruduğunu, genel greft kalitesini ve greft fonksiyonunu iyileştirdiğini ve transplant alıcısının sağkalımını uzattığını göstermektedir. Klinik böbrek transplantasyonunda uzamış soğuk iskemik süre ile DGF riskinin arttığı ve bu da önemli bir klinik endişe uyandırdığı düşünüldüğünde, STS'nin uzamış SCS sırasında böbrek greftlerini koruduğu ve transplantasyon sonrası DGF'yi önlediği gözlemi, böbrek naklini azaltabilecek veya önleyebilecek büyük bir klinik umut vermektedir. Yakın gelecekte klinik böbrek transplantasyonunda DGF insidansı. Bu nedenle, koruma çözümlerine STS'yi eklemenin gelecekteki yararı, bu devam eden soruna potansiyel bir çözüm sunabilir. Genel olarak, bu çalışma, STS ve diğer H2S donörlerinin organ IRI'sine karşı sitoprotektif etkilerini destekleyen, özellikle transplant kaynaklı soğuk renal IRI'de greft sonuçlarını iyileştiren, büyüyen literatüre katkıda bulunmaktadır. Bu stratejiler, nakledilebilir organ havuzunu artırabilecek uzun süreli soğuk iskemik sürelere maruz kalan daha fazla greft kullanımını kolaylaştırabilir.

CRediT yazarlık katkı beyanı

Tüm yazarlar bu makalenin gönderilmesini kabul etmiştir. Herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Referanslar

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford, et al., Diyalizdeki tüm hastalarda, diyalizde transplantasyon bekleyen hastalarda ve ilk kadavra nakli alıcılarında mortalitenin karşılaştırılması, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, ve diğerleri, Sistematik inceleme: klinik olarak ilgili sonuçlarda diyaliz ile karşılaştırıldığında böbrek nakli, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, ve diğerleri, İtalya'da DCD'den böbrek transplantasyonunun maliyet etkinliği, Transplant. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, İskemi- reperfüzyon yaralanması, Eur. J. Travma Ortaya Çıktı. cerrah. 33 (6) (2007) 600-612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Organ koruma: gelecek on yıl için mevcut kavramlar ve yeni stratejiler, Transfus. Med. anne. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Soğuk iskemi ve kadavra renal allogreftlerin uzun süreli sağkalımının azalması, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo ve diğerleri, Gecikmiş greft fonksiyonunun ve soğuk iskemi süresinin renal allogreft sağkalımı üzerindeki ana etkileri, Nephrol. Aramak. Nakil. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, ECD transplant alıcılarında soğuk iskemi süresinin greft sağkalımı üzerindeki etkisi: eşleştirilmiş böbrek analizi, Am. J. Nakil. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Gecikmiş greft fonksiyonuyla ilişkili alıcı risk faktörleri: eşleştirilmiş böbrek analizi, Transplantasyon 91 (6) (2011) 666-671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay, et al., Her ek soğuk iskemi süresi, böbrek transplantasyonunu takiben greft yetmezliği ve mortalite riskini önemli ölçüde artırır, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojeviç, V. Lezaic, M. Bajcetic, Mitokondri hedefli antioksidanlar: böbrek iskemi-reperfüzyon hasarında gelecek perspektifleri, Oxid. Med. Hücre Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Mitokondriyal kalsiyum yüklenmesinin neden olduğu oksidatif stres, Ann. NY Acad. bilim 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Mitokondrinin iskemi/reperfüzyon hasarındaki rolü, Transplantasyon 73 (4) (2002) 493-499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Böbrek transplantasyonunda gazotransmitterlerin ortaya çıkan rolü, Am. J. Nakil. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Hidrojen sülfür ve hücre sinyali: takım oyuncusu mu hakem mi? Bitki Fizyol. Biyokimya. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, Yeni bir endojen gazlı K(ATP) kanal açıcı olarak H(2)S'nin vazorelaksan etkisi, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008-6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, ve diğerleri, Hidrojen sülfür tedavisi, soğuk depolama sırasında renal allogreft iskemi-reperfüzyon hasarını hafifletir ve allojenik böbrek transplantasyonunu takiben erken transplant böbrek fonksiyonunu ve hayatta kalmayı iyileştirir, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Şener, Ek hidrojen sülfür, böbrek greft apoptozunu hafifleterek transplant böbrek fonksiyonunu korur ve uzun süreli soğuk iskemi-reperfüzyon hasarından sonra alıcının hayatta kalmasını uzatır ve inflamasyon, BJU Int. 110 (11 Puan C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, ve diğerleri, Hidrojen Sülfür, renal greftleri spesifik mitokondriyal eylemler yoluyla uzun süreli soğuk iskemi-reperfüzyon hasarına karşı korur, Am. J. Nakil. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Akut siyanür zehirlenmesi için Sodyum tiyosülfat: sıçan modelinde bir çalışma, Ann. Eczacılık Fr. 63 (2) (2005) 154-161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri ve diğerleri, Sodyum tiyosülfat, Cisplatin, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.