Cistanche Deserticola polisakkaritinin yapısal karakterizasyonu ve yüksek glikoz kaynaklı HK üzerindeki koruyucu etkisi -2 hücre hasarı

1.2.5.8 Mitokondriyal membran potansiyelinin tespiti

HK -2 hücreler, 6- kuyu plakalarında aşılandı ve kültürlendi. Karşılık gelen stimülasyondan sonra, 6- kuyu plakalarındaki kültür ortamı aspire edildi ve "1.2.5.6" altındaki gruba güçlü bir pozitif kontrol grubu (POS) eklendi. Bir kez PBS ile durulayın, 1 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve 1 mL JC -1 Boyama Çözeltisi iyice karıştırıldı ve karanlıkta 20 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirildi. Hücreler iki kez JC -1 boyama tamponu (1 ×) ile yıkandı ve görüntüler bir floresan mikroskobu kullanılarak toplandı.

 

 

 

 

Cistanche Faydaları

 

1.2.5.9 Hoechst33258 Hücre apoptozunu tespit etmek için yöntemi

Hücre slaytları 6- kuyu plakalarına yerleştirildi ve logaritmik büyüme fazındaki HK -2 hücreler, 6- kuyu plakalarında 1 x 105 hücre/oyuklu bir hücre yoğunluğunda tohumlandı. Karşılık gelen ilaç müdahalesinden sonra, boyama için Hoechst33258 boyama kiti kullanıldı. Hücre apoptozu tespit edildi ve görüntüler bir floresan mikroskobu kullanılarak toplandı.

 

1.2.5.10 Tespit etmek için Western Blotting

TLR4/NF-κB sinyal yolu ile ilişkili proteinlerin ekspresyonu, hücrelerin "1.2.5.6" altındaki yönteme göre gruplandırılması ve tedavi edilmesiyle analiz edildi. Bundan sonra, hücrelerdeki toplam protein, protein ekstraksiyon kitinin talimatlarına göre ekstrakte edildi. Protein niceliği, bisinkoninik asit (BCA) protein nicelleştirme yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi ve protein denatüre edildi ve -20 derece buzdolabında saklandı.
% 10 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), poliviniliden florür (PVDF) membran transferi, zarı Tris içeren Tween -20 tamponuna koyun
Hücreler, TRIS tamponlu bir salin içinde ara -20 (TBST) odası ile inkübe edildi ve oda sıcaklığında bloke edildi. TLR4, NF-κB p65, p-nf-κB p65 ve -actin için birincil antikorlar kullanıldıBöbrek dokusunu tespit edin(antikorlar, 1: 2000 hacim oranında TBST çözeltisine seyreltildi) gece boyunca 4 derece. TBST
Membran, ikincil antikor (antikor ve TBST çözeltisi, 1: 2000 hacim oranında seyreltildi) ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi. Membranı 3 kez TBST ile yıkadıktan sonra, tespit için ECL ışıldayan reaktif ilave edildi ve protein ekspresyonu jel görüntüleme ile tespit edildi. Image J yazılımı, iç referans olarak -actin ile protein gri tonlamalı değerini analiz etmek için kullanıldı.

1.3 Veri İşleme

Veri analizi için SPSS 23. 0 ve GraphPad Prism 6.01 yazılımı kullanıldı. Örnek verilerin normalliğini test etmek için Shapiro-Wilk testi kullanıldı ve örnek verilerin varyansının homojenliğini test etmek için kahverengi forsythe veya bartlett testi kullanıldı. Normal dağılım ve varyans homojenliği ile ölçüm verileri ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. (x ± S) açıklamayı belirtir, test için tek yönlü ANOVA kullanılmıştır ve istatistiksel olarak anlamlı ise Dunnett'in yöntemi ikili karşılaştırma için kullanılmıştır.
Eşit olmayan varyansların post hoc ikili karşılaştırmaları için, Dunnett'in T3 yöntemi p <0 ile kullanıldı.

2 sonuç ve analiz

2.1 CDP'lerin toplam şeker, üronik asit ve protein içeriğinin belirlenmesi

Polisakkarit içeriğinin doğrusal regresyon denklemi: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999. Deney, 7 ila 70 ug/ml arasında, standart glikoz konsantrasyonu (X) ile absorbans değeri (Y) arasında iyi bir doğrusal ilişki olduğunu gösterdi. Numunedeki polisakkarit içeriğinin hesaplanan yüzdesi:%81.02.
Standart uronik asidin doğrusal regresyon denklemi: y=1. 1571x + 0. 0015, r=0. 9968. Deney, 20 ila 100 ug/ml arasında, standart üronik asit konsantrasyonu (X) ile absorbans değeri (Y) arasında iyi bir doğrusal ilişki olduğunu gösterdi. Numunedeki üronik asit içeriği:%4.43.
Standart protein doğrusal regresyon denklemi: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. 9969. Deney, 20 ila 1 00 µg/ml arasında, standart protein konsantrasyonu (X) ile absorbans değeri (Y) arasında iyi bir doğrusal ilişki olduğunu gösterdi. Numunedeki protein içeriği:%4.00.

 

2.2 CDP'lerin moleküler ağırlık dağılımı

CDP'lerin moleküler ağırlığı, yüksek performanslı jel geçirgenlik kromatografisi tandem kolon tespiti ile belirlendi. RT AS (x) ve LGMP AS (y) ile, LGMP-RT kalibrasyon eğrisinin denklemi şu şekilde hesaplandı: y=-0. 1951x + 11. 661, r²=0}. 9956; RT (x), LGMW (y), LGMW-RT kalibrasyon eğrisi denklemi: y=-0. 1973x + 11. 738, r²=0. 9956; RT (x), LGMN (y), LGMN-RT kalibrasyon eğrisi denklem: y=-0. 1964x + 11. 7, r²=0. 9955; Standart eğriye dayanarak, her numunenin moleküler ağırlığını hesaplamak için hesaplama formülü elde edilir. Numunenin moleküler ağırlık spektrumu aşağıdaki gibidir ve hesaplama sonuçları Tablo 2'de gösterilmiştir. Sonuçlar, CDP'lerin çoklu elüsyon piklerine sahip olduğunu ve polisakkaritlerin moleküler ağırlığının esas olarak heterojen küçük moleküler ağırlıklı heteropolisakkarit olan 3 ila 8 kDa arasında dağıtıldığını göstermiştir. Şekil 1'de gösterildiği gibi.

 

 

2.3 CDPS monosakkarit kompozisyonu

CDP'ler iyon kromatografisi ile analiz edildi ve kromatogram Şekil 2'de gösterildi. Sonuçlar, 16 monosakkarit standardı tutma süresine kıyasla CDP'lerde 5 monosakkaritin tespit edildiğini gösterdi. Spektrumları monosakkarit standartlarıyla karşılaştırarak, CDP'ler esas olarak glikoz, galaktoz, ramnoz, mannoz ve sükrozdan oluşuyordu. , Arabinose. Molar oranı 0. 734 0 5: 0. Molar oranından, CDP'lerin esas olarak glikoz, galaktoz ve ramnozdan oluştuğu görülebilir. Bunlar arasında glikoz%73.405, galaktoz%5.381 ve ramnoz%5,02'dir.

 

Not: Man.Mannose, GLC N.glukozamin hidroklorür, rha.rhamnoz, glc-ua.glukuronik asit, gal-ua.galakturonik asit, Gal N.galaktosamin hidroklorür, glc.glukoz, gal.galaktoz, xyl.xylos, ara. Arabinoz, fuc.fukoz.

2.4 CDPS Fourier kızılötesi analizi

3246 cm -1 yakınındaki tepe, hidroksil grubunun OH germe titreşiminden kaynaklanır, 2900 cm -1 yakınına yakın emme piki, -Ch3'ün CH germe titreşim zirvesidir ve 1594 cm -1 'nın CHS, CDRS'nin kts'unun 1594 cm -1' ın, CDS'nin kts'unun, CDRS'nin ktps'ının pikidir. 1374.31 cm -1: Bu absorpsiyon pik, özellikle metil (-Ch3) veya metilen (-h 2-) polisakkarit gruplarında CH bağlarının deformasyon titreşimi ile ilişkili olabilir. 1018.38 cm -1 'daki emilim pik, polisakkaritlerin eter bağlarında veya ester bağlarında yaygın olarak bulunan CO bağının germe titreşimi ile ilişkili olabilir. 1200-1000 cm -1 aralığındaki üç zayıf emilim piki, CDP'lerde piranoz varlığını gösterir. Emilim 870 ve 930 cm'deki pikler -1, CDP'lerde -tip glikosidik bağların bulunabileceğini gösterir. Bkz. Şekil 3.

 

2.5 CDP'lerin normal HK -2 hücreleri üzerindeki toksik etkileri

CON ile karşılaştırıldığında, uygulamadan 24 saat sonra, CDPS konsantrasyonu 1000 ug/mL'ye ulaştıktan sonra hücre canlılığı önemli ölçüde azalmaya başladı (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Tartışma ve Sonuç

Polisakkaritler10'dan fazla monosakkaritten oluşan yüksek moleküler ağırlıklı polimerlerdir. Polisakkaritlerin sahip olduğu bildirildiİmmünomodülatör, antioksidan, anti-enflamatuar ve hipoglisemik etkiler[15]. Cistanche Deserticola'daki farmakolojik olarak aktif maddelerden biri olarak, CDP'ler önemli tıbbi değere sahiptir. Bu çalışma önceden CDP'lerin yapısını karakterize etti ve yüksek şeker ortamının neden olduğu HK -2 hücrelerinin hasarını artırabileceklerini buldu.

 

Polisakkaritlerin karmaşık yapısı, monosakkaritlerin tipi ve oranının, polisakkaritlerin göreceli moleküler kütlesi ve glikosidik bağların tipinin temel etkileyen faktörlerdir [16]. Orta derecede nispi moleküler kütle, polisakkaritlere daha aktif bölgeler verir ve daha güçlü biyolojik aktivite sergileyebilir.
Bununla birlikte, büyük moleküler ağırlık transmembran direncini artıracak, polisakkarit emilimini engelleyecek ve aktiviteyi etkileyecektir. Tersine, küçük moleküler ağırlıklı polisakkaritler etkili aktif yapılar oluşturamayabilir, bu da azalmış aktivite ile sonuçlanır [17]. Polisakkaritlerin biyolojik aktivitesini araştırırken, monosakkarit bileşimini, nispi moleküler kütle ve glikosidik bağ tipini kapsamlı bir şekilde dikkate almak gerekir [18]. Bu çalışmada iyon kromatografisi, CDP'lerin esas olarak Xu ve ark. [19]. Yüksek performanslı sıvı jel kromatografisi ile ölçülen CDP'lerin ağırlık ortalaması moleküler ağırlıkları sırasıyla 3444, 4198 ve 8031 ​​kDa idi. Yang ve ark. [20] benzerdi. CDP'ler -tip glikosidik bağlar içerebilir ve -glukoz veya -mannoz içerebilir. -Glukoz veya -mannozdan oluşan polisakkaritler, Toll benzeri reseptör 4 (TLR4) veya TLR2 tarafından daha kolay tanınır [21].
DN, diyabetin en ciddi mikrovasküler komplikasyonlarından biridir ve patogenezi oksidatif stres, mitokondriyal disfonksiyon ve hücre apoptozu ile yakından ilişkilidir [22]. Bu çalışma, CDP'lerin TLR4/NF-KB sinyal yolunu ve moleküler mekanizmasını düzenleyerek yüksek glikoz kaynaklı HK -2 hücreleri üzerindeki koruyucu etkisini araştırmıştır.

Yüksek glikoz koşulları altında, HK -2 hücreleri önemli oksidatif stres gösterir [23]. Çalışmalar, yüksek şeker seviyelerinin hücre içi ROS üretimini önemli ölçüde arttırdığını bulmuştur. Bu aşırı ROS, hücre zar lipitlerine doğrudan zarar verebilir ve lipit peroksidasyon ürünü MDA içeriğinde bir artışa yol açabilir [24]. Aynı zamanda, önemli antioksidan savunma sistemleri olan SOD ve GSH-PX aktiviteleri önemli ölçüde azalmıştır, bu da hücrelerin antioksidan kapasitesinin ciddi şekilde hasar gördüğünü gösterir [25]. Oksidasyon-antioksidasyon sistemindeki bu dengesizlik, TLR4'ün ekspresyonunu ve aktivasyonunu daha da desteklemektedir [26]. Önceki çalışmalar, aşırı ROS'un TLR4 tarafından tehlike ile ilişkili moleküler paternler (DAMPS) olarak tanınabileceğini ve pozitif bir geri bildirim döngüsü oluşturabileceğini göstermiştir [27]. Bu çalışmada, CDP'lerin ön tedavisi ROS seviyelerini, artmış SOD ve GSH-PX aktivitelerini ve MDA içeriğini azaltmıştır. Bu kapsamlı antioksidan etki, CDP'lerin çoklu hedefler aracılığıyla oksidatif stres tepkilerini düzenleyebileceğini düşündürmektedir.
TLR4/NF-κB sinyal yolunda, aktive edilmiş TLR4, akış aşağı adaptör proteinlerini alarak IKK kompleksinin aktivasyonunu teşvik eder, bu da IκB'nin fosforilasyonuna ve bozulmasına yol açar [28]. Bu çalışma, yüksek glikozun IκB'nin fosforilasyon seviyesini önemli ölçüde arttırdığını ve NF-κB P65'in sitoplazmadan çekirdeğe translokasyonuna yol açtığını gözlemledi. Çalışmalar, P65'in nükleer translokasyonunun sadece oksidatif stresi ağırlaştırdığını değil, aynı zamanda mitokondriyal fonksiyonu da etkilediğini göstermiştir [29].
Yüksek glikoz tedavisinin mitokondriyal membran potansiyelinde önemli bir azalmaya neden olduğu, kırmızı floresandan yeşil floresansa kayma gösteren, mitokondrilerin iç ve dış zarları arasındaki proton gradyanının bozulduğunu gösteren JC -1 boyaması ile gözlendi. Mitokondriyal disfonksiyon, ROS üretimini daha da kötüleştirerek kısır bir döngü oluşturur [30]. CDP'ler ön tedavi, mitokondriyal membran potansiyelinin stabilitesini koruyabilir ve bu koruyucu etki, TLR4 ekspresyonu ve NF-κB aktivasyonu inhibe ederek elde edilebilir.
Mitokondriyal disfonksiyon ve kalıcı oksidatif stres sonuçta hücre apoptozuna yol açar [31]. Hoechst boyaması, yüksek glikoz tedavi grubundaki hücre çekirdeklerinin yoğunlaşma, yoğunlaşma ve fragmantasyon gibi belirgin tipik apoptotik morfolojik değişiklikler gösterdiğini ortaya koymuştur [32]. Bu değişiklikler mitokondriyal aracılı intrinsik apoptoz yolu ile yakından ilişkilidir: mitokondriyal membran potansiyelinin kaybı, sitokrom C'nin salınmasına, kaspaz kaskadının aktivasyonuna ve sonuçta hücre apoptozuna yol açar [33]. CDPS ön -tedavi grubundaki hücrelerin nükleer morfolojisi temel olarak normaldi ve boyama düzgündü, bu da CDP'lerin mitokondriyal fonksiyonu koruyarak ve oksidatif stresi inhibe ederek hücre apoptozunu önlediğini düşündürmektedir.
Özet olarak, bu çalışma sistematik olarak oksidatif stres göstergelerini (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), mitokondriyal fonksiyonu (JC -1) ve Hoechst), CDP'lerin etki mekanizmasını açıklayan TLR4/NF-κB sinyal yolu anahtarı molekülleri ile birleştirdi:
İlk olarak, hücrelerin antioksidan kapasitesini iyileştirerek, ROS seviyesini azaltarak ve TLR4 aktivasyonunu azaltarak; İkincisi, TLR4 ekspresyonunu ve IκB'nin fosforilasyonunu inhibe ederek, NF-κB'nin nükleer translokasyonunu bloke ederek; Son olarak, mitokondriyal fonksiyonu geliştirerek, hücre apoptozunu inhibe ederek. ölüm, böylece DN'ye karşı koruyucu bir rol oynamak. Bu çok hedefli sinerjistik etki, CDP'lerin DN tedavisinde iyi uygulama beklentileri göstermesini sağlar. Sonraki çalışmalarda polisakkarit yapısı, X-ışını kırınımı, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi ile daha da belirlenecektir. Ek olarak, ortalama moleküler ağırlık sonuçları CDP'lerin heterojen polisakkaritler olduğunu göstermektedir. Daha sonra, homojen polisakkaritleri ayıracağız ve saflaştıracağız, polisakkarit yapısını ve biyolojik aktiviteyi tespit edeceğiz ve yapı-aktivite ilişkisini netleştireceğiz.