Cistanche Deserticola polisakkaritinin yapısal karakterizasyonu ve yüksek glikoz kaynaklı HK üzerindeki koruyucu etkisi -2 hücre hasarı

Soyut:

 

Amaç: Cistanche Deserticola polisakkaritlerinin (CDP'ler) yapısını ve insan proksimal tübüler epitel hücrelerinin (HK {0}}}) yaralanmasının koruyucu etkisini ve mekanizmasını incelemek. Yöntemler: Kimyasal bileşim, moleküler ağırlık, monosakkarit bileşimi ve CDP'lerin olası yapısı, sülfürik asit fenol yöntemi, hidroksil bifenil yöntemi, Coomassie Brilliant mavi yöntem, iyon kromatografi yöntemi, yüksek performanslı jel permeasyon kromatografisi ve evrensel kromatografi ile tespit edildi. CDP'lerin HK -2 yaralanması üzerindeki koruyucu etkisi ve mekanizması, yüksek glikoz tarafından indüklenen HK -2 hücrelerinin bir hasar modeli oluşturularak değerlendirildi. ve arabinoz ve -glikosidik bağ olabilir. Yüksek glikoz tarafından indüklenen HK -2 hücrelerinin oksidatif hasarını ve yüksek glikozun indüklenen HK -2 hücrelerinin mitokondriyal membran potansiyelinin hasarını azaltabilir. Toll benzeri reseptör 4 (TLR4) proteininin nispi ekspresyonu ve HK -2 hücrelerinde P -nükleer faktör (NF) -κB p65 / -k -κB / -actin oranı, farklı konsantrasyonlara (p <0.05, p <0.01) müdahale sonrasında önemli ölçüde azaldı. Sonuç: CDP'ler yüksek azalabilirGlikoza bağlı renal tübüler epitel hücreHücre proliferasyonunu teşvik etmek ve oksidatif stres ve apoptozu inhibe etmek için TLR4 / NF-κB'yi inhibe ederek yaralanma.

 

Anahtar Kelimeler: Cistanche Deserticola Polisakkarit; İnsan renal tübüler epitel hücreleri; Oksidatif stres; TLR4/NF-KB yolu

 

 

 

Diyabet Nefropati için Cistanche (DN)

 

Diyabet Nefropatisi (DN)son evre böbrek hastalığının önde gelen nedenidir ve hastaların yaşamını ve sağlığını ciddi şekilde tehdit eder [1]. Renal tübüler yaralanma DN'nin oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynar. Hemodinamik anormallikler, oksidatif stres, enflamatuar yanıt ve yüksek şekerli bir ortamın neden olduğu metabolik anormallikler, renal tübüler epitel hücrelerinin apoptozunu ve nekrozunu indükleyerek böbrek tübüler hasara yol açabilir [2,3]. Böbrekteki TLR4, TLRS ailesinin bir üyesidir ve ilgili sinyal transdüksiyonu DN'nin oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır [4]. Yüksek glikoz koşulları altında, böbrekte yüksek TLR4 ekspresyonu NF-κB yolunu aktive ederek hücresel oksidatif hasarı ağırlaştırabilir ve HK -2 hücre apoptozuna neden olabilir [5, 6].
Cistanches Herba, geleneksel bir tıbbi ve yenilebilir bitki olan Cistanche Deserticola Ycma ve (veya) Cistanche tubulosa (Schenk) Wight fosfor yaprakları ile kurutulmuş etli gövdedir. Tatlar tatlı, tuzlu,

Isınıyor ve giriyorböbrek ve kalın bağırsak meridyenleri. Böbrek Yang'ı tonlandırma, özü ve kanın iyileştirilmesi ve bağırsakları nemlendirme ve kabızlığı hafifletme etkileri vardır. [7] Polisakkaritler, Cistanche Deserticola'nın ana aktif bileşenlerinden biridir. Cistanche deserticola su ekstraktındaki polisakkaritlerin içeriği nispeten yüksektir, literatür içeriğin 29.598 ila 39.609 mg/g olduğunu bildirmektedir [8]. Esas olarak glikoz, galaktoz, ramnoz, arabinoz, fruktoz, vb. Monosakkaritlerden oluşur ve bağışıklık aktivitesini düzenleme, anti-yaşlanma, öğrenme ve belleğin iyileştirilmesi, sinirleri koruma, karaciğer hasarına direnme, anti-virus ve anti-tümör gibi birçok farmakolojik etkiye sahiptir [9]. Son yıllarda, çok sayıda çalışma geleneksel Çin tıbbındaki polisakkaritlerin diyabetik nefropatiyi iyileştirebileceğini göstermiştir. Çin bitkisel polisakkaritlerinin çok hedefli, çok yolcu özellikleri ve önemli etkileri diyabetik nefropatide müdahale etmede büyük bir potansiyel göstermektedir [10]. Wang ve ark. [11] Banyan polisakkaritleri, glikoz ve lipit metabolizmasının iyileştirilmesinde, enflamatuar yanıtların azaltılmasında ve bağırsak karaciğer ekseni aracılığıyla tip 2 diyabetik farelerin bağırsak mikrobiyotasının düzenlenmesinde önemli etkiler göstermiştir. Araştırma ekibi tarafından yapılan önceki çalışmalar, Cistanche Deserticola'nın su ekstraktının, yüksek şekerli ve yüksek yağlı bir ortamda HK -2 hücrelerinin sağkalım oranını artırabileceğini, hücre apoptozunu, oksidatif stresi ve inflamasyon seviyelerini düzenleyebileceğini ve diyabetik nefropati üzerinde potansiyel bir terapötik etkiye sahip olduğunu göstermiştir [12]. Hayvan deney sonuçları, CDP'lerin farelerde diyabetik nefropatiyi etkili bir şekilde iyileştirebileceğini ve patolojik sonuçların renal tübüler fibrozun önemli ölçüde iyileştiğini göstermiştir [13]. Bununla birlikte, yüksek glikoz kaynaklı HK -2 hücre modelinin korunmasında Cistanche Deserticola polisakkaritlerinin rolü hakkında çok az çalışma vardır. Potansiyel farmakolojik aktivite ve polisakkaritlerin mekanizması göz önüne alındığında, bu çalışma, sülfürik asit fenol yöntemi, hidroksibifenil yöntemi, Coomassie parlak mavi yöntemi kullanarak kimyasal bileşimi, moleküler yapıyı ve moleküler yapısını tespit etmeyi amaçlamaktadır. Kütle, monosakkarit bileşimi ve olası yapı analiz edildi ve CDP'lerin HK -2 hasarı ve etki mekanizması üzerindeki koruyucu etkisini değerlendirmek için yüksek glikoz tarafından indüklenen HK -2 hücrelerinin bir hasar modeli oluşturuldu. DN tedavisinde CDP'lerin potansiyel uygulanması için teorik temel ve deneysel kanıt sağlar.

1 Malzeme ve Yöntem
1.1 Malzeme ve Aletler

CDP'ler (polisakkarit içeriği> 8 0%, parti numarası: 2306019, shaanxi xintianyu şirketi); Dapagliflozin (DAPA, Parti Numarası: BMS -512148, Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); insan renal tübüler epitel hücreleri HK -2 (parti numarası: 20231014, Actt Company, ABD); MEM kültür ortamı, fetal sığır serumu (lot numarası: 20231014, 20231014, Gibco Company, ABD); PBS Buffer (lot numarası: 20230906, Hyclone Company, ABD); % 0.25 EDTA içeren tripsin sindirim çözeltisi (lot numarası: 20240411, Anhui Biosharp Company); CCK -8 Hücre Canlılık Algılama Kiti (Toplu Numara: 20240415, Wuhan ELARite Biotechnology Co., Ltd.); Süperoksit dismutaz (SOD), malondialdehit (MDA), glutatyon peroksidaz
Peroksidaz, GSH-PX) Tespit Kiti (Parti No.: 20240505, 20240423, 20240423, Shanghai Youxuan Biotechnology Co., Ltd.); Hoechst33258 Boyama Apoptoz Kiti (Parti No.: 20240223, Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.); JC -1 Boyama
Mitokondriyal membran potansiyel tespit kiti (parti no.: 20240319, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Diklorofloresein diasetat (DCF-DA) Hücre Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Tespit Reaktif
Kit (Lot No.: 20231225, Pekin Solebow Technology Co., Ltd.); TLR4 monoklonal antikoru, fosforile nükleer faktör-κB p65 (fosfo-nf-κB p65, p-nf-κB p65) monoklonal antikor (10032512, 0028965, Wuhan Sany Biotechnology Co., ltd.).

ICS5000 iyon kromatografi, mul-tigo mikroplaka okuyucu (Thermo Fisher, ABD); PowerPac HC+Mini Protein Elektroforez Aleti (Biorad, ABD); TS2 Ters Mikroskop (Nikon, Japonya); Lc -10 Yüksek performanslı bir sıvı kromatografi, ri -20 Bir diferansiyel dedektör (Shimadzu Technology Co., Ltd., Japonya); 105-103-101 (8 mm × 300 mm) tandem jel kolonu (BRT Company, İngiltere); CPA225D Elektronik Denge, Eppendorf5424 Santrifüj (Sartorius, Almanya).

 

1.2 Deneysel Yöntemler
1.2.1 CDP'lerin toplam şeker, üronik asit ve protein içeriğinin belirlenmesi

Yöntem referansa göre takip edildi [14]. CDP'lerin toplam şeker içeriği fenol-sülfürik asit yöntemi ile belirlendi; CDP'lerin üronik asit içeriği, m-hidroksibifenil kolorimetrik yöntem ile belirlendi; ve CDP'lerin protein içeriği Coomassie parlak mavi yöntemle belirlendi.

 

1.2.2 Moleküler Kütle Tespiti

Polisakkaritlerin moleküler ağırlık dağılımı, yüksek performanslı jel permeasyon kromatografisi tandem kolonları ile tespit edildi. A series of standard dextran (Dextran P{{0}}, P-10, P-20, P-50, P-100, P-200, P-400 and P-800) and samples were dissolved in 0. 0 5 mol/l kullanımdan önce. Nihai konsantrasyon 5 mg/ml idi, çözülmek için vortekslendi ve 10 dakika boyunca 12 0 00 r/dakikada santrifüjlendi. Süpernatan aspire edildi ve 0.22 μm su mikro gözenekli zar ile süzüldü. Yüksek hızlı santrifüjlemeden sonra, mobil faz olarak 0.05 mol/L NaCl kullanıldı. Kromatografik kolon BRT 105-103-101 (8 mm × 300 mm); Akış hızı 0.7 ml /dakika idi; sütun sıcaklığı: 40 derece; Enjeksiyon hacmi: 25 μl; dedektör: diferansiyel dedektör RID -20 a; Analiz Süresi: 62 dk. Analiz için yukarıdaki kromatografik yöntemi seçin, tutma süresini elde edin ve pik moleküler ağırlığın (LGMP) (LGMP) (LGMP) ve tutma süresini (RT) apsis (LGMP-RT) üzerinde çizin. Standart eğri: Yukarıdaki yönteme göre, ağırlık ortalaması moleküler ağırlık (MW) tutma süresi standart eğri LGMW-RT ve sayı ortalaması moleküler ağırlık (MN) tutma süresi standart eğri LGMN-RT moleküler ağırlığı elde etmek için yapıldı. Hesaplama formülü. Numune tutma süresini formüle değiştirerek moleküler ağırlık (MP, MW, MN) elde edilebilir.

1.2.3 Monosakkarit kompozisyonu

Monosakkarit bileşimi iyon kromatografisi kullanılarak belirlendi. Uygun miktarlarda 16 monosakkarit standardı (fukoz, ramnoz, arabinoz, galaktoz, glikoz, ksiloz, mannoz, fruktoz, riboz, galakturonik asit, glukuronik asit, aminogalaktoz hidroklorür, glukozamin-ddrochlorid), glukozamin-ddrochlorid, nasetil-ddroklorür, molionik asit, hürürlü, mansiyon, mansiyon, mansiyon, mansiyon, hürür, mansiyon, 2-klon, mansiyon, mansiyon, mansiyon, mansiyon, mansiyon, mansiyon, mansiyon, mansiyon oldu, mansiyon oldu. 3 mol/L trifloroasetik asitin (TFA), 3 saat boyunca 120 derecede hidrolize edildi, azot ile kurutuldu ve iyice karıştırmak ve standart stok çözeltisini hazırlamak için deiyonize suyu vorteksini çıkarmak için ilave. Her monosakkarit standart çözeltisini alın ve konsantrasyon standardını karışık standart olarak doğru bir şekilde hazırlayın. Mutlak nicelik yöntemine göre, farklı monosakkaritlerin kütleleri belirlendi ve molar oranı monosakkaritlerin molar kütlesine göre hesaplandı.
Polisakkarite 2 mL 3 mol/L TFA ekleyin ve 3 saat boyunca 12 0 derecesinde reaksiyona girin. Reaksiyon sırasında N2 koruma için kullanıldı. Azaltılmış basınç altında buharlaşmadan sonra çözün. Karıştırmaya 5 mL su ve girdap ekleyin. 5 0 µL alın ve 950 uL deiyonize su ekleyin. RPM'de 5 dakika santrifüj. Süpernatan, 0.22 uM mikrofiltrasyon membranından süzüldü ve iyon kromatografisi ile analiz edildi. Sütun Dionex karbopactm PA20 (3 mm × 150 mm); Mobil aşama A: H2O; B: 15 mol/lnaoh; C: 15 mol/ L NaOH & 100 mol/ L Naac; Akış hızı: 0.3 ml/dakika; Enjeksiyon hacmi: 25 uL; Sütun Sıcaklığı: 30 derece ;. Dedektör: Elektrokimyasal dedektör; Elüsyon gradyanı bkz. Tablo 1.

 

Tablo 1 Mobil Faz Gradyan Elüsyon Tablosu

 

 

1.2.4 Kızılötesi Spektrum Tespiti

1 mg kuru polisakkarit ve KBR tozu tartın, bir harçta öğütün ve karıştırın ve bir tablet pres kullanarak ince tabakalara bastırın. Analiz, 4500 ~ 400cm -1 dalga sayısı aralığında Fourier dönüşümü kızılötesi spektrometresi kullanılarak gerçekleştirildi.

 

1.2.5 CDP'lerin yüksek glikoz kaynaklı HK üzerindeki koruyucu etkisi -2 Diyabetik nefropatide hücreler

1.2.5.1 HK -2 Hücre Kültürü

HK {{0}} hücreler yeniden canlandırıldıktan sonra,% 10 fetal sığır serumu ve% 1 çift antikor içeren MEM tam ortamında kültürlendi ve hücreler, duvara uyum sağlamak için 37 derece,% 5 CO2 ve doymuş nemde bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirildi. . Hücreler% 80 ila% 90'a yükseldiğinde,% 0.25 tripsin ile sindirilir ve alt kültürlenir. Müteakip deneyler için logaritmik büyüme fazındaki HK -2 hücreler kullanıldı.

 

1.2.5.2 CDP'lerin hazırlanması stok çözeltisi ve dozlama konsantrasyonu.

3 0 mg CDP'leri doğru bir şekilde tartın, 5 mg/ml CDPS stok çözeltisi hazırlamak için 6 mL MEM yüksek glikoz tam ortam ekleyin ve 4 derecelik bir buzdolabında saklayın. Kullanırken, belirli bir CDPS anne çözeltisi hacmini ölçün, kültür ortamı ekleyin, iyice karıştırın, 0.22 um steril bir filtre ile sterilize edin ve uygun konsantrasyona sahip bir örnek çözeltisi hazırlayın.

 

1.2.5.3 CDP'lerin normal HK üzerindeki etkileri -2 hücreler

Logaritmik büyüme fazındaki HK -2 hücreler, 96- kuyu plakaları 3000 hücre/oyuk yoğunluğunda tohumlandı. Ön deneysel sonuçlara göre, hücreler normal bir kontrol grubuna (kontrol grubu, CON), farklı kütle konsantrasyonlarına (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 ug/ml) ayrıldı.
Sadece kültür ortamı içeren boş bir grup kuruldu; 24 saat ve 48 saat boyunca kültür ortamı veya ilaçları ile kültürlendikten sonra, her bir oyuğa% 10 CCK -8 içeren 100 ul kültür ortamı ilave edildi ve hücreler, 1,5 saat boyunca ışıkta bırakılmasını önlemek için 37 derecede inkübe edildi. Her kuyucuğun optik yoğunluğu (OD), bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'lik bir dalga boyunda ölçüldü ve hücre canlılığı (%) "hücre canlılığı (%)=[OD, boş kuyucuk iyi) formülüne göre hesaplandı. hücreler.

1.2.5.4 HK -2 Hücre Yüksek Glikoz Modelleme Süresi ve Konsantrasyon Taraması
Glikoz (glikoz, GLC) stok çözeltisi (10 mg/ml) hazırlayın ve tam kültür ortamı ile seyreltin, sırasıyla kullanım için sırasıyla 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ve 80 mmol/L modelleme konsantrasyonlarına. Logaritmik büyüme fazındaki HK -2 hücreler, 96- iyi plakalarda 3000/oyukta tohumlandı ve Con, model grubu (model, MOD) ve boş ayar grubu ayarlandı ve farklı konsantrasyonlarda tam kültür ortamı ve yüksek glikoz kültür ortamı verildi. , eşit miktarda tam kültür ortamı, 24 saat ve 48 saat boyunca kültür ve "1.2.5.3" yöntemine göre hücre canlılığını tespit edin.

 

1.2.5.5 CDP'lerin model hücrelerin sağkalım oranı üzerindeki etkisi

"1.2.5.4" nin deneysel sonuçlarına göre, logaritmik büyüme fazındaki HK -2 hücreler, kuyucuk başına 3000 hücreli bir yoğunlukta 96- kuyu plakaları içinde tohumlandı. Hücreler CON, MOD ve 50, 100 ve 200'lik farklı kütle konsantrasyonlarına ayrıldı ve hücreler 400 ug/ml, 400 ug/ml ve 800 ug/ml CDP'de kültürlendi. Hücresiz bir boş ayar grubu kuruldu. Con ve boş ayar grupları, eşit miktarda tam ortam ile ilave edildi. MOD ve her ilaçla tedavi edilen grup 60 mmol/L GLC ile ilave edildi ve 24 saat kültürlendi. , kültür ortamını atın, 24 saat ve 48 saat boyunca kültür ortamı veya karşılık gelen ilaçlar ve kültür ekleyin ve "1.2.5.3" altındaki yönteme göre hücre sağkalım oranını tespit edin.

 

1.2.5.6 CDP'lerin model hücrelerde oksidatif stres göstergeleri üzerindeki etkileri

"1.2.5.5" deki deneyin sonuçlarına göre hücreler, CON, MOD, yüksek doz CDPS grubu (CDPS-H, 400 mg/kg), orta doz CDP grubu (CDPS-M, 200 mg/kg), düşük doz CDP'ler grubuna (CDPS-L, 100 mg/kg) ve dapagliflozin (dapagliflozin (dapaglifin) olmayan (DAPagliflozin (dapaglifloz) (DAPAGLISIL) 'ye bölündü. Sıfır ayarlama grubu, modellemeden sonra kültür ortamı veya karşılık gelen ilaçlar 24 saat boyunca ilave edildi ve kültürlendi. Proteinler toplandı ve lizatlar protein konsantrasyonu düzeltmesi ile aynı seviyeye normalleştirildi. Her bir gösterge kitinin talimatlarına göre, her hücre grubundaki MDA, GSH-PX içeriği ve SOD aktivitesi tespit edildi.

 

1.2.5.7 HK'de ROS tespiti -2 hücreler

Hücre süspansiyonunu bir 6- kuyu plakasına ekleyin ve hücreler tek tabakalı haline gelene ve karşılık gelen stimülasyon alana kadar bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücreleri 3 kez önceden soğutulmuş PBS ile yıkayın ve serumsuz mem ortamı ile seyreltin. DCF-DA floresan boya, 10 uMol/L'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltildi. Boya bir 6- kuyu plakasına ilave edildi, hücreler 3 kez önceden soğutulmuş PBS ile yıkandı ve DCFH-DA floresan boya, serumsuz MEM ortamı ile 10 uMol/L nihai bir konsantrasyona seyreltildi. µmol/L, boya bir 6- kuyu plakasına ilave edildi, boya atıldı, hücreler üç kez serumsuz MEM ortamı ile yıkandı ve daha sonra görüntüler bir floresan mikroskobu altında toplandı.