Glukokortikoidle İndüklenen Sıçan Modelinde Cistanche Deserticola ve Pirinç Şarabı Buharlama Ürünlerinin Nöroendokrin-Bağışıklık Fonksiyonu Üzerine Çalışma-Ⅰ

1. Giriş

Cistanche Deserticola"Çöl ginseng'i" olarak adlandırılan, yüzyıllardır yang-tonik bitki olarak kullanılan geleneksel bir Çin tıbbıdır.böbreği canlandırmak ve yang'ı güçlendirmek[1] Sekiz tür ve bir varyasyonCistanche Herba Çin'de kaydedildi ve yalnızcaCistanche DeserticolaYC Ma veCistanche tubulosa(Schenk) Wight Çin Farmakopesinde kayıtlıdır [2]. Farmakolojik çalışmalar şunu gösterdi:Cistanches Herbanöroprotektif [3], immünomodülatör [4], kardiyoprotektif [5], antifatigue [6], antiinflamatuar [7], hepatoprotektif [8], antioksidatif [9], antibakteriyel [10], müshil [11] ve antitümör sergilemiştir. etkiler [12]. Bu cinsin bildirilen biyolojik aktivitelerinin geniş spektrumu, onun karmaşık ve değişken fitokimyasal bileşimine bağlanmıştır.Cistanche Deserticolafeniletanol glikozitler, iridoidler, polisakkaritler [13], vb. içerir. Feniletanoid glikozitlerin içeriği orijinal tıbbi malzemelerde en yüksek seviyededir [14].

BÖBREK PHGS'İNİ GÜÇLENDİRMEK İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA %75 ECH %30 ACT %12

Çin Materia Medica'nın (CMM) İşlenmesi, geleneksel Çin tıbbı teorisine göre tedavi, dağıtım ve hazırlıkların yapılmasına yönelik farklı gereksinimleri karşılayan geleneksel bir farmasötik tekniktir. Bu işlenmiş ürünlere kliniklerde kullanılan kaynatma parçaları adı verilmektedir. İşleme, ham ilaçların toksisitesini azaltma etkinliğini arttırmayı amaçlamaktadır. 2015 Çin Farmakopesi, kalın Cistanche dilimlerinin (CD) ve pirinç şarabıyla buharda pişirilmiş Cistanche'nin (WCD) klinikte kaynatma parçaları olarak kullanılabileceğini kaydetti. Araştırma grubumuz, Cistanche'nin pirinç şarabıyla buharda pişirilmesinden sonra müshil etkisinin azaldığını ve yaşlanma karşıtı ve böbrek-yang canlandırıcı etkilerinin arttığını gösterdi [15].

Böbrek-yang eksikliği sendromunda hipotalamus-hipofiz-adrenal bez-timus bezi (HPAT) ekseninin işlevi bozulmaktadır [16]. Böbrek-yang eksikliği olan hastalarda aynı zamanda yaygın bağışıklık fonksiyon bozukluğu da vardır. HPA ekseni disfonksiyonu immün yetmezlik ile yakından ilişkilidir. Nöroendokrin-bağışıklık ağı (NEI) teorisi, bağışıklık ve nöroendokrin sistemlerinin birçok ligand ve reseptörü paylaştığını [17] ve hipotalamusun, nöroendokrin ile bağışıklık sistemi arasında bağlantı kuran pivot olarak kabul edildiğini göstermektedir.

Bu çalışmada, eksojen kortikosteroid enjeksiyonu ile model sıçanlarda böbrek-yang eksikliğini kopyaladık ve endokrin-bağışıklık fonksiyonu perspektifinden Cistanche Deserticola'nın farklı işlenmiş ürünlerine yanıt olarak böbrek-yang eksikliğinin mekanizmasını araştırdık.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Malzemeler ve Reaktifler

Cistanche Deserticola, 2019.5 yılında Alashan Neimenggu'dan toplandı ve Prof. Yanjun Zhai (Eczacılık Fakültesi, Liaoning Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi, Çin) tarafından Cistanche Deserticola YC Ma'nın kurutulmuş etli sapları olarak tanımlandı. Kupon örnekleri Liaoning İşleme Mühendisliği Teknoloji Merkezinde saklandı.

Standart ajugol bileşikleri Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd.'den (Chengdu, Çin) satın alındı; cistanosid F,ekinakozit, cistanosid A ve izoakteosidMust Company'den (Sichuan Çin) satın alındı; Acteoside Dalian Meilun Bio'dan satın alındı. Co., Ltd. (Dalian, Çin). MS dereceli asetonitril ve metanol, Merck KGaA'dan (Darmstadt, Almanya) satın alındı. HPLC dereceli formik asit, Merck KGaA'dan (Darmstadt, Almanya) satın alınmıştır. Pirinç şarabı Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd.'den (Zhejiang, Çin) satın alındı.

Kortikosteron (CAS: 50-22-6, saflık > %98, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin çiğneme hapları (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), sıçan ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 ve IL-10 ELISA tespit kitleri Nanjing Jiancheng Co., Ltd.'den satın alınmıştır. Sıçan kortizol ELISA kiti BOSK Co. tarafından sağlanmıştır, sıçan CD4 antikoru, CD8a antikoru (no. 561833 ve 559976), RBC lizatı (Solarbio, R1010), PBS tampon çözeltisi (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM ve -aktin yukarı ve aşağı akış primerleri Guangzhou Invitrogen Co. tarafından sağlanmıştır. Ters Transkripsiyon Kiti (no. RR037A) ve cDNA Sentez Kiti (no. 10000068167) Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. tarafından sağlanmıştır. Kloroform, izopropanol, %75 etanol ve üretan çözeltinin tümü analitik olarak saftı ve Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. tarafından üretildi. Ultra saf su, Milli-Q sistemi (18.2 MΩ, Millipore, MA, ABD) tarafından üretildi.

2.2. Deneysel Aletler

Bir enzim işaretleyici (Thermo, model 3530911931), otomatik plaka yıkayıcı (model HBS- 4009), dijital ekranlı itme-çekme kuvvet ölçer (model VICTOR- 50N), yüksek hızlı dondurma santrifüjü (model Sigma 3k15) ), ultramikro spektrofotometre (model B-50Q), gen amplifikatörü (model L96G), gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR (model StepOne), akış sitometresi (model AC66051710132), parafin mikrotom (model Laika), mikroskop (Olympus) , model BS-53) ve bir saf su cihazı (model F7JA36507) kullanıldı.

2.3. UPLC-Q-TOF-MS ve Farmakolojik Deneyler için Örneklerin Hazırlanması

WCD aynı gruptan işlendiCistanche Deserticolalaboratuvarımızda. WCD'nin hazırlanması için kuru CD parçaları (5 mm kalınlığında) (100 g) pirinç şarabı (30 mL) ile aşılandı, yüksek basınçta (1.25 kPa) 4 saat buharda pişirildi ve ardından 55 derecede kurutuldu.

Kaba CD ve WCD tozları 0,5 saat boyunca 10 x %95 etanol içerisine batırıldı, her seferinde 3 kez 1 saat boyunca geri akışla ekstrakte edildi, filtrelendi ve filtrelenenler 3 kez birleştirildi. Etanol azaltılmış basınç altında geri kazanıldı ve uygulama için ekstrakt elde edildi. Ekstrakt (1 mL) %50 metanole eklenerek toplam hacim 20 mL'ye getirildi ve içerik analizi için 4 derecede saklandı.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. CD ve WCD Ekstraktlarının Analizi için UPLC-QqQ-MS Koşulları

2.4.1. LCThMS Analitik Koşullar

Veri toplama ve işlemeyi gerçekleştirmek için MassLynx 4.1 Analyst yazılımına sahip UPLC-MSThMS sistemi kullanıldı. Analitik sütun, 40 derece C sıcaklıktaki bir Acquity UPLC BEH C18'di (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm). Hareketli faz 0%1 formik asit sulu çözeltisi (A) ve %0,1 formik asit içeren asetonitril (B) idi. Elüsyon gradyanı %3 B ile 0,00–1,00 dakika, %3–%11,5 B ile 1,01–2,00 dakika, 2,01–3 idi.{{29 }} dakika %12 B ile, 3,01–4.00 dakika %15 B ile, 4,01–5.00 dakika %20 B ile, 5,01–6.00 dakika ile 22 % B, %25 B ile 6,01–8,00 dakika ve %10 B ile 8,01–9,00 dakika. Akış hızı 0,3 mLTh dk ve enjeksiyon hacmi 1,0 μL idi.

Negatif iyon modunda bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağı ile donatılmış Waters üçlü dörtlü kütle spektrometresi (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, ABD) kullanıldı. Desolvasyon gazı, 250 derece sıcaklıkta 500 LThh akış hızına sahip nitrojendi. Tespit edilen tüm bileşikler çoklu reaksiyon izleme (MRM) modunda ölçüldü; Tablo 1 enerji parametrelerini gösterir ve Tablo 2 analiz edilen bileşenlerin kalibrasyon eğrilerini gösterir.

2.4.2. Referans Maddelerin Hazırlanması

Tubulosid A (3.02 mg), ekinekozit (3.00 mg), 2'-asetillakteosid (2,34 mg), akteozit (2,45 mg), izoakteozit (0,61 mg), cistanosid F ( 2,14 mg), salidrosid (3,39 mg), geniposidik asit (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) ve katalpol (2,39 mg) metanol içerisinde çözülerek bir stok çözelti hazırlandı. Stok çözelti, çalışma standardı çözeltileri için uygun konsantrasyonları elde etmek üzere metanol ile seyreltildi. Hazırlanan tüm solüsyonlar kullanılmadan önce 4 derecede saklandı.

2.5. Hayvan Modellerinin Hazırlanması ve Gruplandırılması

SD erkek sıçanlar (180–220 g), Liaoning Changsheng Biotechnological Co.'dan satın alınmıştır, Hayvan izin numarası: SCXK (Liao) 2015–0001. Tüm sıçanlar, 25 derecede ve %30-50 bağıl nemde yiyecek ve suya serbestçe erişebilecek şekilde tutuldu. Hayvanlar deneylerden önce 7 gün boyunca barındırıldı.

Yüz sıçan rastgele 10 gruba ayrıldı: boş kontrol (BC) grubu, model kontrol (MC) grubu, pozitif kontrol (PC) grubu, pirinç şarabı kontrol (WC) grubu, yüksek dozda CD (CD) -HD) grubu, CD orta doz (CD-MD) grubu, CD düşük doz (CD-LD) grubu, WCD yüksek doz (WCD-HD) grubu, WCD orta doz (WCD-MD) grubu ve WCD düşük doz (WCD-LD) grubu. CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD ve CD-LDThWCD-LD dozları sırasıyla 5,48 gTh(kg ∙ gün), 2,74 gTh (kg ∙ gün) ve 1,37 gTh(kg ∙ gün) idi. 40 gün boyunca PC grubu için doz 1.646 gTh(kg ∙ gün) ve WC grubu için 1 mLTh100 g idi. Uygulamadan sonraki 6. günde, sıçanlara kortikosteron su süspansiyonu (kortikosteron + 0.1% dimetil sülfoksit + 0.1% Tween-80 + 0.9% sodyum klorür) deri altından enjekte edildi; BC grubu için [18]. Kortikosteron konsantrasyonu 5 gThL ve dozu 0,1 mLTh100 g idi. BC grubundaki sıçanlara aynı dozda enjeksiyon yoluyla normal salin + 0.1% dimetil sülfoksit + 0.1% Tween- 80 + 0.9% sodyum klorür verildi.

2.6. HPA Eksen Fonksiyonlarının Belirlenmesi

2.6.1. Ağırlık, Sıcaklık ve Tutma Gücü Testi

Her 3 günde bir ağırlık testi yapıldı ve her 6 günde bir ateş ölçüldü. deney sırasında. 39. günde arka ekstremitenin maksimum kuvveti kavrama ölçer ile ölçüldü. Sıçanlar pürüzsüz platformlara yerleştirildi ve arka bacaklarının direği tutmasını sağladı. Sıçanlar, kuyruk çekildiğinde, çekme kuvveti kavramayı aşana kadar geriye doğru hareket etmeyi önlemek için içgüdüsel olarak herhangi bir nesneyi yakalayacaktır. Fare kavramasını kaybettiğinde, ön yükseltici maksimum kavrama kuvvetini otomatik olarak kaydedebiliyordu.

2.6.2. Serumda T, CRH, ACTH, CORT ve Kortizol Düzeyinin Belirlenmesi

Son uygulamadan bir saat sonra sıçanlara, bir üretan çözeltisinin (20 gTh100 mL) intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla anestezi uygulandı. Daha sonra kan örnekleri toplandı, 3500 r'de 15 dakika santrifüj edilerek serum elde edildi ve -20 derecede saklandı. T, CRH, ACTH, CORT ve kortizol konsantrasyonları, üreticinin talimatlarına göre sıçan ELISA kitleri ile ölçüldü.

2.6.3. Mikroskop Gözlemleri

HE boyama ile adrenal bez dokusunun morfolojik yapısı gözlendi. Adrenal doku %10 paraformaldehid içerisinde sabitlendi, etanolde dehidrate edildi, ksilen solüsyonu ile şeffaf hale getirildi, geleneksel yöntemlerle gömüldü, 4 µm kalınlığında dilimler halinde kesildi, ksilen solüsyonu ile mumu alındı, etanol gradyanı ile hidratlandı ve daha sonra hematoksilen ve eozin ile boyandı. boyama çözümü. Ksilen ile şeffaf hale getirildikten sonra plaka nötr zamk ile kapatılarak mikroskop altında incelendi.

2.6.4. Adrenal Bezde Bax, Bcl-2, Kaspaz-3, Fas ve FasL Protein İfadesinin İmmünohistokimyasal Boyanması

Formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş sıçan adrenal bölümleri, 4 mikron kalınlığında kesildikten sonra parafinden arındırıldı ve rehidre edildi. Endojen peroksidaz aktivitesinin bloke edilmesi için kesitler, hidrojen peroksit bloğunda 10 dakika süreyle önceden inkübe edildi. Kesitler 0,01 M sitrat (pH 6,0) içerisine daldırıldı ve kaynayana kadar ısıtıldı. İşlem 5-10 dakika sonra tekrarlandı. Soğutulduktan sonra kesitler PBS (pH 7,2-7,6) ile 1-2 kez yıkandı, yaklaşık 5 dakika oda sıcaklığında bırakıldı ve 2-3 kez PBS (pH 7,2-7,6) ile yıkandı. Oda sıcaklığında %5 BSA bloklama solüsyonu ilave edildi ve kesit üzerindeki fazla sıvı 20 dakika sonra çalkalanarak uzaklaştırıldı. FasTh FasL, Bcl-2ThBax ve kaspaz-3'a özgü seyreltilmiş birincil antikorlar (PBS ile seyreltilmiş 1:100) ilave edildi ve 37 derecede 1 saat veya 4 derece gece boyunca inkübe edildi. Kesitler 2-3 kez PBS (pH 7,2-7,6) ile yıkandı. Daha sonra biyotinlenmiş keçi anti-fare IgG'si eklenerek kesitler 20-37 derecede 20 dakika kurutuldu ve PBS (pH 7,2-7,6) ile 4 kez 5 dakika yıkandı. PBS'de iyice yıkandıktan sonra kesitler, 30 dakika boyunca A ve B reaktiflerinin bir karışımı ile inkübe edildi, 45 dakika boyunca PBS ile inkübe edildi ve son olarak hematoksilen ile hafifçe karşıt boyanmadan önce 30 dakika boyunca DAB substratı (DAKO) ile geliştirildi, dehidre edildi, ve monte edildi.

CİNSEL HİSSİ ARTIRMAK İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Bağışıklık Fonksiyonlarının Belirlenmesi

2.7.1. Bağışıklık Organ İndeksinin Hesaplanması

Son uygulamadan bir saat sonra sıçanlara üretan solüsyonunun (20 gTh100 mL) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi uygulandı ve ardından dalak ve timus bezi çıkarıldı ve hemen steril bir kapta tartıldı. Dalak veya timusun ağırlık katsayıları (%) – dalak veya timus ağırlığı (mg) Vücut ağırlığı (g).

2.7.2. Periferik Kanda T Lenfosit Alt Gruplarının Tespiti

Splenositler ve hemositler, karanlıkta 30 dakika boyunca monoklonal antikorlar anti-CD4 (PE) ve anti-CD8 (FITC) ile inkübe edildi. 2 mL eritrosit lizatı ilave edildi ve çözelti vortekslenerek karıştırıldı. Çözelti 10 dakika karanlıkta bırakıldı ve 5 dakika santrifüj edildi. Süpernatan atıldı ve daha sonra çözelti 3 kez buz soğukluğunda PBS ile yıkandı ve PBS geçirgenleştirici çözelti içerisinde yeniden süspanse edildi. Her Mab boyamasından sonraki 1 saat içinde en az 10000 hücre akış sitometrisi ile analiz edildi.

2.7.3. Serumdaki IL-10, IL-6, IL-2, TNF- ve IFN-c Düzeyinin Belirlenmesi

Son uygulamadan bir saat sonra sıçanlara üretan solüsyonunun (20 gTh100 mL) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi uygulandı ve abdominal aorttan kan alındı. Serum elde etmek için kan 3500 r'de 15 dakika santrifüj edildi ve -20 derecede saklandı. IL-10, IL-6, IL-2, TNF- ve IFN-c konsantrasyonları, üreticinin talimatlarına göre sıçan ELISA kitleri ile tespit edildi.

2.8. Hipotalamus ve Hipofiz Dokularında CaM İfadesi

Toplam RNA, hipotalamus ve hipofiz dokularından TRIzol ile ekstre edildi. Üreticinin talimatlarına göre 10 μL toplam RNA üzerinde ters transkripsiyon gerçekleştirildi. Eşit miktarlarda cDNA, dsDNA bağlayıcı boya (Promega, ABD) ve CFX 96 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi (Bio-Rad, ABD) varlığında qPCR aracılığıyla ilk aktivasyon koşulları altında farklı genlere bakmak için analiz edildi. 10 dakika boyunca 95 derece, 15 saniye boyunca 95 derecede 40 döngü denatürasyon ve 1 dakika boyunca 60 derecede tavlama uzatması.

CaM ve -aktin için primerler Tablo 1'de verilmiştir ve -aktin bir iç kontrol olarak kullanılmıştır. Her numune, hedef gen ve -aktin arasındaki kritik eşiklerdeki (Ct) fark kullanılarak normalleştirildi. Sonucu tanımlamak için aşağıdaki denklem kullanıldı: ΔΔCt - (Ct hedef geni - Ct -aktin geni) deney grubu - (Ct hedef geni - Ct -aktin geni) kontrol grubu. Daha sonra her numunenin mRNA seviyeleri, 2- ΔΔCt hedef gen ifadesi kullanılarak karşılaştırıldı. Her grubun sonuçlarının ortalaması alındı ​​(Tablo 3).

2.9. İstatistiksel Analiz

Tüm veriler SPSS yazılımı (sürüm 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL) kullanılarak analiz edildi. Gruplar arasındaki farklar tek yönlü tekrarlanan ölçümler varyans analizi (ANOVA) ile analiz edildi. Sonuçlar, GraphPad Prism yazılımı (versiyon 6.0, San Diego, CA, ABD) kullanılarak ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. P değeri 0.05'ten küçük olan farklar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

3. Deneysel Sonuçlar

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalizi

En iyi ayırmayı, tepe şeklini ve kısa analiz süresini elde etmek için ön deneyimizde kolon, mobil faz ve gradyan programını içeren kromatografik koşullar incelendi. MRM moduna sahip tipik kromatogramlar Şekil 1'de sunulmaktadır.

Tablo 4'ten, WCD'deki feniletanoid glikozitlerin içeriğinin, özellikle ekinakozit ve akteozid için CD'ye kıyasla arttığını, WCD'de ise iridoidlerin içeriğinin azaldığını görebiliriz.

3.2. HPA Eksen Fonksiyonuna İlişkin Düzenleme

3.2.1. Ağırlık, Sıcaklık ve Tutma Gücü Testi

MC grubu ve deney gruplarındaki sıçanlar, kortikosteron verildikten sonra yavaş yavaş böbrek-yang eksikliği semptomları gösterdi. Kilo kaybı, hipotermi, saç parlaklığının kaybı, ruhun sarkması, yanıtta gecikme ve su tüketiminde ve aktivitede önemli bir azalma gibi semptomlar, CD ve WCD gruplarında büyük ölçüde iyileşti. Şekil 2(a) ağırlık değişimlerini göstermektedir. İlaç gruplarının her birinin ağırlığı, özellikle CDHD ve WCD-HD gruplarında arttı. MC grubundaki kilo artışı en düşüktü. Şekil 2(b), MC grubunda en düşük olan sıcaklık değişimlerini ve WCD-HD, WCD-MD ve WCD-LD gruplarında artan sıcaklığı göstermektedir.

Şekil 2(c), BC grubu ve deney gruplarının her biri için tutma gücünün arttığını ve WCD-MD grubunun en yüksek olduğunu gösterir; bu, böbrek-yang eksikliğinin neden olduğu zayıflık belirtilerinin uygulamadan sonra düzeldiğini gösterir.

3.2.2. T, CRH, ACTH, CORT ve Kortizol Düzeyleri

Şekil 3, BC grubuyla karşılaştırıldığında sıçan serumundaki T, CRH, ACTH ve CORT düzeyinin azaldığını (P < 0.01) ve kortizol düzeyinin azaldığını (P) göstermektedir. < 0.05) MC grubunda. MC grubuyla karşılaştırıldığında, WCD-HD ve WCD-MD gruplarındaki T düzeyi arttı (P < 0.01), WCD-LD'deki CRH düzeyi, WCD-MD ve WC grupları iyileşti (P ​​< 0.01), CD-HD, WCD-MD ve WCD-HD gruplarında ACTH içeriği arttı (P < 0.01), CORT düzeyi CD-MD, WCD-MD ve WCD-HD gruplarında (P < 0.01) ve CDHD ve WCD-LD gruplarında artış (P < 0.05) ve her ilaç grubunda kortizol düzeyi arttı.

3.2.3. Mikroskop Gözlem Sonuçları

Adrenal bez dokusu kortikal tabaka ve medulla tabakasına ayrılabilir. Kortikal katmanlar küresel, demet ve retiküler katmanları içerir. Hücreler daha fazla lipit içerir ve medulla tabakası çoğunlukla feokromositoma hücrelerinden ve az miktarda fibröz dokudan oluşur. Şekil 4'te gösterildiği gibi, BC grubunda her şeyin normal olduğunu, MC grubunda ise adrenal kortekste belirgin hiperplazi, hücresel atrofi ve artan yoğunluk olduğunu bulduk. Soğanlı şerit kalınlaştı ve yarı saydam fasiküler bölge, dar zona retikülaris ve daha küçük hücreler, düzensiz renklenme ve kılcal damar tıkanıklığı gösterdi. PC grubunda kortikal ve medüller sınırlar görüldü. Küresel ve demet bantların hücreleri eşit şekilde düzenlenmiş ve morfolojik yapı onarılmıştır. Aynı daha iyi restorasyon WCD gruplarında da gözlendi ve WCD-MD grubundaki etkiler, WCD-HD ve WCD-LD gruplarına göre daha iyiydi. CD gruplarında adrenal bezin morfolojisi WCD gruplarındaki kadar iyi değildi.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%