Otofajiyi indükleyerek Acteosid'in (Cistanche Deserticola'daki aktif bir bileşen) NAFLD üzerindeki etkisi üzerine çalışma
Feb 24, 2025
Soyut:
Amaç:Cistanche Deserticola'daki aktif bileşen akteosid'in (ACT) otofajiye neden olan fonksiyonunu ve bunun alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) üzerindeki etkisini araştırmak.
YöntemEkinakozit almak ve araştırma nesneleri olarak hareket etmek için, 1 0 0 μmol/L ACT ve ekinakozit (ECH), müdahale tedavisi için otofaji-lizozom inhibitörü bleomisin A1 ile birleştirildi. Protein immünoblotlama, otofaji markeri protein mikrotübül ilişkili protein 1 hafif zinciri 3'ün nispi ekspresyon seviyesini tespit etmek için kullanıldı (LC 3- II). HepG2 hücreleri, in vitro farklı ACT konsantrasyonları ile müdahale edildi ve tetrazolyum tuzu yöntemi kullanılarak hücre canlılığı tespit edildi. İlaç müdahalesi ile in vitro olarak yapılan bir NAFLD modeli, yağ kırmızı o boyama yöntemi kullanılarak lipit damlacıklarını lekelemek ve hücre içi trigliserit seviyelerini tespit etmek için kullanıldı. İmmünofloresan teknolojisi yoluyla LC3 proteini ve lipit damlacıklarının lokalizasyonunu gözlemleyin. Sonuçlar Yasası HepG2 hücrelerinde otofajiyi önemli ölçüde indükleyebilir ve LC 3- II proteininin ekspresyon seviyesi kontrol grubuna (sadece ACT ile tedavi edilir) kıyasla önemli ölçüde artmıştır ({{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{0 {{{{28} {28} {28}}}} {28}}} {{}}}} {{}}}} sırasıyla), istatistiksel anlamlılık ile (p0.05). 50 μmol/L ACT, HepG2 hücrelerinde otofajiyi önemli ölçüde indükledi ve LC 3- II proteinin ekspresyon seviyesi önemli ölçüde arttı (sırasıyla 1.83 ± 0.53, 0.35 ± 0.18). ACT müdahale grubundaki (19.11 ± 1.68) HepG2 hücrelerinin TG seviyesi, NAFLD in vitro hücre modeli grubundakinden (34.15 ± 1.90) önemli ölçüde daha düşüktü ve farklılıklar istatistiksel olarak anlamlıydı (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.
Anahtar Kelimeler:Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı;Cistanche Deserticola;Aktosit; Otofaji
Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının (NAFLD) tedavisi için TCM bitki cistanche
Daha fazla ayrıntı almak için resme tıklayın
Son birkaç on yılda, alkolsüz yağlıkaraciğer hastalığı(NAFLD) en yaygın olanı olduKronik karaciğer hastalığı, yetişkin popülasyonunun yaklaşık% 25'inde küresel bir prevalansı ile ve metabolik sendromla yakından ilişkili olduğu düşünülmektedir [1]. NAFLD hastalarında karaciğer ile ilişkili komplikasyon olasılığı%10'dan az olsa da, NAFLD, hastalar üzerinde büyük bir ekonomik yük getiren siroz ve primer karaciğer kanseri gibi karaciğerle ilişkili hastalıklar için bir risk faktörüdür [2-5]. NAFLD'ye verilen artan dikkate rağmen, önemli bir kronik hastalık olarak NAFLD yeterli ilgi görmemiştir. Bu nedenle, NAFLD patogenezinin daha derinlemesine anlaşılması ve etkili tedavi stratejileri arayışı çözülmesi için acil problemler haline gelmiştir [6-7].
Son çalışmalar, hücresel otofajinin karaciğer fizyolojisi ve patolojisinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir [8]. Otofaji disfonksiyonu veya düzensizlikalkolle ilişkili karaciğer hastalığı[9], NAFLD [10], alkolsüz steatohepatit [11] ve hepatoselüler karsinom [12]. NAFLD'nin patolojik özellikleri, alkliseritlerin (TG) ve alkolik olmayan stimülasyon altında hepatositlerde diğer nötr lipit damlacıklarının (LD) aşırı birikimidir. Karaciğer için, bu LD'lerin katabolizmasını düzenleyen iki ana yol lipoliz ve otofajidir.
Lipoliz yolu, hormona duyarlı lipaz ve yağ Tg lipaz gibi sitoplazmik nötr lipazlarla düzenlenir. Karşılık gelen lipoautofaji yolunda, LD'ler otofagosomlar oluşturmak için doğrudan otofaji ile ilişkili proteinleri doğrudan alarak seçici olarak alınabilir ve daha sonra otofagosomlar ile kapsüllenen LD'ler ayrıca lizozlara iletilir ve lizozomlar içinde asit lipaz ile ayrıştırılır. Bu nedenle, hepatositlerde lipoautofajinin aktive edilmesi, NAFLD'nin önlenmesi ve tedavisi için etkili bir strateji haline gelmiştir.
Cistanche Deserticola, geleneksel Çin tıbbı formüllerinde klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan değerli bir Çin bitkisel ilaçtır. Aynı zamanda, uzun zamandır sağlık gıda takviyesi olarak kullanılmaktadır. Cistanche Deserticola, en önemlisi Cistanche Deserticola feniletanol glikozitler olan çeşitli biyoaktif bileşenler içerir. Feniletanoid glikozit temsilcileri olarak, ekinakosid (ECH) ve verbascosid (ACT), antioksidan, nöroprotektif, immünomodülatör ve karaciğer koruması gibi birçok önemli biyolojik aktiviteye sahip oldukları bildirilmiştir [13]. Karaciğer koruması açısından, çalışmalar ECH'nin enflamatuar aracıları azaltarak, büyüme faktörünü inhibe ederek ve karaciğer fibroz ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyesini azaltarak karaciğeri koruyabileceğini bulmuştur. ACT, alkol, karbon tetraklorür ve lipopolisakkarit gibi kimyasal ve ilaca bağlı karaciğer hasarı üzerinde önemli bir koruyucu etkiye sahiptir. ACT, toksik kimyasalların neden olduğu oksidatif stresi azaltır, karaciğerde biriken reaktif oksijeni giderir ve malondialdehit konsantrasyonunu azaltır. Aynı zamanda, karaciğer süperoksit dismutaz aktivitesini önemli ölçüde arttırır ve glutatyon içeriğini azaltır ve karaciğer histopatolojik hasarını ve apoptozu önemli ölçüde iyileştirir. Bununla birlikte, Cistanche Deserticola'nın feniletanoid glikozitlerinin karaciğer korumasında otofaji sürecine dahil olup olmadığı konusunda ilgili bir literatür raporu yoktur. Buna dayanarak, bu çalışmada, gelecekteki ilaç geliştirme için bilimsel bir temel sağlamayı amaçlayan Cistanche Deserticola feniletanoid glikozitlerin otofaji indükleyici etkisini önceden keşfetmek için geleneksel hücre biyolojisi yöntemleri ve in vitro bir hücre modeli kullanılmıştır.
1 Malzeme ve Yöntem
1.1 Malzeme
1.1.1 Araştırma denekleri ECH ve ACT araştırma konuları olarak kullanılmıştır.
1.1.2 Malzemeler HepG2 hücreleri Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (Parti Numarası: B21209) ve ACT'den satın alındı (B20715, HPLC%98'den daha büyük veya eşit) Shanghai Yuanye Biological Company, PHFCHIN, DMEM High Glucoz Ortamından satın alındı (sh3023.01), DMEM High Glucoz Ortamından satın alındı, DMEM High Glucoz Ortamından (sh3023.01) satın alındı. were purchased from HyClone Company, USA, fetal bovine serum (batch number: 04-002-1A) was purchased from BI Company, Israel, penicillin/streptomycin (batch number: SV30010.01) was purchased from Hyclone Company, USA, MTT (batch number: M8180) powder was purchased from Solebao Company, Beijing, China, TG (batch Sayı: BC0625) Tespit kiti Solebao Company, Pekin, Çin, Petrol Kırmızı O (Lot Sayı: O 0625-100 g), dimetil sülfoksit (lot sayısı: BCBZ1685) satın alındı. Sigma-Aldrich, ABD'den satın alındı; Otofaji-lizozom inhibitörü Bafilomisin A1 (BAFA1, Lot sayısı: TLRL-BAF1) Invitrogen, ABD'den satın alındı; Otofaji aktivatörü rapamisin (lot numarası: S17098), Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Çin'den satın alındı; Mikrotübül ile ilişkili protein 1 hafif zincir 3 (LC3, lot sayısı: L7543, türler: tavşan, seyreltme oranı: 1: 1 000) ve -actin (lot sayısı: ZRB1312, türler: seyreltme oranı: 1: {5 000) antikorları, Sigma-algrich'ten satın alındı; Yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikor (lot sayısı: 4010-05, türler: keçi anti-tavşan, seyreltme oranı: 1: 1 000) Güney Biotech, ABD Şirketi, Alexa Floror floresan floresan floresan etiketli ikincil antikordan (lot sayısı: 1: 1: 1: 4328, satın alındı: 1: 4328, satın alındı: Sigma-Aldrich Company, ABD ve Bodipy 493/501 (lot numarası: D3922) Invitrogen Company, ABD'den satın alındı.
1.2 Yöntemler
1.2.1 Hücre Kültürü
HepG2 hücreleri, Dulbecco'nun% 10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 UG/mL streptomisin içeren modifiye kartal yüksek glikoz ortamında 37 derece,% 5 karbon dioksit inküböründe kültürlendi. Hücre izdihamı%85'e ulaştığında, alt kültür, kaplama, müdahale ve diğer operasyonlar gerçekleştirildi.
1.2.2 Protein immünoblotlama tespiti
1.2.2.1 Hareket ve ECH tedavisi
Bir proton pompası inhibitörü olarak hepg2 hücrelerinde Bafa1'de LC 3- ⅱ Protein ekspresyon seviyesi, LC 3- ⅱ proteinin hücrelerde büyük miktarlarda toplanmasına neden olabilir, böylece otofaji indüksiyon kabiliyetini amplifiye edebilir. Bu nedenle, BAFA1'in kombine kullanımı, otofaji indüksiyon yeteneğini değerlendirmek için bir otofaji izleme sistemi olarak kullanılabilir. Logaritmik büyüme fazındaki HepG2 hücreleri, gece kültürü için 3.5 cm hücre kültürü kaplarına aktarıldı. 12 saat boyunca müdahale için 100 μmol/L ACT, ECH ve BAFA1 kullanıldı. Hücreler, önceden soğutulmuş fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile yıkandı ve hemen 10 dakika boyunca RIPA protein lizis tamponu içinde lize edildi. Süpernatan santrifüjlendi ve toplam protein konsantrasyonu, bir bisinkoninik asit protein konsantrasyonu test kiti kullanılarak belirlendi. Sodyum dodesil sülfat tamponu ile kantifikasyondan sonra, numune proteini denatür etmek için 10 dakika boyunca 95 derece ısıtıldı. Daha sonra 30 uL numune bir mikropipetle alındı ve bir poliakrilamid jel üzerinde elektroforlu.
Elektroforezden sonra protein, jelden bir nitroselüloz membrana aktarıldı, gece boyunca 1 0} süt ile bloke edildi, 1 saat boyunca oda sıcaklığında spesifik bir primer antikor ile inkübe edildi,% 0.5 triton içeren fosfat tamponu ile yıkandı. ECL yöntemi renk geliştirme için kullanıldı. Boş kontrol grubu, Rapamisin Grubu, ECH Grubu, ACT Grubu, Rapamisin+BAFA1 Grubu, ECH+BAFA1 Grubu ve ACT+BAFA1 Grubu olarak ayarlandılar.
1.2.2.2 Farklı ACT konsantrasyonları, hepg2 hücrelerinde LC 3- ⅱ proteinin ekspresyon seviyesine müdahale etti
Logaritmik büyüme fazı HepG2 hücreleri, gece boyunca kültür için 3.5 cm hücre kültürü kaplarına aktarıldı ve BAFA1 ile kombine edilmiş 25, 50 ve 100 μmol/L ACT, 12 saat boyunca müdahale tedavisi için kullanıldı ve LC 3-}} ⅱ ⅱ proteinin ekspresyon seviyesi protein immünoblotlama ile tespit edildi. Kontrol grubu (CON grubu, boş kontrol), açlık grubu (STA grubu, açlık tedavisi HepG2 hücreleri), 25, 50 ve 100 μmol/L ACT grubu ve 25, 50 ve 100 μmol/L ACT grubu ile birleştirilmiş BAFA1 kuruldu.
1.2.3 MTT Yöntemi 24 ve 48 saat boyunca farklı konsantrasyonlarla tedavi edilen HepG2 hücrelerinin sağkalım oranını tespit etmek için
Logaritmik büyüme fazındaki HepG2 hücreleri, 96- kuyu plakasında orta derecede aşılama yoğunluğu olan ve 12 saat boyunca bir inkübatörde kültürlendi. 24 ve 48 saat boyunca 2 0, 40, 60, 80 ve 100 μmol/L ACT ilave edildi. Karanlık bir ortamda 0.5 mg/ml MTT çözeltisi ilave edildi ve bir inkübatörde inkübe edildi. 4 saat sonra, süpernatan atıldı, her oyuğa 100 uL dimetil sülfoksit ilave edildi ve hücreler, 10 dakika boyunca 37 derecede sabit bir sıcaklık çalkalayıcıda çalkalandı. 490 nm dalga boyunda optik yoğunluk (OD) değeri bir enzim markeri ile tespit edildi ve hücre sağkalım oranı hesaplandı.
1.2.4 NAFLD hücre modelinin in vitro yapısı
Belirli bir palmik asit (PA) ağırlığı tartıldı ve 100 mmol/L PA stok çözeltisi hazırlamak için belirli bir hacim izopropanol içinde tamamen çözüldü, daha sonra bölündü ve daha sonra kullanım için -20 derece buzdolabı içinde saklandı. PA stok çözeltisi, tam kültür ortamı kullanılarak 100 μmol/L'ye seyreltildi ve% 1 yağ asidi içermeyen sığır serum albümini ilave edildi. Hücreler, indüksiyon çözeltisini hazırlamak için 3 saat boyunca 37 derece inkübe edildi. Logaritmik büyüme fazındaki HepG2 hücreleri, gece kültürü için uygun bir yoğunlukta 3.5 cm'lik bir hücre kültür yemeğine aktarıldı ve daha sonra müdahale için hazırlanan indüksiyon çözeltisi kullanıldı.
1.2.5 ACT Müdahalesi NAFLD in vitro hücre modeli TG tespiti ve yağ kırmızı o boyama
1.2.5.1 Tg Tespit
Logaritmik büyüme fazındaki HepG2 hücreleri, boş kontrol grubu, model grubu ve ACT müdahale grubuna göre kültür için 3.5 cm hücre kültürüne aktarıldı. Model grubu 100 μmol/L PA indüksiyon çözeltisi ile indüklendi ve ACT müdahale grubu 100 μmol/L PA indüksiyon çözeltisi ile indüklendi ve aynı zamanda 50 μmol/L ACT ilave edildi. Müdahale süresi 24 saat idi. Eski kültür ortamını yavaşça çıkarın, hücre yüzeyini bir kez bir kez yavaşça yıkayın, 100 μL/çanak önceden soğutulmuş ripa lizis çözeltisi ekleyin, 15 dakika boyunca buz üzerinde tamamen lyse, 10 dakika boyunca 10 dakika boyunca tamamen lyse, süpnatan için 10 μl toplayın, protein için 10 μl alın, başka bir tapu için 10 μl alın, başka bir tapu için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detama için alın, başka bir detayma alın, alın. TG kiti talimatları ve son olarak mg protein başına Tg seviyesini düzeltin.
1.2.5.2 Yağ Kırmızı O Boyama
Logaritmik büyüme fazındaki HepG2 hücreleri, gece kültürü için steril bir lamel ile kaplı 3.5 cm'lik bir kültür yemeğine aktarıldı. 100 μmol/L PA, hücreleri lipit damlacıkları oluşturmaya neden oldu. Aynı zamanda, 24 saat müdahale için 50 μmol/L ACT ilave edildi.
The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed with 4% formaldehyde at room temperature for 10 min, washed the cell surface with PBS, added the prepared Oil Red O staining working solution, stained at room temperature in the dark for 15 min, aspirated the Oil Red O staining solution, washed the excess staining solution with double distilled water, rinsed with 60% isopropanol, washed with double distilled water, and sealed, ve mikroskop altında fotoğraflandı.
1.2.6 ACT tedavisinden sonra otofagosomların ve lipit damlacıklarının immünofulesans gözlemi
Logaritmik büyüme fazındaki HepG2 hücreleri, gece kültürü için steril bir lamel ile kaplı 3.5 cm'lik bir kültür yemeğine aktarıldı. Hücrelerde lipit damlacıklarının oluşumunu indüklemek için 1 0 0 μmol/L PA kullanıldı. Aynı zamanda, 24 saat boyunca müdahale tedavisi için ACT ilave edildi. The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed at room temperature for 10 min with 4% formaldehyde, permeabilized at room temperature for 15 min with a permeabilization buffer containing 0.1% saponin, blocked at room temperature for 1 h with goat serum, incubated at room temperature for 1 h with LC3-specific primary antibody, washed 3 times with PBS, and added Oda sıcaklığında ve 1 saat boyunca ışıktan uzakta inkübe edilen spesifik bir floresan etiketli ikincil antikor ile. Antikor inkübasyonundan sonra, slaytlar 3 kez PBS ile yıkandı, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında lipit damlacıklarına özgü prob bodypy 493/503 ile karşı boyandı, PBS ile yıkandı, karanlıkta kurutulmuş, bir lazer konfokal mikroskop ile gözlemlendi ve kaydedildi. Boş kontrol grubu, rapamisin tedavi grubu ve ACT müdahale grubu belirlendi.
1.3 İstatistiksel analiz
Veri analizi için SPSS25. 0 İstatistiksel yazılım kullanıldı. Kantitatif veriler x ± S olarak ifade edildi. Tek yönlü varyans ve LSD-T testi analizi kullanıldı. P<0.05 was considered statistically significant.
