Cistanche Deserticola'dan (Pseudalkalibacillus Sp. A8) Endofitik Bir Bakterinin Tuz ve Alkali Toleransı Üzerine Bir Araştırma

 

Soyut

Amaç:Endofitik bakterileri izole etmek içinCistanche Deserticolave tuz-alkali toleransının altında yatan potansiyel mekanizmaları araştırmakPseudalkalibacillussp. A8.
Yöntemler:Endofitik bakteriler seyreltme kaplama yöntemi kullanılarak izole edildi. A8 suşunun sınıflandırması morfolojik özellikler ve 16S rRNA gen dizilimi ile belirlendi. Daha sonra tüm genom dizilimi ve metabolomik analizler yapıldı.
Sonuçlar:Taze bitkilerden 50 endofitik bakteri suşu izole edildi.Cistanche Deserticola4 filum, 8 sınıf ve 35 cinsi kapsayan örnekler. Bunlar arasında A8 suşu ilk sırada yer almaktadır.Pseudalkalibacillusbitkilerden izole edilen ve olağanüstü tuz-alkali toleransı gösteren türler. pH 6,0 ile 13,0 arasında ve %17'ye varan NaCl konsantrasyonlarında büyüyebiliyordu. Genom açıklaması, tuz-alkali direnciyle ilişkili 10 geni ortaya çıkardı. Yüksek tuzluluk ve yüksek pH koşulları altındaki metabolik analiz, tuz-alkali stres adaptasyonuyla ilgili yedi fonksiyonel yolda zenginleştirilmiş 186 diferansiyel metabolit tanımladı.
Çözüm:Bu çalışma, mahsulün tuz-alkali toleransını arttırmak için değerli mikrobiyal kaynaklar sağlar ve mikrobiyal yollarla tuzlu-alkali toprağın iyileştirilmesi için teorik destek sunar. Aynı zamanda tuz alkaliye toleranslı bakterilerin moleküler mekanizmalarının anlaşılmasına da zemin hazırlıyor.

Anahtar Kelimeler: Cistanche Deserticola; endofitik bakteriler; tuz-alkali toleransı; tüm genom dizilimi; UPLC-MS/MS

 

 

 

Cistanche çölikol çiçeği

giriiş

Toprak tuzlanması ve alkalileşmesi, arazi bozulmasına ve çölleşmeye önemli ölçüde katkıda bulunan önemli küresel sorunlardır. Dünyadaki ekilebilir arazilerin yaklaşık %20'sinin değişen derecelerde tuzluluktan etkilendiği tahmin edilmektedir ve yalnızca Çin, 9,9×10⁷ hektarlık tuzlu-alkali araziye sahiptir; bu, dünyanın en büyüğüdür. Bu tür topraklar tipik olarak zayıf geçirgenlik, düşük verimlilik ve sert doku sergileyerek mahsulün büyümesine ve verimine ciddi şekilde zarar verir. Bu nedenle tuzlu-alkali toprakların kullanılması ve iyileştirilmesi için etkili stratejiler geliştirmek kritik bir konu olmaya devam etmektedir.

Son araştırmalar, mikrobiyal aşılayıcıların, özellikle de tuz-alkali toleranslı türlerin, uygun maliyetli ve çevre dostu bir şekilde ürün toleransını artırabildiğini ve toprak özelliklerini geliştirebildiğini göstermektedir. Endofitik bakteriler (hastalığa neden olmadan bitki dokularında yaşayanlar), konakçı bitkilerle ekolojik ve fizyolojik özellikleri paylaşırlar.Cistanche DeserticolaAşırı tuz-alkali direnciyle bilinen, çölde yaşayan parazit bir bitki, strese dayanıklı endofitlerin izole edilmesi için umut verici bir kaynaktır.

Bu çalışmanın amacı:

Endofitik bakterileri izole edinCistanche Deserticola;

Tuz alkaliye toleranslı türler için tarama;

Seçilen suşun stres direnci mekanizmalarını keşfedinPseudalkalibacillussp. Tüm genom ve metabolomik analizler yoluyla A8.

Cistanche çölikol çiçeği

Malzemeler ve Yöntemler

1.1 Malzemeler

Bitki Örneği: Cistanche DeserticolaMart 2023'te Çin'in Gansu Eyaleti, Jingtaixian, Baiyin, Xiquan Kasabasından toplandı. Gansu Ziraat Üniversitesi'nden Prof. Guo Yehong tarafından tanımlanmıştır.

Medya:TSB sıvı ortamı; 20 g/L agar kullanılarak katılaştırıldı.

Reaktifler ve Cihazlar:Analitik dereceli NaClO, KH₂PO₄, K₂HPO₄, TAE tamponu; Agilent QTOF 1290–6542 kütle spektrometresi, R-1001V döner buharlaştırıcı, Neofuge 15R santrifüj, SureCycler 8800 gradyan PCR.

1.2 Endofitik Bakterilerin İzolasyonu

TazeCistanchedoku yüzeyi sterilize edildi ve homojenleştirildi. Seri seyreltmeler R2A, TSB, ISP-2 ve 2216E ortamlarına kaplandı. Koloniler izole edildi ve üç alt kültür yoluyla saflaştırıldı, ardından -80 derecede %20 gliserol içinde saklandı.

1.3 16S rRNA Gen Tanımlaması

Genomik DNA, evrensel primerler 27F/1492R kullanılarak ekstre edildi ve amplifiye edildi. PCR ürünleri EzBioCloud veritabanı kullanılarak sıralandı ve analiz edildi.

 

Cistanche tabanı

Wecistanche Destek Hizmeti-İşbirliği hakkında daha fazla bilgi için
E-posta:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

1.4 Fenotipik ve Fizyolojik Karakterizasyon

SEM:Altın kaplama sonrasında gözlenen hücre morfolojisi.

NaCl Toleransı:Büyüme %0-20 NaCl'de değerlendirildi.

PH Toleransı:Büyüme pH 4-13'te ölçülmüştür.

Sıcaklık Aralığı:Büyüme 4–50 derecede test edildi.

1.5 Tüm Genom Dizilemesi

A8 suşu, PacBio teknolojisi kullanılarak sekanslandı. Genom montajı ve açıklama altı ana veri tabanına (NR, Swiss-Prot, Pfam, EggNOG, GO, KEGG) karşı gerçekleştirildi. Tuz-alkali toleransıyla ilgili genler tarandı.

1.6 UPLC-MS/MS Analizi

Numuneler üç koşul altında kültürlendi:

A: pH 7,2, NaCl %0,5

B: pH 7,2, NaCl %14

C: pH 13,0, NaCl %0,5

Süpernatanlar kurutuldu, metanol içinde çözüldü ve UPLC-MS/MS (ZORBAX Eclipse Plus C18, pozitif iyon modu) kullanılarak analiz edildi.

Sonuçlar ve Analiz

2.1 Endofit İzolasyonu

Elli suş izole edildiCistanche Deserticola4 filum ve 35 cinse aittir.

2.2 A8 Suşunun Tanımlanması

16S rRNA dizisi ile %99,30 benzerlik gösterdiPseudalkalibacillus salsuginis. Filogenetik analiz onun bir üyesi olduğunu doğruladıPseudalkalibacillus. Morfolojik olarak koloniler pürüzsüz, sarı-kahverengi, çubuk şeklindeydi (1-6 µm) ve SEM altında hafif tüylüydü.

Büyüme aralığı:20–45 derece (optimal: 30 derece)

PH aralığı:6–13 (en iyi: 9,0)

Tuz aralığı:%0–17 NaCl (optimal: %0–5)

2.3 Genom Analizi

Genom Uzunluğu: 6,022,064 bp

GC İçeriği: 40.99%

Protein kodlayan genler: 5,825 (82.5%)

tRNA/rRNA:76 tRNA, 24 rRNA

ANI Değerleri:Tüm<95%, indicating a potential novel species.

COG Açıklaması:4.683 gen (%80,39)

Amino asit taşınması/metabolizması (556), karbonhidrat metabolizması (501), transkripsiyon (464), lipid metabolizması (440), koenzim metabolizması (298), savunma mekanizmaları (100)

Tanımlanan Tuz-Alkali Tolerans Genleri:

Glisin/betain taşıyıcı

Sodyum taşıyıcısı

Antiporterler

F0F1 ATP sentezi

2.4 Metabolomik Analiz

Metabolit Tanımlaması:986 toplam metabolit tespit edildi

OPLS-DA Analizi:Gruplar arasında net ayrım; R²X > 0,5, R²Y=1, Q² > 0,85,P< 0,005

Diferansiyel Metabolitler:

Toplam 186:

Grup B: 96 (13'ü yukarı regüle edilmiş, 83'ü aşağı regüle edilmiş)

Grup C: 132 (41 yukarı regüle edilmiş, 91 aşağı regüle edilmiş)

49 hem B hem de C'de yukarı regüle edildi

B ve C'de benzersiz şekilde ifade edilen 196 metabolit

Toplam 246 yukarı regüle edilmiş veya benzersiz metabolit

Yol Zenginleştirme (KEGG):

Seskiterpenoid ve triterpenoid biyosentezi

Pürin metabolizması

Lizin biyosentezi ve bozulması

Pantotenat ve CoA biyosentezi

Arginin ve prolin metabolizması

Steroid biyosentezi

Bu sonuçlar A8 suşunun hem genetik hem de metabolik düzenleme yoluyla tuz-alkali stresine uyum sağladığını göstermektedir.

---

Çözüm

Bu çalışma başarıyla izole edildi ve tanımlandıPseudalkalibacillussp. A8'denCistanche Deserticolagüçlü tuz-alkali direnci sergileyen potansiyel yeni bir türdür. Tüm genom ve metabolomik analizler sayesinde, birden fazla gen ve metabolik yolun stres adaptasyonuna katkıda bulunduğu tespit edilmiştir. Bu bulgular, mahsul toleransını iyileştirmek ve tuzlu-alkali toprakları ıslah etmek için mikrobiyal ajanların geliştirilmesine yönelik teorik bir temel sağlar.

 

Referanslar

Wang Y., Wang Y., Zhang Q., ve diğerleri.Tuzlu-Alkali Toprak Özelliği Sinerjistik Etkileriyle İyileştirildiPriestia aryabhattaiJL-5,Stafilokok psödoksilosusXW-4,Leymus çinensisve Toprak Mikrobiyotası. Uluslararası Moleküler Bilimler Dergisi, 2023, 24(9): 7737.

Chen Wentao, Guo Lizhuo, Shan Bin ve diğerleri.Tuzlu-Alkali Topraklarda Toprak Değişikliklerinin Yulafın Büyümesi ve Toprağın Fiziksel Özellikleri Üzerine Etkileri. Gansu Ziraat Üniversitesi Dergisi, 2024, 59(5): 136–144. (Çince)

Lu Yuxin, Yan Hong, Bai Yani ve diğerleri.İzolasyon ve Tuz-Alkali Tolerans MekanizmasıRizobiumBFL-3 gerinimi. Tarımsal Biyoteknoloji Dergisi, 2023, 31(7): 1501–1512. (Çince)

Yu Jiang, Wang Xinzhen, Wang Chun ve diğerleri.Tuz Alkali Toleranslı Bir UygulamasitrobakterBitki Büyümesini Desteklemede ve Tuz-Alkali Tolerans Genlerinin Madenciliğinde Suş. Mikrobiyoloji Çin, 2024, 51(3): 864–879. (Çince)

Wani ZA, Ashraf N., Mohiuddin T., ve diğerleri.Bitki-Endofit Simbiyozu: Ekolojik Bir Perspektif. Uygulamalı Mikrobiyoloji ve Biyoteknoloji, 2015, 99(7): 2955–2965.

Venieraki A., Dimou M., Katinakis P.Tıbbi Bitkilerde Bulunan Endofitik Mantarlar, Konakçılarıyla Aynı veya Benzer Farmakolojik Olarak Aktif İkincil Metabolitleri Üretme Yeteneğine Sahiptir. Helenik Bitki Koruma Dergisi, 2017, 10: 51–66.

Çin Farmakopesi Komisyonu.Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi, Cilt I. Pekin: China Medical Science Press, 2020: 79–80.(Çince)

Fu Kejian, Cui Yonghe, Huang Zhihua ve diğerleri.Tütün Kara Sap Patojenine Karşı Biyokontrol Bakterilerinin Taranması, Tanımlanması ve Antagonistik Mekanizması. Güney Tarım Dergisi, 2023, 54(8): 2245–2256. (Çince)

Hu Chunhui, Xu Qing, Sun Xuan ve diğerleri.Taramalı Elektron Mikroskobu için Çeşitli Tipik Biyolojik Örneklerin Hazırlama Yöntemleri. Hubei Tarım Bilimleri, 2016, 55(20): 5389–5392+5402. (Çince)