Laminaria Japonica Fucoidan ve Cistanche Tubulosa Ekstraktının Sinerjistik Anti-inflamatuar Etkileri

Yabancı antijenlere karşı bir bağışıklık tepkisi olarak makrofajlar, tümör nekroz faktörü- (TNF-), interlökin-1 (IL- 1), IL-6 ve diğerleri gibi proinflamatuar sitokinleri salgılar. Bu tür sitokinler, granülositlerin, monositlerin, lenfositlerin ve mast hücrelerinin hasarlı dokuya kemotaktik akışını indükleyerek antijenin uzaklaştırılmasını ve doku iyileşmesini teşvik eder. Bununla birlikte, hücrelerin aşırı infiltrasyonu ve aktivasyonu, doku yaralanmalarını ağırlaştırarak, inflamasyonun iyi bilinen fenomenleri olan ödem (vasküler eksüdasyon) ve ağrıya yol açar.

TNF-, çeşitli hücre hatlarında nitrik oksit sentaz (iNOS) gen ekspresyonunu indüklemek için önemli bir faktördür. iNOS aktivasyonu nitrik oksit (NO) üretimine yol açar, bu da yalnızca bakterisit ve vazodilatasyon gibi çeşitli fizyolojik fonksiyonları modüle etmekle kalmaz, aynı zamanda inflamasyona da neden olur. Doku hasarından sonra hücre zarı fosfolipidlerinin fosfolipazları tarafından parçalanması araşidonik asit üretir. Araşidonik asit ayrıca siklooksijenaz (COX) tarafından prostaglandinlere (PG'ler) ayrıştırılır. COX-II'nin oluşturduğu aşırı miktarda PGE2, inflamasyon için çeşitli sitokinleri indükler. Hem NO hem de PGE2, inflamasyon ve ağrı indüksiyonunda ana faktörler olarak görev yaptığından, TNF-NO ve COX-II-PGE2 yolları, kortikosteroidler ve steroidal olmayanlar tarafından inhibe edilen inflamatuar sürecin ana akımlarıdır.antiinflamatuar ilaçlar(NSAID'ler) sırasıyla.

Her ne kadar çeşitli steroidler ve NSAID'ler mevcut olsa dainflamatuar hastalıkların tedavisiBu ilaçlar bağışıklık sistemi, gastrointestinal sistem, böbrekler, karaciğer, merkezi sinir sistemi, kan basıncı ve kardiyovasküler sistem üzerinde olumsuz etkilere neden olabilir. Bu nedenle kimyasal tedavilerin olumsuz etkilerinin, bunların yerine geçerek veya doğal ürünlerle birlikte kullanılarak en aza indirilmesi gerekmektedir.

Birçok ülkede yaygın olarak dağıtılan Laminaria japonica ve Cladosiphon okamuranus gibi deniz yosunlarından elde edilen bir sülfat polisakkarit kompleksi olan Fucoidan, uzun süredir Doğu tıbbında terapötik olarak kullanılmaktadır. Önceki çalışmalarda fucoidan'ın anti-oksidatif, anti-pıhtılaştırıcı, anti-kanser ve anti-oksidatif özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir.antiinflamatuar aktiviteler. Buna göre fukoidanın inflamatuar hastalıklar, iskemi, immün fonksiyon bozuklukları ve tümörler üzerindeki yararlı etkileri araştırmacıların dikkatini çekmektedir. Diğer taraftan,Cistanche tubulosa(CT) Çin'de geleneksel bir ilaç olarak da yaygın şekilde kullanılmaktadır. CT ekstraktlarının, inflamatuar yollarda NO üretimi için ana faktörler olan TNF-á ve IL- 4 üretimini azalttığı rapor edilmiştir [19].

Bu tür önceki bulgular, fucoidan ve CT ekstraktının inflamasyonun 2 ana yolu üzerindeki kombinasyon etkililiğini araştırmamıza yol açtı. Etki mekanizmasını aydınlatmak için karragenanın neden olduğu hava kesesi iltihabından kaynaklanan eksüdalarda NO ve PGE2'yi analiz ettik.

ÖNLEME İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSAİNFLAMATUAR AKTİVİTELERPHGS%75 ECH %30 ACT %12

Malzemeler ve Yöntemler

Malzemeler

Yarı saflaştırılmış fukoidan ve CT'nin su ekstraktı Misuba RTech Co., Ltd.'den (Asan, Kore) elde edildi. Fucoidan ve CT ekstraktı 4 derecede tutularak karıştırıldı (1:3) kullanımdan önce saf su içerisinde eritildi ve 5 mL/kg hacimde ağızdan uygulandı.

Hücre kültürü ve NO ölçümü

Fare makrofajı RAW 264.7 hücre çizgisi, American Type Culture Collection'dan (Manassas, ABD) satın alındı ​​ve %10 fetal sığır serumu ve antibiyotikler [100 U/mL] içeren Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamında (Sigma, St. Louis, ABD) kültürlendi. penisilin (Sigma) ve 100 µg/mL streptomisin (Sigma)]. Hücreler nemlendirilmiş %5 CO2 atmosferinde 37 derecede inkübe edildi.

Fucoidan ve CT ekstraktının NO salgılanması üzerindeki etkilerini değerlendirmek için RAW 264.7 hücreleri (1x106 hücre/mL), fucoidan veya CT ekstraktı (1–320 µg/ mL) ile 5 dakika boyunca inkübe edildi 24 saat boyunca interferon- (IFN-, 10 U/mL) ve lipopolisakkarit (LPS, 10 µg/mL) takip etti. Ön çalışmalarımızda RAW 264.7 hücrelerinin aktivasyonuna yönelik IFN-artı LPS tedavisinin 24 saate kadar hücrelerin canlılığını etkilemediği, fukoidan ve CT ekstraktının 1 mg/mL'ye kadar sitotoksik olmadığı doğrulandı. NO'nun oksitlenmiş ürünü olan nitrit konsantrasyonu (NO2 – ), NO'nun bir göstergesi olarak ölçüldü. Kültür ortamı, eşit hacimde Griess reaktifi (%1 sülfanilamid, %2,5 fosforik asit içerisinde %0,1 naftil etilendiamin) [21] ile karıştırıldı ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edildi. Nitrit konsantrasyonu, standart bir eğri oluşturmak için NaN02'nin kullanıldığı 540 nm'de analiz edildi.

Hayvanlar ve tedavi

Erkek ICR fareleri (7 haftalık), Daehan Biolink'ten (Eumseong, Kore) satın alındı ​​ve sabit çevre koşullarına (22±2°C; %40-70 bağıl nem; 12-saat ışık) sahip bir odaya yerleştirildi. -karanlık döngüsü; 150-300 lüks parlaklık). Pelet yemi ve arıtılmış su istenildiği kadar mevcuttu. Tüm hayvan deneyleri Kore'deki Chungbuk Ulusal Üniversitesi'nin (CBNU) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve CBNU Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi'nin Standart Operasyon Prosedürlerine (SOP) göre yürütüldü.

Fareler (n=8/grup), fukoidan (18 veya 54 mg/kg), CT ekstresi (54 veya 162 mg/kg) veya bunların karışımları (18+54, {{6) ile ağızdan tedavi edildi. }} veya 90+270 mg/kg) 7 gün boyunca günde bir kez. Fucoidan'ın (18 mg/kg) ve CT ekstraktının (54 mg/kg) düşük dozları, vücut ağırlığının (Km{{14) yüzey alanı dönüşümünden sonra 100 mg/vücut (70 kg) ve 300 mg/vücut'luk tahmini insan dozlarından elde edilmiştir. sırasıyla insan için }}/fare için Km=3). Fucoidan ve CT ekstraktının yüksek dozları tek başına veya karışım halinde 3 kata ayarlandı ve maksimum sinerjistik etkileri değerlendirmek için en yüksek doz karışımı 5 kata sabitlendi.

Fucoidan ve CT ekstraktı tedavisinin 1. gününde, farelerin arka tarafına deri altından 10 mL steril hava enjekte edilerek bir kese oluşturuldu [22,23]. 2 ve 5 gün sonra keseye 5 mL hava yeniden enjekte edildi. Son tedaviden bir saat sonra keseye 1 mL karragenan (%1 salinde; Sigma) veya bunun aracı (tuzlu su) enjekte edildi.

Eksüda analizleri

Hava kesesi, karageenan enjeksiyonundan 6 saat sonra 1 mL soğuk salinle yıkandı ve net lavaj sıvısı hacmi kaydedildi. Enflamatuar hücrelerin, nötrofillerin, monositlerin ve lenfositlerin toplam sayısı bir sürgü sayacı kullanılarak belirlendi. NO ve PGE2 konsantrasyonları, sırasıyla bir Correlate-EIA kiti (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA) kullanılarak Griess reaktifi (Sigma) ve enzim immünoanalizi (EIA) ile belirlendi.

İNFLAMATUAR HÜCRE KEMOTAKSİSİ ÜZERİNDE EYLEMİ ENGELLEMEK İÇİN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatolojik inceleme

Kese astarı dokusu çıkarıldı ve nötr bir formalin solüsyonunda sabitlendi. Parafine gömülmüş doku slaytları hematoksilen-eozin ile boyandı ve inflamatuar lezyonlar açısından ışık mikroskobu altında incelendi.

İstatistiksel analiz

Sonuçlar ortalama±SE olarak sunuldu. Deney grubu karşılaştırmaları tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey testi düzeltmesi ile yapıldı. AP değeri<0.05 was considered statistically significant.

Sonuçlar

İn vitro, RAW 264.7 hücre kültürü, IFN- ve LPS tedavisi NO üretimini büyük ölçüde arttırdı (Şekil 1). Fucoidan (1-320 μg/mL) ile ön tedavi, makrofaj hücre hattından NO salınımını etkilemedi (Şekil 1A). Buna karşılık, CT ekstraktı (32-320 µg/mL) NO üretimini önemli ölçüde baskıladı, bu da anti-inflamatuar aktivitenin göstergesidir (Şekil 1B).

Fare hava kesesine karragenan enjeksiyonu, kese içindeki eksüda hacmini belirgin şekilde arttırdı (Şekil 2). Bu tür artan eksüdasyon, fukoidan (18 mg/kg) ve CT ekstraktı (54 ve 162 mg/kg) ile işleme tabi tutularak hafifletildi. Daha yüksek doz kombinasyonları (54+162 mg/kg ve 90+270 mg/kg) ek bir etkinlik sergilemese de fukoidan ve CT ekstraktının kombinasyon halinde uygulanması, ayrı ayrı etkilerle karşılaştırıldığında eksuda hacmini daha da azaltmıştır. en düşük doz kombinasyonuna (18+54 mg/kg) (Şekil 2A). Kesedeki N derece içeriği de karagenan enjeksiyonunun ardından büyük ölçüde arttı (Şekil 2B). Fucoidan'ın hafif etkisi ile karşılaştırıldığında, CT ekstraktı N derecesi konsantrasyonunu belirgin şekilde düşürdü. Fucoidan ve CT ekstraktının kombinasyon tedavisi, NO seviyesini doza bağlı bir şekilde daha da azalttı. Benzer şekilde artan PGE2 içeriği, fukoidan ve CT ekstraktının kombinasyon terapisiyle sinerjistik olarak bastırıldı (Şekil 2C).

Kesedeki inflamatuar aracılara paralel olarak, inflamatuar hücrelerin sayısı karragenan enjeksiyonu ile büyük ölçüde arttı: nötrofiller, monositler ve lenfositler için sırasıyla kontrol seviyelerinin 37.8, 4.8 ve 24.1 katı (Tablo 1). Bununla birlikte, fucoidan ve CT ekstraktı, fucoidan'ın CT ekstraktından biraz daha üstün olduğu inflamatuar hücre infiltrasyonunu önemli ölçüde azalttı. Beklenmedik bir şekilde, fukoidan ve CT ekstraktının birlikte uygulanmasıyla inflamatuar hücre infiltrasyonunda hiçbir sinerjistik etki elde edilmedi.

Eksudalardaki inflamatuar hücre infiltrasyonundan anlaşıldığı üzere, hava keselerini çevreleyen deri altı dokuda ciddi inflamatuar lezyonlar görüldü (Şekil 3). Kontrol hayvanlarındaki normale yakın özelliklerle (Şekil 3A) karşılaştırıldığında, Carrageenan'a maruz kalan kalınlaşmış deri altı dokusunda çok sayıda hücre gözlendi (Şekil 3B). Bu tür inflamatuar lezyonlar, fukoidan (Şekil 3C ve 3D) veya CT ekstraktı (Şekil 3E ve 3F) ile tedavi edilerek önemli ölçüde zayıflatılmıştır.

Özellikle, fukoidan ve CT ekstraktı ile kombinasyon terapisiyle daha yüksek anti-inflamatuar etkiler elde edildi (Şekil 3G-3I).

Tartışma

İn vivo dereceli arrageenan kaynaklı hava kesesi iltihaplanma modeli kullanılarak, kemirgenlerin sırtına hava enjeksiyonu, sinovyuma benzer bir yapı oluşturmak üzere boşluğun yüzeyinde katmanlaşan hücrelerin çoğalmasını sağlar. Bu modelde, karragenan kaynaklı inflamatuar hücre infiltrasyonunun enjeksiyonu, vasküler sızıntının göstergesi olan eksüdayı arttırdı. Hava kesesi, lokal olarak biriken sıvı içinde kolayca ölçülebilen inflamatuar hücrelerin ve medyatörlerin rezervuarı olarak görev yapar.

Vasküler geçirgenliği indükleyebilen çeşitli inflamatuar aracılar arasında NO ve PGE2'nin birçok inflamatuar hastalığın patogenezinde rol oynayan ana faktörler olduğu iyi bilinmektedir. Ayrıca ağrı indüksiyonu ve algısının aracıları olarak da bilinirler. Enflamasyon sırasında TNF ve/veya LPS ile uyarılarak çeşitli hücre tiplerinde eksprese edilen ve aktive edilen iNOS, yüksek, kalıcı NO konsantrasyonları üretir. NO, damar sızıntısına yol açan vazodilatasyon gibi çeşitli fizyolojik işlevlerde önemli bir düzenleyici moleküldür. Araşidonik asitten COX'ler yoluyla üretilen PGE2, birçok inflamatuar hastalığın gelişimine katkıda bulunur ve çeşitli inflamatuar uyarılara yanıt olarak PGE2'nin aşırı üretimi, COX-II seviyelerinin yukarı regülasyonu ve inflamasyonun ilerlemesi ile ilişkilidir. Bu nedenle, TNF- - NO ve COX-II-PGE2 yolları, sırasıyla iNOS (kortikosteroidler) ve COX (NSAID'ler) inhibitörleri tarafından bloke edilen iki ana inflamatuar süreç akışı olarak kabul edilmiştir.

inflamatuar hastalıkları yasaklamak için doğal CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Bu çalışmada fukoidan ve CT ekstraktının birlikte uygulanması kesedeki eksüda hacmini azalttı ve bu da bunların vasküler sızıntıya karşı baskılayıcı aktiviteye sahip olduklarını ortaya koydu (Şekil 2A). Her bir fukoidanın ve CT ekstraktının bireysel etkileriyle karşılaştırıldığında, kombinasyon tedavisi daha da arttı, bu da iki dereceli bileşiğin sinerjistik olarak etki gösterdiğini ima etti. Fucoidan ve CT ekstraktı arasındaki bu tür sinerjistik etkiler, eksüdalardaki NO ve PGE2 seviyeleri üzerindeki aktiviteleriyle desteklenmiştir (Şekil 3B ve 2C).

Ancak ilginç bir şekilde, fukoidanın in vitro analizde makrofajların aktivasyonunu doğrudan engellemediği doğrulandı (Şekil 1A). Benzer şekilde fukoidanın in vivo NO ve PGE2 birikimi üzerindeki inhibitör potansiyeli CT ekstraktınınkinden nispeten daha düşüktü (Şekil 2B ve 2C). Fucoidan'ın bu tür bir etki mekanizması, hücrelerin CT ekstraktı ile doğrudan etkisizleştirilmesinden farklıdır (Şekil 1B). Karşılaştırıldığında fukoidan, keselerdeki inflamatuar hücre infiltrasyonunun inhibisyonu üzerinde yüksek bir etkinlik sergiledi (Tablo 1). Fucoidan, nötrofillerin, monositlerin ve lenfositlerin karagenanın neden olduğu doku hasarı bölgelerine göçünü engellemede CT ekstraktından üstündü. İlginç bir şekilde, fukoidan ve CT ekstraktı arasındaki farklı etki mekanizmalarının göstergesi olan hiçbir sinerjistik anti-göç etkisi yoktu: yani fukoidan, inflamatuar hücrelerin infiltrasyonunu bloke ederken, CT ekstraktı hücrelerin aktivasyonunu inhibe eder.

Polimorfonükleer hücreler, özellikle nötrofiller, karragenanın neden olduğu akut inflamatuar bölgelere katılan ana hücresel bileşenlerdir. Ayrıca makrofajlar ve lenfositler gibi inflamatuar hücreler de sitokin salgılayarak inflamatuar süreçte merkezi rol oynarlar. Fukoidan veya CT ekstraktı ile ön işleme tabi tutulduğunda, karragenan enjekte edilmiş hava keselerine göç eden beyaz kan hücrelerinin sayısı belirgin şekilde baskılandı. Bu sonuç, deksametazon gibi kortikosteroidlerle elde edilen ancak indometazin dahil NSAID'lerle elde edilemeyen etkiyle tutarlıydı. Bu nedenle fukoidan ve CT ekstraktının kısmen steroid özelliğine sahip olduğu varsayılmaktadır.

Enflamatuar hücre kemotaksisi üzerindeki bloke edici etkiye ek olarak, CT ekstraktının makrofajların aktivasyonunu baskıladığı ortaya çıktı. Bu, makrofajlar tarafından üretilen ana inflamatuar aracı olan NO in vitro ve in vivo üzerindeki inhibitör etkileriyle doğrulandı. Bu nedenle, CT ekstraktının makrofajlar üzerindeki etkisi, mRNA ekspresyonunun baskılanmasından ve/veya bu hücrelerde iNOS aktivitesinin doğrudan inhibisyonundan kaynaklanıyor olabilir.

PGE2 de önemli inflamatuar aracılardan biridir. COX inhibitörleri olan NSAID'ler tarafından baskılanan doku ödemine paralel olarak artar. Carrageenan kese eksüdasında COX-II mRNA ve COX-II proteinini indükleyerek PGE2 üretimini artırabilir. Bu modelde karragenan, PGE2 miktarını önemli ölçüde arttırdı ve CT ekstraktı ile büyük ölçüde bastırıldı. Bu sonucun bir NSAID indometasin tarafından elde edilebilecek bir etki ile tutarlı olduğunu belirtmek ilginçtir. Dolayısıyla sonuçlardan CT ekstraktının NSAID'lere ek özellikler taşıdığı anlaşılmaktadır. Birlikte ele alındığında, CT ekstraktının karragenan kaynaklı inflamasyon modelinde hem kortikosteroid hem de NSAID benzeri etkiler gösterdiğine ve fukoidanın inflamasyonu arttırdığına inanılmaktadır.CT ekstraktının antiinflamatuar etkileriinflamatuar hücre infiltrasyonunu bloke ederek.

Her ne kadar etki mekanizmasının tam olarak tanımlanması daha fazla çalışma gerektirse de, fukoidan ve CT ekstraktının bir karışımı, karagenan kaynaklı hava kesesi inflamasyonunda TNF-NO ve COX-II-PGE2 yollarını bloke ederek inflamatuar belirtileri belirgin şekilde hafifletti. Bu bulgular, fukoidan ve CT ekstraktının kombinasyon tedavisinin, kortikosteroidlere veya NSAID'lere yanıt veren çeşitli inflamasyon türlerinin hafifletilmesi için umut verici bir aday olabileceğine dair kanıt sağlar.

inflamatuar hastalıkları yasaklamak için doğal CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%