Laktat Dehidrojenaz A'nın Kateşin ile Hedeflenmesi SNU620/5FU Mide Kanseri Hücrelerini 5-Florourasil Bölüm 1'e Yeniden Duyarlılaştırır

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Soyut:Antikanser terapötiklerine direnç, hemen hemen her kanser türünde ortaya çıkar ve kanser tedavisinde büyük bir zorluk haline gelir. 5-fluorourasil (5FU) mide kanseri için antikanser tedavisinde ilk seçenek olmasına rağmen, ilaç direnci nedeniyle etkinliği sınırlıdır. Son zamanlarda, enerji üretimi için oksidatif fosforilasyondan ziyade glikoliz için bir tercih olan Warburg etkisi de dahil olmak üzere değiştirilmiş kanser metabolizması, kemoterapiye direnci düzenleyen çok önemli bir mekanizma olarak kabul edilmiştir. Bu nedenle, yerleşik mide kanseri hücre hatları, SNU620 ve SNU620/5FU.SNU620/5FU, 5FU'ya direnç barındıran bir mide kanseri hücresi kullanarak 5FU direncini iyileştirmede antiglikolitik ajanların ayrıntılı mekanizmasını ve olası yararlılığını araştırdık, çok daha yüksek laktat üretimi ve ekspresyonu gösterdi. nın-ninglikoliz ile ilgili enzimlerlaktat dehidrojenaz A(LDHA) gibi, ana SNU620 hücrelerininkinden daha fazladır. Glikolizi sınırlamak için, bilinen kateşin ve türevlerini inceledik.antienflamatuvarve antikanser doğal ürünleri, çünkü epigallokateşin gallat daha önce LDHA ekspresyonunun baskılayıcısı olarak rapor edilmiştir. Aralarında en basit bileşik olan kateşin, laktat üretimi ve LDHA aktivitesi üzerinde en yüksek inhibitör etkiye sahipti. Ek olarak, 5FU ve kateşin kombinasyonu, SNU620/5FU hücrelerinde ek sitotoksisite ve indüklenmiş reaktif oksijen türleri (ROS) aracılı apoptoz gösterdi. Bu nedenle, bu sonuçlara dayanarak, LDHA'yı kısıtlayarak kemo direnci 5FU'ya düşüren yeni bir adjuvan ilacın geliştirilmesi için bir aday olarak kateşini öneriyoruz.

Anahtar Kelimeler:5-florourasil;kemorezistan; glikoliz; laktat dehidrogenaz; kateşin

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

1. Giriş

Primer tümörün cerrahi rezeksiyonu ve epirubisin, sisplatin ve florourasil ve docetaxel, oksaliplatin ve 5FU[1] gibi florourasil (5FU) bazlı kombinasyon kemoterapisi ile mide kanseri tedavisinde dikkate değer ilerleme kaydedilmiştir[1] ,21 Bugüne kadar, timidilat sentazı [3] inhibe ederek DNA sentezini bloke eden bir urasil analoğu olan 5FU, mide kanserinin tedavisi için yaygın olarak kullanılan bir kemoterapi ilacı olmaya devam etmektedir [1, A4]. Bununla birlikte, ilaç direncine bağlı primer veya metastatik kanserin nüksetmesi nedeniyle kemoterapinin klinik etkinliği tatmin edici olmamıştır [1,5].

Cistanche bağışıklığı iyileştirebilir

İlaç aktivasyonu veya inaktivasyonu, DNA hasarının onarım mekanizması, ilaç hedeflerindeki modifikasyonlar, apoptotik yolakların inaktivasyonu ve artan otofaji gibi çeşitli hücresel süreçler, kemorezistansın altında yatan anahtar mekanizmalar olarak kabul edilir [6,7]. Kanser heterojendir ve çeşitli kanserler enerji metabolizması için hem glikoliz hem de oksidatif fosforilasyon kullanır [8]. Bununla birlikte, metabolik yeniden programlama, özellikle anormal aerobik glikoliz, mide kanserinde 5FU dahil olmak üzere kemoterapötik ilaçlara direncin geliştirilmesinde kilit bir oyuncu olarak bildirilmiştir [9]. Laktat dehidrojenaz A (LDHA) ve piruvat dehidrojenaz kinazlar (PDK'lar), piruvattan laktat üreten aerobik glikolizin anahtar düzenleyicileri olarak bilinir[10,11]. Yerleşik bir PDK inhibitörü olan dikloroasetat kombinasyonu, 5FU'ya karşı duyarlılığı geri kazandırır [12]. Ek olarak, piruvatın laktata dönüşümünü katalize eden anahtar bir enzim olan LDHA'nın mide kanseri tedavisi için potansiyel bir hedef olduğu bildirilmiştir [13,14]. Kanser hücrelerinde LDHA ekspresyonunun yıkılması, mitokondriyal solunumu artırarak ve hücre canlılığını azaltarak tümörijenisiteyi inhibe eder [15]. FX11, PSTMB ve GSK 2837808A gibi birkaç LDHA inhibitörü, ATP seviyelerini düşürür ve oksidatif stres üretir ve sonunda apoptotik hücre ölümüne neden olur [16-18]. Bir çalışma, mikroRNA-34a tarafından LDHA'nın inhibisyonunun kolon kanserinde 5FU'ya karşı direnci geri kazandığını gösterse de [19], önceki hiçbir çalışmada genetik veya farmakolojik LDHA inhibitörlerinin kemorezistans üzerindeki etkileri bildirilmemiştir.

Yeşil çay polifenolleri, kateşin (CA), epikateşin (EC), gallokateşin(GC), epigallokateşin(EGC), epikateşin-3-gallat (EKG) ve epigallokateşin-3-gallat (EGCG), insanı teşvik eder inflamasyon, diyabet, kardiyovasküler hastalık ve habis kanser gibi çeşitli hastalıkları önleyerek ve tedavi ederek sağlık sağlar [20,21]. Polifenoller arasında EGCG, AMPK yollarını aktive ederek ve kanser kökünü kısıtlayarak kolorektal kanser ve hepatoselüler karsinom hücrelerinde 5FU kemosensitivitesini arttırır [22,23]. Ek olarak, EGCG'nin meme ve pankreas kanseri hücrelerinde ekspresyonunu baskılayarak LDHA'yı inhibe ettiği bildirilmiştir [24,25].

Bu çalışmada, CA'nın mide kanseri hücrelerinde 5FU'ya direnci azaltmak için bir adjuvan ilaç adayı olabileceğini varsaydık. CA'nın ve/veya 5FU ile kombinasyonunun LDHA aktivitesi üzerindeki inhibitör etkisinin, dolayısıyla 5FU'ya dirençli hücrelerde mitokondriyal reaktif oksijen türlerini (ROS) ve apoptotik hücre ölümünü indüklediği incelenmiştir.

2. Sonuçlar

2.1. 5FU'ya Dirençli Hücrelerin Glikolitik Özellikleri

Gelişmiş proliferasyon, 5FU'ya dirençli kanser hücrelerini içeren kemorezistansın bir özelliğidir [26,27]. İlk olarak, SNU620 ve SNU620/5FU hücrelerinin 5FU'ya direncini ve uzun vadeli büyüme oranlarını doğruladık. Bu hücreler 48 saat boyunca belirtilen 5FU konsantrasyonlarıyla kültürlendiğinde, SNU620/5FU hücrelerinde (100.63 uM) yüzde 50 büyüme inhibisyonuna (Gl50) neden olan tahmini doz, ana SNU620 hücrelerinde GIso'ya neden olandan çok daha yüksekti （28.88 μM ）（Şekil 1A ve Ek Şekil S1）. Ek olarak, SNU620/5FU hücrelerinin büyüme oranları, SNU620 hücrelerininkinden daha hızlıydı (Şekil 1B ve Ek Şekil S2). Kemorezistans ve hızlı büyüme özellikleri, mide kanseri hücrelerinde yüksek glikolitik özelliklerle ilişkili olabileceğinden [28], hücre dışı asitlenme oranları (ECAR) ve oksijen tüketim oranları (OCR), her iki hücrede de oksamat varlığında ölçülmüştür. glikoliz inhibitörü veya değil. Sonuçlar, SNU620/5FU hücrelerinin, SNU620 hücreleri tarafından salgılanandan önemli ölçüde daha fazla laktat salgıladığını ve ardından kültür ortamını asitleştirdiğini gösterdi (Şekil 1C ve Ek Şekil S3). Ancak, bu hücreler arasında OCR'de önemli bir değişiklik gözlenmedi(Şekil 1D). LDHA'nın mRNA ve protein ekspresyon seviyeleri ölçüldü. LDHA ekspresyonu, SNU620/5FU hücrelerinde SNU620 hücrelerinden daha yüksekti (Şekil 1E, F). Ayrıca, PDK izotiplerinin mRNA ve protein ekspresyon seviyelerini inceledik ve PDK2 ve PDK3'ün SNU620/5FU hücrelerinde SNU620 hücrelerinden daha yüksek olduğunu bulduk (Ek Şekil S4A, B). PDK'lar tarafından arttırılan piruvat dehidrojenazın (PDHA1) E1 alt biriminin fosforilasyonu da değerlendirildi ve SNU620/5FU hücrelerinde SNU620 hücrelerine göre daha yüksek olduğu bulundu (Ek Şekil S4C). SNU620/5FU hücrelerinde 5FU direncinin üstesinden gelmek için bir LDHA inhibitörü olarak oksamat. Bu bileşik, hem SNU620 hem de SNU620/5FU hücrelerinde hücre büyümesini inhibe etti (Ek Şekil S5). Ayrıca oksamat ve 5FU ile birlikte tedavi, oksamat veya 5FUin SNU620/5FU hücreleri ile bireysel tedaviye kıyasla hücre büyümesini bastırdı(Şekil 1G). Bu veriler, SNU620/5FU hücrelerinin LDHA'yı yüksek oranda eksprese ettiğini ve LDHA aktivitesinin inhibisyonunun, SNU/5FU hücrelerinin 5FU'ya direncinin üstesinden gelebileceğini göstermektedir.

Şekil 1. Sonuçlara göre,5-florourasil (5FU)-dirençli hücreler, yüksek bir glikolitik özelliğe sahiptir:(A)SNU620 ve SNU620/5FU hücreleri, 48 saat boyunca belirtilen 5FU konsantrasyonları ile işleme tabi tutulmuştur. Bu hücrelerin canlılığı MTT tahlili ile değerlendirildi;(B)SNU620 ve SNU620/5FU hücrelerinin büyüme seviyeleri, MTT tahlili ile 4 gün boyunca her gün ölçüldü;(C,D)SNU620 ve SNU620/5FU hücreleri oksamat ( 5mM) veya 24 saat boyunca değil ve ECAR ve OCR değerleri Seahorse XF analizörü ile değerlendirildi;(E, F) LDHA'nın SNU620 ve SNU620/5FU hücrelerindeki ifadeleri qRT-PCR ve Western blot analizi ile tespit edildi; (G) SNU620 ve SNU620/5FU hücreleri oksamat (25 mM) ve/veya 5FU（10μM） ile 48 saat süreyle işleme tabi tutuldu.Sonuçlar ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA, LDHA Etkinliğini Bastırıyor

Laktat üretimi, SNU620/5FU hücrelerinde CA ve EC, GC, EGC ve EGCG dahil türevleri ile analiz edildi. Bu türevlerle karşılaştırıldığında, CA laktat üretimini daha etkili bir şekilde azalttı (Şekil 2A). Ayrıca, in vitro, LDHA aktivitesi deneyi doğrulandı ve CA, LDHA aktivitesi üzerinde türevlerininkinden daha güçlü bir inhibitör etki gösterdi (Şekil 2B). CA'nın in vitro LDHA ve LDHB aktiviteleri üzerindeki inhibitör etkileri doza bağlı bir şekilde ölçüldü. CA, LDHB aktivitesini etkilemeden LDHA aktivitesini inhibe etti (Şekil 2C, D). Ek olarak, LDHA ve LDHB aktiviteleri, LDHA aktivitesini inhibe ettiği bilinen ve doza bağlı olarak azaldığı tespit edilen EGCG ile ölçüldü (Ek Şekil S6A, B). Ayrıca, hücre içi LDHA ve LDHB aktiviteleri, SNU620/5FU hücrelerinde belirtilen CA konsantrasyonları ile değerlendirildi. CA, in vitro sonuçlarda doza bağımlı bir şekilde LDHA aktivitesini inhibe etti, ancak LDHB aktivitesini inhibe etmedi (Şekil 2E, F). CA tedavisinden sonra SNU620/5FU hücrelerinde p-PDHA1, PDK2, PDK3 ve LDHA'nın protein ekspresyon seviyeleri de ölçüldü (Ek Şekil S7) ve bunların bu tedaviden etkilenmediğini gözlemledik. Bu sonuçlar, CA'nın ifadesini etkilemeden LDHA aktivitesini düzenlediğini göstermektedir.

2.3. CA tarafından LDHA İnhibisyonunun Eylem Modu

CA ve türevleri üzerindeki LDHA aktivitesinin inhibisyon mekanizmasını analiz etmek için, insan rekombinant LDHA ve CA arasındaki bağlanma etkileşiminin moleküler modellemesini gerçekleştirdik (Şekil 3A,B). Sonuçlar, CA'nın LDHA'nın T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 ve T247 kalıntıları ile etkileşime girebileceğini gösterdi. Bunlar arasında, R105, S136 ve R168, substrat (piruvat) bağlanması için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, CA'nın substrat bağlama bölgelerine müdahale edebileceğini varsaydık. Aksine, EGCG farklı bir site üzerinden LDHA'ya bağlıdır. CA tarafından LDHA inhibisyonunun etki modunu daha da doğrulamak için, Michaelis-Menten ve Lineweaver-Burk grafikleri çeşitli piruvat ve CA konsantrasyonları ile doğrulandı. LDHA aktivitesi, piruvat doza bağlı bir şekilde arttı. Ancak, CA'nın artmasıyla tersine döndü. Bu nedenle, Michaelis-Menten ve Lineweaver-Burk grafiklerinin sonuçları, CA'nın LDHA'ya karşı rekabetçi olmayan bir inhibitör olduğunu gösterdi(Şekil 3C,D). Ek olarak, izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) verileri, CA'nın LDHA'ya bir Kd tarafından fiziksel olarak bağlandığını gösterdi. 197 uM değeri (Ek Şekil S8). Bu sonuçlar, CA'nın LDHA'nın substrat bağlama bölgesini bağlayarak LDHA aktivitesini baskıladığına dair bilgiler sağlar.

2.4. CA, LDHA Aktivitesini Azaltarak 5FU Direncini Yeniden Duyarlılaştırır

CA'nın SNU620 ve SNU620/5FU hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerini değerlendirdik ve CA'nın her iki hücre grubunda da büyümeyi baskıladığını bulduk(Şekil 4A). Büyüme inhibisyonunun LDHA aktivitesinin baskılanması ile ilgili olduğunu doğrulamak için, LDHA ekspresyonu, LDHA (shLDHA) için kısa saç tokası ribonükleik asit (shRNA) ile ortadan kaldırıldı ve ekspresyonu, LDHA eksprese eden plazmit transfeksiyonu ile geri kazanıldı (Ek Şekil S9A, B). ). shLDHA ile transfekte edilmiş SNU620/5FU hücrelerinde, laktat üretimi ve hücre canlılığı, sahte transfekte edilmiş hücrelere kıyasla CA tedavisi ile belirgin bir şekilde değişmedi (Şekil 4B, C). Ayrıca, CA'nın büyüme önleyici etkisi LDHA yıkılan SNU620/5FU hücrelerinde LDHA ifadesinin geri kazanılmasıyla arttı(Şekil 4D). Ayrıca, SNU620 ve SNU620/5FU hücreleri, CA ve 5FU'nun ayrı ayrı veya her ikisinin kombinasyonunun tedavisinin ardından incelendi. CA ve 5FU ile birlikte tedavi, SNU620/5FU hücrelerinin büyümesini önemli ölçüde engelledi (Şekil 4E). Ek olarak, CA ve 5FU'nun kombinasyon etkileri, insan mide kanseri AGS, pankreas kanseri Panik-1, MIA PaCa-2 ve kolon kanseri LS174T ve RKO hücreleri gibi diğer bazı hücre dizilerinde incelenmiştir. SNU620 ve SNU620/5FUcell'ler. Laktat üretimi ve LDHA ekspresyonu birbiriyle iyi bir korelasyon gösterdi ve bu glikolitik özellikler SNU620/5FU, AGS ve RKO'da nispeten yüksektir (Ek Şekil S10A, B). Ayrıca, CA ve 5FU'nun kombinasyon tedavisi, AGS ve RKO dahil glikolitik hücrelerde tek bir 5FU tedavisine kıyasla hücrelerin canlılığını önemli ölçüde azalttı (Ek Şekil S10C). Ancak CA ve 5FU ile birlikte tedavi, düşük LDHA ifadeleri gösteren SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2 ve LS174T hücrelerinde büyümeyi önemli ölçüde engellemedi. Bu sonuçlar, CA'nın 5FU'ya dirençli hücrelere duyarlılaştırıcı etkisinin, LDHA aktivitesi üzerindeki inhibitör etkisiyle ilişkili olabileceğini öne sürdü.

Şekil 2. Kateşin(CA), LDHA aktivitesini inhibe eder, ancak ekspresyonunu değil:(A)SNU620/5FU'nun laktat üretimi, CA türevleri （10 μM） ile 24 saat boyunca muamele edildikten sonra ölçüldü;（B）in vitro LDHA aktivitesi, tedavi üzerine değerlendirildi CA türevleri (10 uM) ve oksamat (20 mM);(C,D)in vitro, LDHA ve LDHB aktiviteleri, belirtilen CA konsantrasyonları ile tahmin edildi; (E, F)hücreler, 24 saat boyunca belirtilen CA konsantrasyonları ile işlendi. Hücre içi LDHA ve LDHB aktiviteleri, bir enzim kaynağı olarak hücre lizatları kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak gösterilir. **p<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Şekil 4. Hücre canlılığı, 5FU'ya dirençli hücrelerde kateşin (CA) ve 5-florourasil (5FU) ile birlikte muamele edilerek inhibe edildi:(A) SNU620 ve SNU620/5FU hücrelerinin canlılıkları, belirtilen konsantrasyonlarda muamelenin ardından değerlendirildi. 48 saat CA;（B）SNU620/5FU-pLKO.1 ve SNU620/5FU-shLDHA hücreleri, 24 saat CA（10 μM） ile işlendi. SNU620/5FU-pLKO.1 ve SNU620/5FU-shLDHA hücrelerinin kültür ortamında laktat üretimi ölçüldü;(C, D)SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA plus EV ve SNU620/5FU-shLDHA artı LDHA#2 hücreleri, belirtilen CA konsantrasyonları ile 48 saat süreyle işlendi. Hücre canlılığı bir MTT tahlili kullanılarak ölçüldü;（E） SNU620 ve SNU620/5FU hücreleri, 48 saat boyunca CA（10 μM） ve/veya 5FU（10μM） ile işlendi. Bu hücrelerin canlılıkları MTT tahlili ile ölçülmüştür. Sonuçlar ortalama±SEM olarak gösterilmiştir.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Bu makale Int. J. Mol. bilim 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms