Renal Fibrozis Gelişiminde Dönüştürücü Büyüme Faktörü- (TGF-)'nin Merkezi Rolü
Mar 26, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
BÖLÜM Ⅰ: TGF- 1- Aracılı Fibrozis Taklit Cihazlarında İnsan Primer Renal Fibroblastının Rolü
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee ve diğerleri.
1. Giriş
böbrek fibrozuSayısız ilerleyici böbrek hastalığının son ortak yolu, hücre dışı matris (ECM) protein üretiminde bir artış, matris bozulmasında bir düşüş, hücre-matris etkileşiminin işlevsizliği, yerleşik hücrelerin dönüşümü ve enflamatuar hücre infiltrasyonu ile karakterize edilir.Dönüştürücü büyüme faktörü-(TGF- ) hücre proliferasyonu, farklılaşması ve immünolojik tepkiler gibi biyolojik süreçleri düzenleyen çok işlevli bir dimerik peptittir [1]. Çok sayıda fibrojenik faktör arasında, TGF- (Dönüştürücü büyüme faktörü-) merkezi bir rol oynar ve bir anti-inflamatuar etkiye sahiptir. TGF- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)-eksik fareler büyük iltihaptan ölür. TGF'yi aşırı ifade eden transgenik fareler- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)esas olarak anti-inflamatuar aktivitesi sayesinde, gelişen renal fibrotik patolojiden neredeyse korunur [2]. TGF-'nin profibrotik ve antiinflamatuar özellikleri(Dönüştürücü büyüme faktörü-)TGF-'nin terapötik uygulamasıyla ilgili iki ucu keskin kılıçlardır.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)inhibisyon. TGF-'yi engellemek için dikkate değer çabalar sarf edilmiştir.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)ilerlemesini engellemek için eylemböbrekfibroz[3]. mücadele etmek için birçok yaklaşım kullanılmış olsa daböbrekfibrozmevcut ilaçları değerlendirmek için deneysel bir model ideal değildir.
cistanche otu önlemekböbrek hastalıkları
Genel olarak, hayvan çalışmaları, farmakokinetik ve ilaç etkinliğini öngörmede klinik öncesi testlerde çok önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, hayvanlar ve insanlar arasında çeşitli farklılıklar vardır ve bu da bizi hayvan bazlı ilaç etkinliği ve güvenlik testlerinin doğruluğunu sorgulamaya iter. 4. Önceki raporlar, ilaçların nefrotoksisitesini ve güvenliğini değerlendirmek için ilaç geliştirme sırasında klinik öncesi hayvan çalışmalarına dayanıyordu. Hayvanların böbrek fonksiyonu, insan böbreklerinin iki katından fazladır. Bu nedenle, ilaçlar hayvanlarda insanlara göre daha hızlı metabolize edilir ve bu da hayvan çalışmaları kullanılarak yapılan ilaç toksisitesi testlerinin sonuçlarını açıklamayı zorlaştırır. Ayrıca, hayvanlar farklı fizyolojik işlevlere sahip olduklarından, hayvan deneylerinin sonuçları insanlarda ilaç tepkilerini tahmin etmek için kullanılamaz. Hayvan bazlıböbrek fibrozumodellerin insan üremesinde güçlükleri varböbrek fibrozu; bu nedenle, mevcut engellerin üstesinden gelmek ve ilaç keşif platformlarını optimize etmek için araştırmalar devam etmektedir [5].
Çip üzerinde organ (OoC) teknolojisi, bu sorunları çözmek için yeni bir kavram olarak ortaya çıkmıştır. Bu platform mevcut eksiklikler göz önünde bulundurularak tasarlanmış ve nefroloji alanında büyük umut vaat etmiştir [6]. Ek olarak, OoC modelleri, deneysel hayvan modellerinin yerini alacak büyük bir potansiyele sahiptir, türler arası farklılıklar için bir çözüm sağlar ve hayvan zulmünün ve etik tartışmaların sona ermesine yardımcı olabilir [7]. Önemli hücreler olan endotelyal ve epitelyal hücrelerle primer renal fibroblastları aynı anda kullanan birkaç in vitro model vardır.böbrekfibroz. Her hücrenin rolüfibrozayrı olarak incelenmektedir; ancak, hücrelerin etkileşimi hakkında sınırlı bilgi vardır.
Bu çalışmada geliştirdiğimizfibroz- insan birincil fibroblastlarını kullanan cihazları taklit etmek. TGF'nin- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)tedavisinin çeşitli etkileri vardır.böbrek fibrozumodeli. Özellikle, fibroblastlar efektör hücreler olarak çok önemli bir rol oynar, pro-fibrotik bir mikro ortamın oluşumunu teşvik eder ve büyüme faktörleri ve sitokinler salgılar. Bu nedenle, bu yeni yönteme dayalı olarak, fibroblastlar böbrek hastalığını incelemek için ideal bir hücre modeli sistemi sağlayabilir. Fibrotik böbrek hastalığından türetilen fibroblastların, üç boyutlu (3D) kültürlenen hücrelerin bütünlüğünü etkileyip etkilemediğini değerlendirdik. Son olarak, insanın potansiyelini gösteren bir ilke kanıtı çalışması sunuyoruz.böbrek fibrozu- İnsana tepkiyi tahmin etmek için bir model olarak cihazları taklit etmekböbrek fibrozu.
cistanche'nin etkileri: böbrek enfeksiyonunu tedavi edin
2. Sonuçlar
2.1.Alfa Düz Kas Aktin(a-SMA)ve Keratinin-8(KRT-8)TGF ile Tanımlanması- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)HK-2 Hücrelerinde
Erken aşamada, bilinen belirteçleri inceledik.fibrozve iki boyutlu (2D) kültürlerde hücre iskeleti. Fibrozis ve tübüler epitelden mezenkimal geçiş (EMT) işaretine -SMA ekspresyonunu ve hücre iskeleti işareti olarak KRT8 seviyelerini tahmin etmek için immünofloresan boyama deneyleri yapıldı. İmmünofloresan boyama, -SMA ekspresyonunun orijinal olarak zayıf olduğunu ve tek katmanlı HK-2 epitel hücrelerinde KRT8 seviyelerinin yüksek olduğunu gösterdi. TGF- 1 ile floresan yoğunluğunda önemli bir değişiklik olmadı(Dönüştürücü büyüme faktörü-)(5 ng/mL) veya 24 saat boyunca HK-2 epitel hücrelerinin spesifik inhibitör tedavisi (Şekil 1).
Şekil 1. İmmünofloresan, alfa-SMA ve keratin-8(KRT8) ifadesinin TGF- 1 tedavisi ile korunduğunu gösterir.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)veya HK-2 hücrelerindeki inhibitör.(A)alfa-SMA ve (B)CCK-8 ifadesinin TGF tarafından HK-2hücreleri üzerinde hiçbir etkisi olmadı- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)(5ng/mL) veya inhibitör. Hücreler orijinal olarak kuyu başına 1x10 derecelik bir yoğunlukta kaplandı (ac)işlenmemiş kontrol ve （df）5ng/mL TGF- 1 ile uyarıldı(Dönüştürücü büyüme faktörü-) or（gi）10 μM inhibitör（SB431542） 24 saat süreyle ve yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlendi. Hücreler daha sonra 20 dakika boyunca anti- -SMA ve anti-sitokeratin-8 ile boyandı. Hücre çekirdeklerini belirlemek için Hoechst boyası H33342 ile birlikte boyama yapıldı. Mikrograflardaki ölçek çubukları 200 um'yi gösterir.
cistanche tozu böbrek fonksiyonunu iyileştirir
2.2. KRT8 İfadesi TGF Tarafından Azaltıldı- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)bir çip üzerinde
Daha sonra, 3D kültürlü HK-2'de -SMA ve KRT8 ekspresyon seviyelerini ve TGF- 1 ile tedavi edilen GFP-insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC'ler) toplam uzunluğunu değerlendirdik.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)ve spesifik bir inhibitör. Bunu başarmak için önce iki hücre tipinden, HK-2 epitelyal hücrelerden ve GFP-HUVEC'lerden oluşan bir doku çip modeli oluşturduk. Yapının onaylanmasının ardından doku çipini TGF- 1 ile ortaya çıkardık.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)(5 ng/mL) veya 24 saat boyunca spesifik bir inhibitör (10 um SB431542).
Şekil 2A-C'de gösterildiği gibi, -SMA'nın ifadesi TGF- 1 tarafından özel olarak değiştirilmemiştir.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)veya spesifik inhibitör tedavisi. Bununla birlikte, iki hücreli tip ortak kültürlü çipte KRT8'in ifadesi azaldı. Ayrıca, bir TGF-ß1 inhibitörünün eklenmesi, KRT8'in ekspresyonunu arttırdı.
TGF- 1 tarafından 3D boru şeklindeki kılcal benzeri bir ağın oluşumunu inceledik.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)HUVEC'lerde tedavi, endotel hücreleri kendiliğinden 3D tübüler kılcal benzeri bir ağ oluşturabileceğinden. Kültürel koşullarımıza uygun olarak kalın çizgilerin oluşumu önemli ölçüde azaldı. Ancak TGF- 1'de kılcal damar benzeri ince çizgiler arttı.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)tedavi edilen GFP-HUVEC'ler. TGF söz konusu olduğunda- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)3D kültürlü çip üzerinde inhibitör tedavisi, kalın ve kalın çizgilerin toplam uzunluğu, TGF'ye ters bir eğilim gösterdi- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)tedavi. Tedavi edilmeyen kontrol grubuna kıyasla kalın çizginin uzunluğunda bir artış gözlendi. TGF'den sonra GFP-HUVEC'de kalın çizginin çapında benzer bir model gözlendi- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)tedavi ve inhibitör tedavisi. GFP-HUVEC'in çapı TGF tarafından bastırıldı- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)tedavi ancak hem kontrollere hem de TGF'ye kıyasla inhibitör tarafından çizginin kalınlığından bağımsız olarak arttı- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-). Kalın çizginin toplam uzunluğu ve çapı, tedavi edilmemiş kontrol ve TGF- 1 tedavisine kıyasla TGF- 1 inhibitör tedavisi ile önemli ölçüde arttı. Özellikle, elde edilen sonuçlar, TGF-'de küçük damarların yoğunluğunun arttığını gösterdi.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)- tedavi edilen grup, tedavi edilmeyen meslektaşlarına kıyasla. Buna karşılık, TGF'deki kalın damarların yoğunluğu- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)tedavi grubu, tedavi edilmeyen kontrol grubundan daha düşüktü (Şekil 2D, E).
Şekil 2. HK-2 cinsinden KRT8 ifadesi ve HUVEC'lerin toplam uzunluğu ve çapı.(A)İmmünofloresan, -SMA ifadesinin korunduğunu ve KRT8 ifadesinin TGF tedavisiyle önemli ölçüde azaldığını gösterir- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)HK'de-2. Hücreler plakalandı ve 5ng/mL TGF- 1 ile uyarıldı(Dönüştürücü büyüme faktörü-)veya 24 saat süreyle 10 μm inhibitör （SB 431542） ve yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlendi. Hücreler, 20 dakika boyunca anti- -SMA ve anti-sitokeratin-8 ile boyandı. Hücre çekirdeklerini belirlemek için Hoechst boyası H33342 ile birlikte boyama yapıldı. -SMA(ac) ifadesinin hiçbir değişikliği olmadı, ancak HK-2 hücrelerinde KRT8(df) ve HUVEC (gi) ifadesinde GFP, TGF- 1 ile önemli ölçüde değişti.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)(5 ng/mL) ve inhibitör (B, C). HUVEC'lerin toplam uzunluğunda, TGF ile ince damar arttırılmış ancak kalın damar azaltılmıştır- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-). Hem ince hem de kalın damarlarda çap arttı. Bu sonuçlar inhibitör SB431542 (D, E) tarafından tersine çevrildi. Mikrograflardaki ölçek çubukları 100 μm'yi gösterir.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
cistanche ne için kullanılır: kronik böbrek hastalıklarının tedavisi
2.3. TGF- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)Çok Bölmeli Yapıya Sahip Çipin Üç Hücre Tipini Etkiler
TGF'yi incelemek için- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)önerilen 3D çipin yanıtları, her bölmede ayrı ayrı immün boyama gerçekleştirdik (Şekil 3). Bu analizde birincil insan renal fibroblastları kullanıldı. Numuneler FACS kullanılarak analiz edildi ve fibroblast marker antikoru için pozitif olduğu doğrulandı. Üç hücre tipinin TGF ile inkübasyonunu takiben- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)24 saat boyunca, -SMA ve KRT8'in ekspresyonunu değerlendirmek için immün boyama yapıldı. a-SMA'nın ifadesi, TGF-1 tedavisi ile yukarı regüle edildi ve TGF- 1 ile zıt sonuçlar gözlemlendi.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)inhibitör tedavisi. Tersine, KRT8'in ifadesi TGF tarafından aşağı regüle edildi- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)ve TGF-'ye karşı bir tepki gösterdi.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)inhibitörü (Şekil 4A-C).
Şekil 3. İmalat ve deneysel programın cihaz şematik gösterimi ile örnek görüntü.(A) En üstteki iki resim düzeni gösterir. Soldaki resim, cihazın yukarıdan aşağıya genel bir fotoğrafını gösterir. Alttaki resimler enine kesiti göstermektedir. Sıvı kılavuzların boyutlarını detaylandıran şematik görünüm. (B) Bu şekil için deneysel programları açıklarfibroz- taklit eden cihazlar. Her kuyu için dört aşamalı yükleme işlemi. Her hidrojel desenleme alanının konumu ve ayrıca ortamın yukarıdan aşağıya ve izometrik kesitte yerleştirilmesi. (1) Toplam 1.5 uL hidrojel 1 kendiliğinden merkezi kanala yönlendirilir. (2)Merkezi kanal 5uL hidrojel ile doldurulur. (3) Rezervuar zemininde toplam 10uL hidrojel 3 desenlidir. （4）Toplam 200μL ortam dağıtılır. Kırmızı ölçek çubuğu=9 mm.
Şekil 4D-G'de gösterildiği gibi, kılcal damar benzeri ince çizginin uzunluğu TGF- 1 ile önemli ölçüde arttırılmıştır.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)GFP-HUVEC'lerde tedavi. Ancak TGF'de kalın çizginin kalınlığı azaltıldı- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)tedavi edilen HUVEC'ler. HUVEC'lerdeki ince ve kalın damarlar için çap ortalama olarak küçülmüştür. TGF durumunda- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)3D kültürlü çip üzerinde inhibitör tedavisi, kalın ve kalın çizgilerin toplam uzunluğu, TGF- 1 tedavisine zıt bir eğilim gösterdi. Ayrıca, kalın çizginin uzunluğu, tedavi edilmeyen kontrol grubuna kıyasla arttı.
Şekil 4. Primer renal fibroblastlar ile 3D kültürlü HK-2 ve HUVEC'lerin değişimi.Toplam hücreler, 3D çip başına 5x10 derecelik bir yoğunlukta kaplandı ve 5 ng/mL TGF ile uyarıldı- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)veya 24 saat süreyle 10 μm inhibitör （SB 431542） ve yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlendi. (A) 3D çipteki hücreler, anti-o -SMA ve anti-sitokeratin-8 ile boyandı. -SMA (ac) ekspresyonu arttı ve KRT8(df) ekspresyonu TGF- 1(5 ng/mL) ile önemli ölçüde azaldı. HUVEC'lerin toplam uzunluğu; TGF-ß1 ile ince damarlar çarpıcı biçimde arttı ve kalın damarlar azaldı(Dönüştürücü büyüme faktörü-)（D, E). İnce ve kalın damarlar için çap küçültüldü(F, G). Bu sonuçlar inhibitör SB431542 tarafından tersine çevrildi. Mikrograflardaki ölçek çubukları 100 μm'yi gösterir*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Enflamatuar Aracı ve Büyüme Faktörlerini Modüle Eder
Daha sonra, süpernatandaki inflamatuar sitokinleri ve büyüme faktörlerini araştırdık; IL-1 , FGF-2, TGF- 2(Dönüştürücü büyüme faktörü-)ve TGF- 3(Dönüştürücü büyüme faktörü-)Aynı toplam hücre sayısına sahip olmalarına rağmen, 3D kültürlü çiplerde protein salgılanması, iyi kültürlenmiş 2D fibroblasttan önemli ölçüde daha yüksekti. Ancak, TGF- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-) 2D veya 3D kültürlü modeller benzer konsantrasyonlarda TGF- 1 ile işlendiğinden, seviyeler benzerdi(Dönüştürücü büyüme faktörü-)(Şekil 5A-E). Özellikle, insan primer renal fibroblastlarından FGF-2 salınımı, 2D tek katmanlı kültürün 20.9 ± 0.4 pg/gün/5×10 derece hücresiydi ve İşlenmemiş kontrolde 3D kültürlü çipin HUVEC'leri ve HK-2'sini içeren 3094,8± 0,2 pg/gün/5× 10 derece hücreler. FGF-2'nin TGF- 1 tarafından salgılanması(Dönüştürücü büyüme faktörü-)stimülasyon, 2D kültür için 31.0±0.2pg/gün/5×10 derece hücre ve 3D için 3683.9± 0.8 pg/gün/5×10 derece hücre - kültürlü çip. 2B tek katmanlı kültürde FGF-2 protein üretimindeki bu artış, TGF- 1 tarafından 3B kültürlü çip modelindeki bir artışla paraleldi.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)tedavi (Şekil 5B).
Şekil 5. Renal fibrozis taklit eden platformlar olarak 2B ve 3B kültürlü modellerin karşılaştırılması.Hücreler, 2D kuyu veya 3D çip başına 5x10 derecelik bir yoğunlukta kaplandı ve 5ng/mL TGF- 1 ile uyarıldı.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)veya 24 saat süreyle 10 um inhibitör (SB 431542). 2B kültürlü ve 3B kültürlü modelde birincil insan renal fibroblastları kullanıldı. Fibroblastlar, HUVEC'ler ve HK-2 ile kültürlenmiş 8x10* yoğunlukta kullanıldı. Birincil insan renal fibroblast-HUVEC oranı veya F:H oranı, değerlendirme için 1:5 idi.fibroz.HK-2 hücreleri 2x104 yoğunlukta kullanıldı. Süpernatanttaki(A)IL-1,(B)temel fibroblast büyüme faktörü (FGF-2) ve(CE)TGF-beta 1, 2 ve 3'ün tespiti, multipleks analizi ile gerçekleştirilmiştir. sitokinler ve multipleks boncuk immünoassay. Her çubuk ortalama± SE'yi temsil eder.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Dönüştürücü büyüme faktörü-).
cistanche tubolosa faydaları: böbrek hastalıklarının tedavisi
Ayrıca, IL-1 , IL-6, IL-8 ve TNF- gibi proinflamatuar sitokinlerin mRNA ekspresyonunu tahmin ettik. Sonuçlar, rekombinant insan TGF- 1 tarafından önemli ölçüde aşağı regüle edildi(Dönüştürücü büyüme faktörü-)TGF-'nin bir anti-inflamatuar özelliği olarak 3D-kültürlü çipte tedavi(Dönüştürücü büyüme faktörü-). mRNA ifadesinin TGF- 1 tarafından yukarı doğru düzenlendiğini bulduk(Dönüştürücü büyüme faktörü-)inhibitörü (SB431542). Ayrıca, IL-6, IL-8 ve TNF-'nin inhibitör aracılı ifadesi, işlenmemiş kontrole kıyasla spesifik olarak aşağı regüle edildi (Şekil 6A-D). Fibrotik bir faktör olan VEGF'nin mRNA seviyesi, TGF- 1 tarafından önemli ölçüde arttırıldı.(Dönüştürücü büyüme faktörü-)tedavi. VEGF'nin mRNA seviyesi, TGF- 1 inhibitörü tarafından azaltılırken (Şekil 6E), IL-10'nin anti-fibrotik etkiye sahip mRNA ifadesi, TGF'nin neden olduğu fibrotik koşullarda azalmıştır- 1 . Buna karşılık, I-10mRNA ifadesi, TGF- 1inhibitör tedavisi ile arttırıldı (Şekil 6F).
Şekil 6. Gerçek zamanlı PCR, 3D çipin genel mRNA ifadesini gösterir.Hücreler, 3D çip başına 5x10 derecelik bir yoğunlukta kaplandı ve 5ng/mL TGF ile uyarıldı- 1(Dönüştürücü büyüme faktörü-)veya 24 saat süreyle 10 um inhibitör (SB431542). 3D kültürlü çipten çıkarılan toplam RNA. (A)IL-1 ,(B)TNF-,(C)IL-6 ve (D)IL-8'nin mRNA ifadesi, TGF'nin anti-inflamatuar etkisini temsil eder{ {10}}(Dönüştürücü büyüme faktörü-)tedavi. (E) Bir anjiyojenik faktör olarak VEGF ekspresyonu arttı. Bir anti-fibrotik faktör olarak (F)IL-10 ifadesi TGF- 1 tarafından önemli ölçüde azaldı.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Dönüştürücü büyüme faktörü-).
