Konjenital Kalp Hastalığında Nöroproteksiyonun Güncel Durumu Bölüm 3

3.2. Ektopik Mitokondriyal DNA'nın Yarı Kantitatif Değerlendirilmesi

Hsp60 boyamasının (mitokondriyal matris) ve histon-H2B boyamasının (nükleer işaretleyici) görüntüleri, dsDNA boyamasının görüntülerinden çıkarıldı. Daha sonra, lmage] yazılımının (Ulusal Sağlık Enstitüleri) "AdjustThreshold" işlevi kullanılarak görüntüler ikili hale getirildi.

Mitokondri, hücrelerin ihtiyaç duyduğu enerjiyi sağlamak için ATP'nin sentezlenmesinden sorumlu olan hücrelerdeki enerji fabrikalarıdır. Mitokondriyal matris, çeşitli enzimler ve iyonlar içeren ve mitokondrinin çeşitli biyokimyasal reaksiyonları için anahtar bölge olan mitokondrinin iç sıvısıdır. Bellek, insanın en önemli bilişsel yeteneklerinden biridir. Her ne kadar bu ikisi ilgisiz gibi görünse de birbiriyle yakından ilişkilidir.

Araştırmalar mitokondriyal matris ile hafıza arasındaki etkileşimi gösteriyor. Mitokondriyal matristeki enzimler ve iyonlar, nöronal hücrelerdeki enerji metabolizmasını ve iyon kanalı durumunu düzenleyerek nöronların uyarılabilirliğini doğrudan etkileyebilir, dolayısıyla hafızayı etkileyebilir. Ek olarak mitokondriyal matriste, nöronların aksonları ve sinapsları yoluyla aşağı yöndeki nöronlara iletilebilen, nöronların sinyal iletim verimliliğini etkileyen, dolayısıyla hafızanın oluşumunu ve sağlamlaşmasını etkileyen çeşitli sinyal molekülleri vardır.

Aynı zamanda hafıza aktivitesi mitokondriyal matrisin durumunu da doğrudan etkiler. Bellek aktiviteleri, nöronların enerji tüketimini artıracak ve mitokondriyal matristeki redoks reaksiyonunu teşvik edecek, böylece mitokondrinin metabolik seviyesini ve hücre içi iyon dengesini etkileyerek nöronların uyarılabilirliğini ve sinyal iletim verimliliğini daha da etkileyecektir.

Bu nedenle, iyi mitokondriyal sağlığı korumak, iyi hafıza fonksiyonunu sürdürmek için çok önemlidir. Düzenli beslenme, orta derecede egzersiz, yeterli uyku vb. gibi iyi yaşam alışkanlıklarını sürdürerek mitokondriyal matrisin sağlığının korunmasına yardımcı olabilirsiniz. Ek olarak, mitokondriyal matris içindeki biyokimyasal reaksiyonları ve sinyallemeyi teşvik etmek için uygun farmasötik müdahale yoluyla hafıza fonksiyonu da geliştirilebilir.

Günlük yaşamda hafızayı okuma, çalışma, düşünme, oyun vb. gibi birçok yolla çalıştırabiliriz. Aynı zamanda mitokondriyal matrisin sağlığını daha iyi korumak için sağlığımızı korumaya da dikkat etmeliyiz. Bu çabalar sayesinde kesinlikle daha iyi bir hafızaya sahip olacağımıza ve yaşam ve iş hayatındaki çeşitli zorluklarla daha iyi başa çıkacağımıza inanıyorum. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche Deserticola hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir, çünkü Cistanche Deserticola aynı zamanda asetilkolin ve büyüme faktörlerinin seviyelerini arttırmak gibi nörotransmitterlerin dengesini de düzenleyebilir. Bu maddeler hafıza ve öğrenme için çok önemlidir. Ek olarak, Cistanche Deserticola kan akışını iyileştirebilir ve oksijen dağıtımını destekleyebilir, bu da beynin yeterli besin ve enerji almasını sağlayarak beyin canlılığını ve dayanıklılığını artırır.

Belleği güçlendirmek için ekleri bil'e tıklayın

"Parçacıkları Analiz Et-Analiz Et" fonksiyonunu kullanarak boyutu 2 ila 20 um' (dairesellik 0.1-1.0) arasında değişen dsDNA puncta'yı seçtik. Gerekirse son sayım için orijinal görüntüler incelendi. Histon H2B'nin sinyali küçükse. daha sonra çıkarılan görüntüler çörek benzeri yapılar gösterdi.

Bunlar nükleer kökenli sitozolik dsDNA'yı temsil eder ve mitokondriyal kökenli sitozolik dsDNA miktarından çıkarılmalıdır. Boyut aralığı hücre tipine veya histolojik örneklerin kökenine göre değiştirilebilir. Şekil lE, ektopik mitokondriyal DNA sayımının bir örneğini göstermektedir

1B D kullanarak noktalar.

Alternatif olarak Hsp60 boyamasının görüntüleri dsDNA boyamasının görüntülerinden çıkarıldı. Daha sonra, dsDNA puncta sayısı "Eşik Ayarla "Parçacıkları Analiz Et-Analiz Et" fonksiyonları kullanılarak sayıldı. Daha sonra, histon-H2B sinyali olmayan dsDNA puncta doğrudan gözlem ile sayıldı. İkinci yöntem, histon-H2B görüntüleri kullanıldığında uygundur. düşük bir sinyal-gürültü oranı gösterir.

Toplamda, bu yöntem sitoplazmaya sızan ektopik mitokondriyal DNA'yı açıkça gösterebilir ve hücrelerdeki bu tür ektopik mitokondriyal DNA'nın objektif ve istatistiksel olarak değerlendirilmesine olanak tanır.

4. Tartışma

Çalışmamızda sitoplazmik mitokondriyal DNA'nın sayılmasını sağlayan bir yöntem geliştirdik. Sitoplazmik mitokondriyal DNA'nın saptanması immünofloresan teknikler kullanılarak rapor edilmiştir, ancak yöntemler çoğu durumda sitoplazmik mitokondriyal DNA'nın değerlendirilmesi için niceliksel değildir [15,25]. Başka bir çalışmada, dolaşımdaki mitokondriyal DNA'nın miktarını belirlemek için damlacık PCR uygulandı [9].

yakın zamanda Sato ve ark. [26,27], nükleer yapı belirteci olarak Lamin B1 (LMNB1) antikorlarını ve mitokondriyal yapı belirteci olarak sitokrom c oksidaz alt birimi 4'ü (COX4) kullanarak immünofloresan mikroskobu ile sitoplazmik DNA'yı değerlendirmek için mükemmel bir protokol yayınladı. Bu protokol, nükleer kökenli sitoplazmik dsDNA'nın miktarının belirlenmesi için çok yararlı görünmektedir.

Bununla birlikte, hem iç hem de dış belirteçler dahil olmak üzere COX4 veya diğer mitokondriyal membran belirteçlerini denediğimizde, sitoplazmayı mitokondriden kesin olarak ayırt etmek çok zordu.

Örneğin, bir mitokondriyal membran işaretçisi kullanarak dairesel sinyalleri gözlemlediysek ve dsDNA sinyallerini gözlemlediysek, o zaman bu dsDNA, dairesel mitokondri içindeki mitokondriyal DNA'yı (normal) veya çörek benzeri mitokondrinin dışındaki sitoplazmik mitokondriyal DNA'yı (ektopik) temsil edebilir. Bu nedenle Hsp60'ı sitoplazmadaki ektopik mitokondriyal DNA'yı değerlendirmek için mitokondriyal matrisi etiketleyen bir işaretleyici olarak kullandık.

Yakın tarihli bir incelemede açıklandığı gibi [23], nükleer kökenli sitoplazmik DNA'nın pek çok farklı türü vardır ve bunların çoğu histon belirteçleri açısından pozitiftir. Üçlü boyama için kullanılan antikor kombinasyonunun sınırlı olması nedeniyle histon H2Ba'yı bir histon işaretçisi olarak kullandık.

Ancak bu sınırlama çözülürse H2AX, nükleer kökenli sitoplazmik dsDNA için daha iyi bir belirteç olabilir. Histon-H2B-negatif sitoplazmik dsDNA, bu çalışmada kullanılan kontrol HeLa hücrelerinde nadiren gözlendi, ancak başka hücre çizgileri veya koşulları kullanılırsa nükleer kökenli bu tür dsDNA mevcut olabilir.

Son makalemizde kullanılan mitokondriyal DNA'nın yerinde hibridizasyonu niteliksel değerlendirme için uygundur, ancak niceliksel değerlendirme için yerinde hibridizasyondan yararlanmak zor olabilir [8].

Yerinde hibridizasyon, numuneyi yüksek sıcaklıklara maruz bırakır; bu da numunenin bazı kısımlarında deformasyona veya gürültüye neden olabilir. Öte yandan, bu yazıda sunulan immünositokimyasal yöntem, düşük arka plan gürültüsüne sahip sinyaller elde edebilmektedir. Son makalemizde, Parkinson hastalığı modeli olarak kullanılan insan hücrelerinde ve zebra balıklarında, mitokondriyal DNA'nın sitoplazmaya sızdığını ve bunun da hücre için toksik olduğunu gösterdik. hücreler. Ayrıca Parkinson hastalığı olan hastaların ölüm sonrası beyin dokularında sitozolik mitokondriyal DNA miktarının arttığını da gözlemledik [8].

Bu kanıtlar, mitokondriden sızan artan miktarda ektopik mitokondriyal DNA'nın, Parkinson hastalığı ve kalp yetmezliği dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara yol açan akut ve kronik inflamasyona neden olabileceğini; dolayısıyla sitozolik DNA bozulmasının yukarı regülasyonu veya sensörlerinin inhibisyonu, bu hastalıklar için potansiyel bir terapötik hedef olabilir [8,28].

Ektopik mitokondriyal DNA'nın nicel değerlendirmesi için bu yazıda tanıtılan yöntem, bu alanda daha ileri araştırmalar için önemli bir araç olarak hizmet vermektedir.

Yazar Katkıları: HM ve MTH hipotezleri formüle etti, deneylerin çoğunu tasarladı, deneyleri gerçekleştirdi, verileri analiz etti ve taslağı yazdı. NM kültürlenmiş hücrelerle ilgili deneyleri gerçekleştirdi. Tüm yazarlar makalenin yayınlanmış versiyonunu okudu ve kabul etti.

Finansman: Bu çalışma AMED (bağış numaraları JP21gm6110028 ve JP19dm0107154 (HM)), Takeda Bilim Vakfı (HM), JSPS KAKENHI (bağış numaraları JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) ve JP 17925674 (HM) bağışlarıyla desteklenmiştir. ), JST (Moonshot R&D; hibe numarasıJPMJMS2024 (HM)) ve TBRF'den Hibeler (hibe numarası TBRF-RF 21-135 (HM))).

Veri Kullanılabilirliği Beyanı: Bu yazıda açıklanan veriler ve araçlar istek üzerine sağlanır.

Teşekkür: Yararlı tartışmalara katıldığı ve sürekli destek sağladığı için Shinano Kobayashi'ye teşekkür ederiz. Tokyo Biyokimyasal Araştırma Vakfı'nın (TBRF), yabancı araştırmacılara MH'ye (TBRF-RF 21-135) TBRF doktora sonrası bursu sağladığı için teşekkür ederiz.

Çıkar Çatışmaları: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Referanslar

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Güneş, L.; Chen, ZJ Antiviral savunma ve immünadjuvan etkilerde cGAS-cGAMP sinyalinin önemli rolleri. Bilim 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; İkbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. Nükleer IFI16'nın herpesvirüs genomunun tanınmasıyla indüklenen asetilasyonu, sitoplazmik translokasyonu, inflamatuar ve IFN yanıtları için gereklidir. PLoS Patog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Orzallı, MH; Broekema, NM; Lokanta, BA; Hancks, DC; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, DM IFI16'nın cGAS aracılı stabilizasyonu, herpes simpleks virüsü enfeksiyonu sırasında doğuştan gelen sinyalleşmeyi destekler. Proc. Natl. Acad. Bilim. ABD 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavarone, AT; Hücre içi Listeria monocytogenes tarafından salgılanan Portnoy, DA c-di-AMP, konakçı tipi bir interferon tepkisini aktive eder. Bilim 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Şen, P.; Wangensteen, KJ; Simthy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; ve ark. Sitoplazmikkromatin yaşlanma ve kanserde inflamasyonu tetikler. Doğa 2017, 550, 402–406. [Çapraz Referans]

6. Takahashi, A.; Loo, T.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Miyata, K.; Berber, GN; ve diğerleri. Sitoplazmik DNazların aşağı regülasyonu, yaşlanan hücrelerde sitoplazmik DNA birikiminde ve SASP'de rol oynar. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Küçük.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.;Chin, HS; ve ark. BAK/BAX makroporları apoptoz sırasında mitokondriyal herniasyonu ve mtDNA akışını kolaylaştırır. Bilim 2018,359, eaao6047. [Çapraz Referans]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. Mitokondriyal kökenli sitosolik dsDNA, Parkinson hastalığının hücresel ve zebra balığı modellerinde sitotoksisiteye ve nörodejenerasyona neden olur. Nat. İletişim 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Güneş, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; ve ark. Parkin ve PINK1, STING'in neden olduğu inflamasyonu hafifletir. Doğa 2018, 561, 258–262. [Çapraz Referans]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Milletvekili Mattson; Croteau, DL; Bohr, VA NAD(+) takviyesi, Alzheimer hastalığının transgenik bir fare modelinde cGAS-STING yoluyla nöroinflamasyonu ve hücre yaşlanmasını azaltır. Proc. Natl.Acad. Bilim. ABD 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com