Epigenetik Düzenleyici BRD4, Sıçan Böbreğinde Kadmiyumla Tetiklenen Enflamatuar Tepkide Yer Almaktadır

daha fazla bilgi için:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong ve diğerleri

Cistanche tubulosa böbrek hastalığını önler, almak için buraya tıklayınürünler ve Cistanche DHT

ÖZ

Kadmiyum (Cd), potansiyel bir inflamatuar indükleyici olarak tanımlanırken, artan kanıtlar, uygunsuz inflamasyonun katkıda bulunan bir faktör olduğunu göstermektedir.böbrek hasarı. Bu nedenle, Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıt üzerine araştırmalar, Cd'nin neden olduğu nefrotoksisite mekanizmasını aydınlatmak için büyük önem taşımaktadır. Bromodomain içeren 4(BRD4) birçok inflamatuar hastalığın gelişiminde rol oynayan önemli bir epigenetik düzenleyicidir, ancak Cd ile tetiklenen düzenleyici rolleriiltihaplıyanıt açıklığa kavuşturulmaya devam ediyor. Burada, Sprague-Dawley sıçanlarında (2 mg/kg vücut ağırlığı, ip, 5 ardışık gün) ve sıçanlarda Cd ile tedavininböbrek hücresihattı (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) JQ1 (BRD4 inhibitörü, 25 mg/kg BW, ip) tarafından azaltılabilen inflamatuar sitokinlerin transkripsiyonunu indükledi , 3 ardışık gün in vivo; 0,5 uM, 12 saat in vitro) veya BRD4 küçük enterferans yapan RNA (siRNA, in vitro), BRD4'ün Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıta katıldığını gösterir. Daha sonra, çalışmamız Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıtta BRD4'ün rollerini netleştirdi. BRD4'ün inhibisyonu, in vivo ve in vitro olarak Cd ile teşvik edilen NF-κB nükleer translokasyonunu ve aktivasyonunu azalttı. Cd, RelA K310'un asetilasyon seviyesini arttırdı ve BRD4'ün inhibe edilmesiyle iptal edilen in vivo ve in vitro asetillenmiş NF-κB RelA'ya BRD4 bağlanmasını arttırdı. Özetle, çalışmamız, BRD4'ün, NF-κB sinyal yolunun aktivasyonuna aracılık ederek ve sıçanda asetillenmiş NF-κB RelA'ya bağlanmasını artırarak, inflamatuar sitokinlerin Cd ile tetiklenen transkripsiyonunda yer aldığını göstermektedir.böbrek,bu nedenle BRD4, Cd'nin neden olduğu böbrek hastalıkları için potansiyel bir terapötik hedef olabilir.

Anahtar Kelimeler: BRD4Kadmiyumböbrek iltihabısitokinler NF-KB JQ1

1. Giriş

Kadmiyum (Cd), yüksek toksisiteye ve uzun yarı ömre sahip bir ağır metal kirleticidir. Endüstriyel üretimin gelişmesiyle birlikte, Cd kirliliğinin çevre güvenliği ve insan sağlığına yönelik artan tehdidi endişe yaratmıştır (Wang ve diğerleri, 2020; Horiguchi ve Oguma, 2016). Cd vücut tarafından emildikten sonra çoklu organ hasarına neden olur veböbrekana hedef organdır (Fernando ve diğerleri, 2020; Zhao ve diğerleri, 2021). Daha önce, otofaji inhibisyonunun, oksidatif stresin ve apoptozun sıçanlarda Cd'nin neden olduğu nefrotoksisiteye sinerjistik olarak katkıda bulunduğunu sistematik olarak doğrulamıştık (Liu ve diğerleri, 2017; Wang ve diğerleri, 2017). Enflamasyon, enfeksiyon veya yaralanmaya karşı savunma tepkisi olarak hareket eden fizyolojik bir tepkidir, ancak Cd'nin neden olduğu kontrolsüz ve uygunsuz inflamatuar tepkiler, çevredeki normal dokuya zarar vermek ve otoimmün hastalıkları teşvik etmek gibi zararlara neden olabilir (Hossein-Khannazer ve diğerleri, 2020; Zhang ve diğerleri) al., 2020). Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıt, kardiyovasküler hastalıkları ve karaciğer hasarını şiddetlendirdi, bu da inflamasyonun Cd aracılı hastalıkta önemli roller oynayabileceğini düşündürdü.böbrekpatolojik süreçler (Fagerberg ve diğerleri, 2017; Almeer ve diğerleri, 2019).

Epigenetik, DNA dışı dizi değişikliklerine dayanan gen ekspresyonundaki kalıtsal modifikasyonları ifade eder ve bu modifikasyonların tersine çevrilebilirliği, yeni terapötik hedeflerin keşfedilmesini sağlar (Vendetti ve Rudin, 2013). Bromod alanı ve ekstra terminal alanı (BET) ailesi, iki bromod alanı ile karakterize edilen ve histonların ve histon olmayanların asetillenmiş lizinlerine bağlanan bromod alanı içeren 2 (BRD2), BRD3, BRD4 ve bromod alanı testise özgü (BRDT) içerir ( Lochrin ve diğerleri, 2014; Chatterjee ve Bohmann, 2018). BET proteinleri, birçok genin transkripsiyonel koaktivatörü olarak hareket eder, böylece çeşitli patolojik modellerde hücre döngüsü, inflamatuar yanıt, oksidatif stres ve diğer fizyolojik süreçleri düzenler (Jiao ve diğerleri, 2020; Wang ve diğerleri, 2019b). BRD4, BET protein ailesinin özellikle iyi çalışılmış bir üyesidir ve biriken araştırmalar, onu çeşitli proteinlerin düzenlenmesinde yeni bir epigenetik hedef olarak bildirmiştir.böbrek hastalıklarıkronik nefrit, diyabetik nefropati ve deneysel böbrek hasarı dahil (Zeng ve Zhou, 2002; Morgado-Pascual ve diğerleri, 2019). BRD4'ün birçok hastalıkta inflamatuar yanıtları düzenlemek için nükleer faktör-B (NF-κB) bağımlı transkripsiyon sürecine katıldığı doğrulanmıştır (Xu ve Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez ve diğerleri, 2017). BRD4, bromodomainleri aracılığıyla lizin 310'da (RelA-K310ac) asetillenmiş RelA (NF-κB alt birimi, bir protein kodlayan gen) tarafından işe alınabilir, böylece sikline bağımlı kinaz 9'u (CDK9) aktive eder ve RNA polimeraz II'yi fosforile eder. NF-KB hedef genlerinin transkripsiyonu (Hajmirza ve diğerleri, 2018). Son zamanlarda yapılan çalışmalar, BRD4 inhibitörlerinin inflamatuar hastalıklar için potansiyel bir terapötik seçenek olabileceğini düşündürmektedir. Sıçan omurilik yaralanma modellerinde, BRD4'ün inhibisyonu, enflamatuar yanıtı hafifletti ve mikroglia'nın fonksiyonel iyileşmesini destekledi (Dey ve diğerleri, 2019). Ayrıca, BRD4'ün inhibisyonu, tek taraflı üreter obstrüksiyonu, anti membran bazal GN ve Angiotensin II infüzyonunun murin modellerinde deneysel renal inflamasyonu ortadan kaldırdı (Suarez-Alvarez ve diğerleri, 2017).

Cd'nin potansiyel proinflamatuar etkileri ve BRD4'ün inflamasyon üzerindeki düzenleyici etkileri göz önüne alındığında, BRD4'ün Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıtta yer aldığını varsaydık. Beklendiği gibi, BRD4, Cd'ye maruz kalan sıçan böbrek modellerinde inflamatuar sitokinlerin transkripsiyon sürecine aracılık eder. Çalışmamız, Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıtta potansiyel bir mekanizma ortaya koymaktadır ve Cd'nin neden olduğu nefrotoksisite tedavisine yeni bakış açıları sağlamaktadır.

2. Malzemeler ve yöntemler

2.1. Kimyasallar ve antikorlar

Kadmiyum klorür (CdCl2, susuz, 439800), Sigma-Aldrich'ten (Carlsbad, CA, ABD) satın alındı. (artı )-JQ1 (HY-13030) MedChemExpress'ten (Monmouth Junction, NJ, ABD) elde edildi. Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü'nden (Shanghai, China, P0027) bir nükleer protein ekstraksiyon kiti satın alındı. Etkili bir kemilüminesans kiti (ECL, 32209) ve bisinkoninik asit protein tahlil reaktifi (BCA, 23225) Thermo Fisher Scientific'ten (Madison, WI, ABD) elde edildi. Aşağıdaki proteinlere karşı birincil antikorlar kullanıldı: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) şuradan satın alındı: Proteintech Grubu (Wuhan, Çin); -aktin (3700 s), Histon H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), normal tavşan IgG'si (IgG, 4394), Cell Signaling Technology'den (Danvers, MA, ABD) satın alındı; BRD4 (ab128874), K (lizin) asetiltransferaz 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (asetil K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488-konjuge eşek anti-tavşan (ab150073) satın alındı Abcam'dan (Cambridge, İngiltere). İkinci antikorlar: Goat Anti-Mouse IgG (H plus L) (115-035-003) ve Goat Anti-Rabbit IgG (H plus L) (111-035-003) Jackson ImmunoResearch'ten (West Grove, PA, ABD) satın alındı. ).

2.2. Hayvanlar ve deneyler

Yirmi dört Sprague-Dawley sıçanı (erkek, 6 haftalık, 110-120 g) Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd'den (Jinan, Shandong, Çin) satın alındı. Sıçanların çevre kontrollü bir odada (24 ± 5 ​​derece, 12 saat aydınlık/karanlık döngüsü) yiyecek ve suya serbest erişimleri sağlandı. Deney prosedürleri, hayvan deneyleri için Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 2010/63/EU'ya uygulanabilirdi ve tüm prosedürler Yangzhou Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Bir haftalık iklimlendirmeden sonra, sıçanlar rastgele dört gruba ayrıldı: (1) Kontrol grubu: karşılık gelen solvent (fizyolojik salin veya 2-hidroksipropil- -siklodekstrin solüsyonu) ile intraperitoneal olarak enjekte edildi. (2) Cd grubu: Cd intoksikasyon modelini oluşturmak için ardışık 5 gün boyunca intraperitoneal olarak CdCl2 (2 mg/kg vücut ağırlığı, fizyolojik salin içinde çözülmüştür) enjekte edildi. (3) Cd artı JQ1 grubu: Cd intoksikasyon modelini oluşturmak için art arda 5 gün boyunca intraperitoneal olarak CdCl2 (2 mg/kg vücut ağırlığı) enjekte edildi ve JQ1 (25 mg/kg vücut ağırlığı, 2-hidroksipropil{{ içinde çözüldü) 25}}siklodekstrin solüsyonu) 6-8. günlerde intraperitoneal olarak enjekte edildi. (4) JQ1 grubu: JQ1 (25 mg/kg vücut ağırlığı) 6-8. günlerde intraperitoneal olarak enjekte edildi. Sıçan serumları ve böbrek dokularındaki Cd içeriği istatistikleri, Cd'ye maruz kalan sıçan modellerinin başarılı bir şekilde oluşturulmasını yansıtan Tablo S1'de listelenmiştir.

8 günlük tedaviyi takiben, sıçanlar 12 saatlik açlıktan sonra derin anestezi altında servikal dislokasyon ile öldürüldü. Böbrek dokuları diseke edildi ve her böbreğin 1 g dokusu western blot ve kantitatif PCR (qPCR) analizinin ardından hızlı bir şekilde -80 ◦C'de saklandı. Kalan doku miktarı, immünohistokimyasal (IHC) boyama için yüzde 4 paraformaldehit (PFA) içinde hızla sabitlendi.

2.3. Hücre kültürü ve tedavisi

Sıçan böbrek hücre dizisi (NRK{{0}}E), Çin Bilimler Akademisi Şanghay Hücre Bankası'ndan elde edildi. NRK-52E hücreleri, yüzde 5 fetal sığır serumu (FBS, Gibco, 10437-028), penisilin ve streptomisin içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM, Gibco, 12800-017) ile kültürlendi (1 00 U/mL) 37 derecede yüzde 5 CO2 ve yüzde 95 havadan oluşan nemli bir durumda. CdCl2 (ultra saf suda çözülmüş) ve JQ1 (dimetil sülfoksit-çözülmüş) ayrı ayrı 4 derecede ve -20 derecede saklandı ve kullanımdan önce çalışma solüsyonlarına seyreltildi. Deney tasarımı aşağıdaki gibidir: (1) Sonraki deneyleri gerçekleştirmek için hücreler, 12 saat boyunca 0, 2.5, 5, 10 μM Cd veya 0, 6, 12, 24 saat süreyle 5 μM Cd ile işlendi. (2) Hücreler, sonraki deneyleri gerçekleştirmek için 12 saat boyunca 5 uM Cd ve/veya 0.5 uM JQ1 ile işlendi. (3) Hücreler siBRD4 ile transfekte edildi ve/veya sonraki deneyleri gerçekleştirmek için 12 saat daha 5 uM Cd ile işlendi.

2.4. Küçük enterferans yapan RNA transfeksiyonu

Ürün kılavuzlarına göre 24 saat boyunca Lipofectamine RNAiMAX transfeksiyon reaktifi (Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150) ile 20 nM BRD4 küçük enterferans yapan RNA'yı (siBRD4, Invitrogen, CA, ABD) NRK-52E hücrelerine transfekte ettik. Aşağıdaki duyu siRNA'ları kullanıldı:

siBRD4, 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′ hedef dizisi ile;

5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ hedef dizisi ile siCt (siRNA negatif kontrol).

2.5. Western blotlama

Böbrek dokusu örnekleri ve NRK-52E hücreleri, toplam proteini çıkarmak için proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponunda parçalandı. Nükleer protein önceden taze doku ve hücrelerden hazırlandı ve -80 derecede saklandı. Protein numuneleri (numune başına 20-30 ug) SDS-PAGE elektroforezi ile ayrıldı, ardından poliviniliden florür membranlarına aktarıldı (Millipore, ISEQ00010). Zarlar, 90 dakika boyunca yüzde 5 yağsız süt ile bloke edildi ve aşağıdaki birincil antikorlarla 12 saat 4 derecede inkübe edildi: -aktin (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Daha sonra membranlar TBST ile yıkandı ve karşılık gelen ikincil antikorlar (1:10000) ile 90 dakika oda sıcaklığında (RT) inkübe edildi. Zarlar elektrokemilüminesans (ECL, ThermoFisher Scientific) ile inkübe edildi ve Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Fransa) üzerinde belirlendi ve optik yoğunluk ImageJ (NIH, Bethesda, MD, ABD) kullanılarak analiz edildi.

2.6. İmmünofloresan (IF) boyama

Bir 24-kuyu plakasına ekilen NRK{{0}}E hücreleri, yaklaşık yüzde 60 izdihama kadar büyütüldü. Hücreler, 12 saat boyunca 5 uM Cd ve/veya 0,5 uM JQ1 ile işlendi, daha sonra PFA ile sabitlendi (yüzde 4, 10 dakika), Triton X- 100 ile geçirgenleştirildi (yüzde 0.1, 15 dakika), BSA ile bloke edildi Oda sıcaklığında (yüzde 2, 90 dakika) ve gece boyunca 4 derecede primer antikor (NF-KB p65, 1:50 seyreltme) ile inkübe edildi. Üç kez PBS ile yıkandıktan sonra hücreler sekonder antikor (1:500 seyreltme) ile 90 dakika ve DAPI ile 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi, ardından hücreler konfokal mikroskop altında gözlendi. NF-κB nükleer translokasyonu üç bağımsız çalışmada analiz edildi.

2.7. qPCR

Böbrek dokularının ve NRK-52E hücrelerinin toplam RNA'sı, RNAiso Plus kiti (Takara Bio, Shiga, Japonya) ile ekstre edildi. Üreticinin kılavuzuna göre (Roche, Basel, İsviçre) 1. zincir cDNA'yı sentezlemek için 1 ug toplam RNA kullanıldı. Bir LightCycler® 96 Real-Time PCR Sistemi (Roche) kullanılarak bağıl mRNA seviyelerini saptamak için oyuk başına 2 uL tamamlayıcı DNA (cDNA) alındı. 2-△△CT denklemine göre bağıl mRNA seviyelerini hesaplayın. Primerler Tablo S2'de listelenmiştir. -aktin bir sıçan referans geniydi.

2.8. Birlikte immünopresipitasyon (Co-IP)

Böbrek dokuları ve NRK-52E hücreleri, taze hazırlanmış hücre liziz tamponunda (20 mM HEPES–KOH pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, yüzde 1 Triton X) parçalandı{{8} }) PMSF içeren. Protein G boncukları (numune başına 100 μL, Bio-Rad, Hercules, CA, ABD), numune başına 2 ug BRD4, RelA-K310ac veya IgG antikoru ile karıştırıldı ve oda sıcaklığında 10 dakika döndürüldü. Daha sonra, toplam protein lizatları, gece boyunca 4 derecede boncuk-antikor kompleksi ile inkübe edildi. Hücre liziz tamponu ile üç kez yıkandıktan sonra immüno-çökeltiler, numuneleri yapılandırmak için 1 x SDS PAGE numune tamponu ile yeniden süspanse edildi. Hedef proteinler, anti-BRD4 ve anti-RelA K310ac primer antikorları ile western blot kullanılarak tespit edildi.

2.9. istatistiksel analiz

Tüm veriler en az üç bağımsız deneyden elde edildi ve aksi belirtilmedikçe ortalama ± SEM olarak ifade edildi. Deney grupları, SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ABD) kullanılarak eşleştirilmemiş iki kuyruklu Student t testi veya tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile karşılaştırıldı. Önem, p < 0.05="" olarak="">

3. Sonuçlar

3.1. Cd, in vivo ve in vitro olarak inflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu indükler

Çevresel bir kirletici olarak Cd'nin bir dizi biyolojik süreci düzenleyerek böbrek hasarına neden olduğu kanıtlanmıştır (Wang et al., 2019c). Bu çalışmada, inflamasyonun Cd ile indüklenen nefrotoksisiteye dahil olup olmadığını araştırmak için Cd maruziyetinden sonra inflamatuar sitokinlerin transkripsiyon seviyelerindeki değişiklikler incelendi. Veriler, Cd maruziyetinin, NRK-52E hücrelerinde (Şekil 1A-B) ve sıçan böbrek dokularında (Şekil 1C) interlökin (IL)-1 ve tümör nekroz faktörü (TNF)- protein seviyelerini önemli ölçüde arttırdığını göstermiştir. -D). Bu arada, Şekil 1E-F'de gösterildiği gibi, Cd maruziyeti inflamatuar sitokinlerin (IL-1 , IL-6, TNF- ve (Monosit kemoatraktan proteini-1) MCP) transkripsiyonel seviyelerini arttırdı. -1) in vivo ve in vitro. Bu bulgular, Cd'nin sıçan böbreklerinde inflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu indüklediğini göstermektedir.

3.2. BRD4, inflamatuar sitokinlerin Cd kaynaklı transkripsiyon sürecine katılır

BRD4, birçok hastalıkta iltihaplanma süreçlerini düzenlemek için asetillenmiş histonlara veya histon olmayanlara bağlanan yeni tanımlanmış bir epigenetik düzenleyicidir. Burada, BRD4 inhibitörü JQ1 ve BRD4-siRNA, BRD4'ün Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıt üzerindeki rolünü incelemek için kullanıldı. Veriler, Cd-yükseltilmiş IL-1 ve TNF-protein seviyelerinin, in vivo ve in vitro (Şekil 2A-D) JQ1 tedavisi ve in vitro BRD4 yıkımı ile (Şekil S1A-B) aşağı regüle edildiğini göstermiştir. Bu arada, JQ1 tedavisi, NRK-52E hücrelerinde IL-1, IL-6, TNF- ve MCP-1'nin Cd ile geliştirilmiş transkripsiyon seviyelerini önemli ölçüde inhibe etti (Şekil 2E) ve sıçan böbrek dokuları (Şekil 2F). Ayrıca, BRD4 yıkımı, NRK-52E hücrelerinde Cd-artmış inflamatuar sitokinlerin transkripsiyon seviyelerini önemli ölçüde azalttı (Şekil S1C). Toplu olarak, bu bulgular, BRD4'ün sıçan böbreklerinde Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıtın kritik bir düzenleyicisi olduğunu göstermektedir.

3.3. Cd maruziyetinden sonra BRD4 ekspresyon seviyeleri değişmeden kalır

Daha sonra, Cd maruziyetinden sonra BRD4'ün ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler tespit edildi. NRK-52E hücreleri, bir konsantrasyon gradyanı altında Cd ile tedavi edildi ve sıçanlara, Cd'nin böbrekte BRD4 ekspresyonu üzerindeki etkisini in vivo ve in vitro aydınlatmak için 5 gün boyunca intraperitoneal olarak Cd enjekte edildi. Sonuçlar, BRD4 protein seviyelerinin hem Cd'ye maruz kalan NRK-52E hücrelerinde (Şekil 3A-B) hem de sıçan böbrek dokularında (Şekil 3C-D) değişmediğini gösterdi. Ayrıca, Cd maruziyetinden sonra BRD4 mRNA seviyeleri değişmedi (Şekil 3E-F). Bu sonuçlar, BRD4'ün Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıta aracılık ettiğini gösterir, ekspresyon seviyesindeki değişikliklere bağlı değildir.

3.4. BRD4, Cd destekli NF-κB nükleer translokasyonunu düzenler

BRD4'ün Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıttaki rolleri çalışmamızda araştırıldı. NF-κB sinyal yolu değişikliği, inflamatuar sitokinlerin transkripsiyonu ile yakından ilişkilidir (Chi ve diğerleri, 2021). Çalışmamız, BRD4'ün Cd tarafından düzenlenen nükleer translokasyon ve NF-κB'nin aktivasyonunda yer aldığını buldu. İlk olarak, NF-κB'nin hücre altı lokalizasyonu, IF boyama ve IHC boyama ile belirlendi. Şekil 4A ve D'deki veriler, JQ1'in NRK-52E hücrelerinde ve sıçan böbrek dokularında Cd-destekli NF-KB nükleer translokasyonunu inhibe ettiğini gösterdi. Bu arada, western blot sonuçları, JQ1'in in vivo (Şekil 4B-C) ve in vitro (Şekil 4E-F) NF-κB'nin Cd-arttırılmış nükleer protein seviyelerini önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Benzer şekilde, BRD4 yıkımı, NRK-52E hücrelerinde Cd-destekli NF-KB nükleer translokasyonunu (Şekil S2A) ve NF-kB'nin Cd-arttırılmış nükleer protein seviyelerini (Şekil S2B-C) önemli ölçüde inhibe etti. Birlikte ele alındığında, BRD4'ün inhibisyonu, Cd'nin teşvik ettiği NF-KB nükleer translokasyonunu azaltabilir, bu da BRD4'ün Cd maruziyetinden sonra böbrekte NF-KB sinyal yolunun aktivasyonuna aracılık ettiğini gösterir.

3.5. Cd, RelA K310 asetilasyon seviyelerini arttırır

Çalışmalar, BRD4'ün NF-κB'ye bağlı transkripsiyonu düzenlemek için brom alanları aracılığıyla asetillenmiş RelA K310'a bağlandığını doğrulamıştır (Morgado-Pascual ve diğerleri, 2019; Zhong ve diğerleri, 2018). Böylece RelA K310'un asetilasyon seviyesi ve iki enzimin ekspresyonu tespit edildi. Veriler, artan Cd konsantrasyonu ile RelA-K310ac ve asetilaz Ep300 protein seviyelerinin sürekli olarak azaldığını, deasetilaz Sirt1 protein seviyesinin ise NRK-52E hücrelerinde (Şekil 5A-B) ve sıçan böbrek dokularında (Şekil 5A-B) kademeli olarak arttığını göstermiştir. .5C-D). Ayrıca Ep300 ve Sirt1 mRNA seviyeleri de aynı eğilimleri göstermiştir (Şekil 5E-F). Bu sonuçlar, Cd'nin RelA K310'un asetilasyon seviyesini desteklediğini, dolayısıyla BRD4'ün böbrekte Cd ile tetiklenen inflamatuar sitokin transkripsiyonunda yer alabileceğini göstermektedir.

3.6. Cd, transkripsiyonel işlevini geliştirmek için BRD4'ün RelA-K310ac'ye bağlanmasını arttırır

Asetilasyon bölgelerine bağlanma, BRD4'ün transkripsiyonel düzenlemesinin temelidir (Huang ve diğerleri, 2009). Cd'nin, BRD4'ün RelA-K310ac'ye bağlanmasını artırarak BRD4 işlevini düzenleyip düzenlemediğini doğrulamak için RelA-K310ac ve BRD4 arasındaki etkileşim, Co-IP aracılığıyla tespit edildi. Şekil 6A'daki veriler, Cd'nin NRK-52E hücrelerinde RelA-K310ac ve BRD4 arasındaki etkileşimi önemli ölçüde arttırdığını gösterdi, bu da JQ1 tedavisi veya BRD4 yıkımı ile hafifletildi. Aynı eğilim sıçan böbrek dokularında da gözlendi (Şekil 6B). Bu sonuçlar, Cd'nin, BRD4'ün NF-κB'ye bağlı transkripsiyonu teşvik eden ve ardından Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıta katkıda bulunan RelA-K310ac'ye bağlanmasını geliştirdiğini göstermektedir.

4. Tartışma

Cd'nin yüksek toksisitesi nedeniyle potansiyel bir inflamasyon tetikleyicisi olduğu bildirilmiştir, ancak kesin mekanizma hala tam olarak anlaşılmamıştır (Arab-Nozari ve diğerleri, 2020; Ghosh, 2018). Çalışmamız, Cd'nin sıçan böbrek hücrelerinde inflamatuar sitokin ekspresyonunu indüklediğini doğruladı ve inflamasyon dahil bir dizi hücresel süreçte kritik fonksiyonlara sahip epigenetik bir hedef olan BRD4'ün Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıta katkıda bulunduğunu buldu. Diğer deneyler, BRD4'ün Cd ile teşvik edilen NF-KB sinyal yolu aktivasyonunda yer aldığını gösterdi. Ayrıca, Cd, RelA K310'un asetilasyon seviyesini arttırdı, böylece NF-KB'ye bağlı inflamatuar sitokin transkripsiyonunu teşvik etmek için asetillenmiş NF-KB RelA'ya BRD4 bağlanmasını arttırdı.

Enflamasyon, ekzojen kimyasallara karşı doğal savunma mekanizmalarından biri iken, kontrolsüz ve uygun olmayan enflamatuvar yanıt normal dokulara zarar verebilir ve otoimmün hastalıkları indükleyebilir (Jian ve ark., 2018). Cd-artmış biyolojik inflamasyon belirteçleri genellikle çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Çalışmalar, Cd kaynaklı inflamasyonun aterogenezde rol oynadığını göstermiştir (Tinkov ve ark., 2018). Ayrıca, Cd, akciğer ve testis dokusu hasarına katkıda bulunan ve hepatotoksisiteyi indükleyen inflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu destekledi (Koopsamy Naidoo ve diğerleri, 2019; Arafa ve diğerleri, 2014). Bu zararlı etkiler, inflamatuar yanıtın Cd'nin neden olduğu böbrek hasarına dahil olduğu yönündeki sonuçlarımızla tutarlıdır. Artan araştırmalar, Cd kaynaklı inflamasyonun oluşum mekanizmalarına odaklanmıştır. İyi çalışılmış bir BET protein ailesi üyesi olarak BRD4, iltihaplanma dahil birçok biyolojik süreçte kritik bir rol oynar. Burada, BRD4'ün fonksiyonel aktivitesini deregüle etmek için JQ1 (BRD4'ün bir inhibitörü) ve siRNA kullanıldı ve BRD4'ün inhibisyonunun sıçan böbreklerinde Cd ile indüklenen inflamatuar sitokin transkripsiyonunu azalttığını buldu, bu da BRD4'ün Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıta katıldığını düşündürdü. . Genel olarak, BRD4 ekspresyonunun düzensizliğinin, inflamatuar yanıtın ortaya çıkmasında çok önemli bir olay olduğuna inanılmaktadır. Omurilik yaralanmasında, patolojik kalp hipertrofisinde ve diğer inflamasyonla ilişkili hastalıklarda, düzensiz BRD4 ekspresyonu, inflamatuar sitokinlerin ekspresyonuna katkıda bulunmuştur (Zhu ve diğerleri, 2020; Marazzi ve diğerleri, 2018; Ren ve diğerleri, 2019). Bununla birlikte, mevcut deneysel koşullar altında Cd, BRD4'ün ekspresyon seviyeleri üzerinde hiçbir etkiye sahip değildi; bu, BRD4'ün diğer yollar yoluyla Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıta aracılık edip etmediğini düşünmemize yol açtı.

NF-κB, inflamatuar süreçlerde önemli bir düzenleyici faktördür ve birçok inflamatuar aracının ekspresyonunu kontrol etmekten sorumludur (Lawrence, 2009). Çalışmalar, BRD4'ün NF-κB sinyal yolunun düzenlenmesinde yer aldığı bildirilmiştir. Huang et al. (2017), BRD4'ün IKK aracılı NF-κB aktivasyonunu p38 ve JNK–MAPK yolları aracılığıyla düzenlediğini öne sürdü. Wang et al. (2019a), BRD4 yıkımının veya JQ1 tedavisinin, mikrogliada lipopolisakarit (LPS) ile aktive olan NF-κB sinyal yolunu bloke ettiğini buldu. Meng et al. (2014), JQ1 tedavisinin, LPS ile tedavi edilen RAW 264.7 hücrelerinde NF-KB'nin aktivasyonunu inhibe ederek inflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu bloke ettiğini göstermiştir. Bu raporlar, BRD4'ün birçok enflamasyon modelinde NF-κB'nin aktivasyonuna aracılık ettiğini ve BRD4'ün inhibe edilmesinin anti-inflamasyon için etkili bir terapötik yaklaşım olduğunu göstermiştir. Mevcut çalışmada, BRD4'ün inhibisyonu, Cd'ye maruz kalan sıçan böbrek dokularında ve NRK-52E hücrelerinde NF-KB'nin nükleer translokasyonunu bloke etti, bu da BRD4'ün Cd ile aktive olan NF-κB sinyal yoluna aracılık ettiğini düşündürdü.

Tipik olarak, NF-κB çeşitli uyaranlar tarafından aktive edildikten ve çekirdeğe yer değiştirdikten sonra, BRD4, K310 bölgesinde asetillenmiş NF-κB RelA'ya bağlanır ve bu, çekirdekteki stabilitesini ve transkripsiyonel aktivitesini arttırır (Hajmirza ve diğerleri, 2018). Böylece RelA K310'un asetilasyon seviyesi, BRD4'ün inflamatuar yanıt üzerindeki düzenleyici işlevini etkiler. Hipokampal nöronlarda, deasetilaz Sirt1, nöronal amiloid üretimine katkıda bulunan BACE1 ekspresyonunu düzenlemek için RelA K310 deasetilasyonuna aracılık etti (Flores-Leon ve diğerleri, 2019). Glioblastoma hücrelerinde, fotodinamik terapi stresi deasetilaz Sirt1'i aşağı regüle etti ve asetilaz Ep300'ü aktive etti, bu da RelA-K310ac seviyelerini arttırdı ve hayatta kalma yanlısı nitrik oksit üretiminin artmasına neden oldu (Fahey ve diğerleri, 2019). Çalışmamız, Cd'nin Ep300 ifadesini artırarak ve Sirt1 ifadesini azaltarak RelA K310'un asetilasyon seviyesini desteklediğini, bu da Cd'nin RelA K310'un asetilasyon seviyelerini artırarak düzenleyici fonksiyon BRD4'ü etkilediğini gösterdi.

Özellikle, sonuçlarımız JQ1 tedavisinin Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıtı hafifletmede BRD4 yıkımından daha etkili olduğunu gösterdi. JQ1, BRD4 ile yüksek bir bağlanma afinitesine sahiptir ve BRD4'ün kromozoma bağlanmasını neredeyse tamamen bloke edebilirken, siBRD4, BRD4'ün hedef bölgeye bağlanmasını azaltmak için yalnızca BRD4 protein ekspresyonuna müdahale edebilir, bu da BRD4'ün Cd ile tetiklenen inflamatuar yanıta aracılık ettiğini düşündürür. asetillenmiş NF-KB RelA ile bağlanma. Son çalışmalar benzer bir düzenleyici mekanizma göstermiştir: NF-κB nükleer translokasyonu ve aktivasyonundan sonra, BRD4, daha sonra NF-KB'nin transkripsiyonel aktivasyonunu birlikte aktive etmek için asetillenmiş RelA ile etkileşime girdi (Huang ve diğerleri, 2009). RelA-BRD4, çeşitli inflamatuar stimülasyon koşullarında NF-κB hedef promotörlerine alındı, JQ1 tedavisi, BRD4'ün asetillenmiş NF-κB RelA'ya bağlanmasını önleyerek hareket etti ve böylece NF-κB'nin transkripsiyonel aktivitesini azalttı (Zou ve diğerleri, 2014). Sonuçlarımız, BRD4'ün inhibisyonunun, sıçan böbreklerinde BRD4 ve RelA-K310ac arasındaki Cd ile güçlendirilmiş etkileşimi bloke ettiğini, BRD4'ün inhibe edilmesinin, NF-κB'nin Cd kaynaklı transkripsiyonel aktivitesini baskıladığını gösteren yukarıdaki sonuçlarımızı desteklediğini gösterdi; NF-κB RelA, inflamatuar sitokinlerin transkripsiyonunu arttırır.

Özetle, çalışmamız sıçan böbreklerinde Cd ile tetiklenen enflamatuar yanıtta BRD4'ün düzenleyici mekanizmalarını ortaya çıkardı: (1) BRD4, Cd ile indüklenen NF-KB nükleer translokasyonuna ve aktivasyonuna aracılık eder. (2) Cd, RelA K310 asetilasyon seviyelerini arttırır ve NF-KB'ye bağlı inflamatuar sitokin transkripsiyonunu destekleyen asetillenmiş NF-κB RelA'ya BRD4 bağlanmasını arttırır. Ek olarak, BRD4'ün inhibisyonu, Cd'nin yükseldiği enflamatuar sitokin seviyelerini önemli ölçüde hafifletti, bu da hedeflenen BRD4'ün, Cd'nin neden olduğu nefrit dahil olmak üzere enflamatuar hastalıkların tedavisinde etkili bir araç olarak geliştirilme potansiyeline sahip olduğunu ortaya koydu.

CRediT yazarlık katkı beyanı

Zhongguo Gong: Kavramsallaştırma, Metodoloji, Görselleştirme, Resmi analiz, Doğrulama, Soruşturma, Resmi analiz, Veri iyileştirme, Yazma – orijinal taslak. Gang Liu: Kavramsallaştırma, Metodoloji, Görselleştirme, Veri küratörlüğü, Yazma – orijinal taslak, Proje yönetimi, Finansman temini. Wenjing Liu: Yazılım, Kaynaklar, Metodoloji, Resmi analiz. Hui Zou: Proje yönetimi, Denetim. Ruilong Song: Yazılım, Biçimsel analiz, Denetim. Hongyan Zhao: Yazılım, Resmi analiz, Denetim. Yan Yuan: Denetim. Jianhong Gu: Denetim. Jianchun Bian: Finansman alımı, Denetim. Jiaqiao Zhu: Yazma – inceleme ve düzenleme, Denetim. Zongping Liu: Yazma – inceleme ve düzenleme, Denetim,

Proje yönetimi, Finansman temini, Kavramsallaştırma.

Rakip Çıkar Beyanı

Yazarlar, bu makalede rapor edilen çalışmayı etkileyebilecek görünen hiçbir rekabet halindeki finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.

Teşekkür

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Nos. 31872533, 31902329, 32072933), Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (No. 2016YFD0501208) ve Jiangsu Yüksek Öğrenim Öncelikli Akademik Program Geliştirme projesi tarafından desteklenmiştir. Kurum (PADP). El yazması, uygun İngilizce dili, dil bilgisi, noktalama işaretleri, imla ve genel stil için ELIXIGEN'deki yüksek nitelikli anadili İngilizce konuşan editörlerden biri veya daha fazlası tarafından düzenlendi.

Referanslar

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Arı sütü, erkek farelerde kadmiyum kaynaklı nefrotoksisiteyi azaltır. bilim 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Toksik olmayan kadmiyum ve florür seviyelerine birlikte maruz kalma, sıçanlarda hepatotoksisiteye neden olur. mitokondriyal oksidatif hasarı, apoptozu ve NF-kB yollarını tetikler. Çevre. bilim Kirlilik. Araş. Int. 27 (19), 24048-24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Çemen otu tohumu tozu, erkek sıçanlarda kadmiyum kaynaklı testis hasarını ve hepatotoksisiteyi azaltır. Tecrübe. Toksikol. Patol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. Nrf2 üzerine BET-ting: Nrf2 sinyalinin BET protein inhibitörlerinin terapötik aktivitelerini nasıl etkileyebileceği. Biyodenemeler 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Selenyum tarafından indüklenen reaktif oksijen türüne bağlı nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunda selenoprotein S'nin rolleri- yetersiz arterit. Redoks Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A.,Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4, hematopoietik kök hücre gelişimini yönlendirir ve makrofaj inflamatuar yanıtlarını modüle eder. 38 (7)

Fagerberg, B., Doğdu, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Kadmiyum maruziyeti çözünür ürokinaz plazminojen aktivatör reseptörü ile ilişkilidir, dolaşımdaki bir inflamasyon belirteci ve gelecekteki kardiyovasküler hastalık. Çevre. Araş. 152, 185-191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Akış yukarı sinyal olayları, fotodinamik olarak zorlanan glioblastoma hücrelerinde hayatta kalma yanlısı nitrik oksit üretiminin artmasına neden olur. Ücretsiz Radic. Biol. Med. 137, 37-45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Oryza sativa L.'de Sri Lanka'da etiyolojisi bilinmeyen kronik böbrek hastalığı ile ilgili farklı metabolitlerin ve ağır metallerin varyasyonu. Kemosfer 247, 125836.

Flores-Leon,M.,Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Palmitik asit kaynaklı NAD( artı ) tükenmesi, SIRT1'in azaltılmış işlevi ve BACE1'in artan ifadesi ile ilişkilidir. hipokampal nöronlarda. Nörokimya. Araş. 44 (7), 1745-1754.

Ghosh, KNI, 2018. Kadmiyum tedavisi, albino Wistar sıçanlarının kalp dokusunda ekinokokoz, DNA hasarı, iltihaplanma ve apoptoza neden olur. Çevre. Toksikol. Farmakol. 59, 43-52. inflamasyon ve kanser. Biyotıplar 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Kadmiyuma akut maruz kalma, farelerin karaciğerlerinde gecikmiş granülosit koloni uyarıcı faktör indüksiyonu ile birlikte uzun süreli nötrofiliye neden olur. Kemer Toksikol. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F.,Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Kadmiyum maruziyetinin inflamasyonun indüklenmesindeki etkileri. İmmünofarmakol. İmmünotoksikol. 42 (1), 1–8.