Oral Hipoksi ile indüklenebilir Faktör Prolil Hidroksilaz İnhibitörü Enarodustat, Diyabetik Böbrek Hastalığının Erken Aşamalarında Renal Enerji Metabolizmasındaki Değişikliklere Karşı Direnir

İletişim: emily.li@wecistanche.com

giriiş

Nefroloji ve Endokrinoloji Anabilim Dalı, Tokyo Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tokyo, Japonya; Genç Bilim Adamları için Araştırma Bursu, Japonya Bilimi Teşvik Derneği, Tokyo, Japonya; Biyolojik ve Farmakolojik Araştırma Laboratuvarları,

Merkez Farmasötik Araştırma Enstitüsü, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Japonya; Sistem Farmakolojisi Anabilim Dalı, Tokyo Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tokyo, Japonya; Sentetik Biyoloji Laboratuvarı, RIKEN Biyosistem Dinamiği Araştırma Merkezi, Suita, Japonya; ve WPI International Research Center for Neurointelligence, The University of Tokyo Institutes for Advanced Study (UTIAS), The University of Tokyo, Tokyo, Japan.

HIF stabilizatörleri olarak da bilinen hipoksi ile indüklenebilir faktör (HIF) prolil hidroksilaz inhibitörleri, endojen eritropoietin üretimini arttırır ve anemiye karşı yeni terapötik ajanlar olarak hizmet eder.kronikböbrekhastalık. HIF, hipoksiye adaptif bir yanıt olarak enerji metabolizması ile ilgili çeşitli genlerin ekspresyonunu indükler. Bununla birlikte, HIF stabilizasyonu ile metabolik yeniden programlanan iç dokunun patofizyolojiyi nasıl etkilediği belirsizliğini koruyor.böbrek hastalıklar. Önceki çalışmalar, hiperglisemi ve dislipidemi gibi sistemik metabolik bozuklukların, böbrek metabolizmasında değişikliklere neden olduğunu ve diyabetik böbrek hastalığı da dahil olmak üzere böbrek fonksiyon bozukluğuna yol açtığını göstermektedir. Burada, bir oral HIF stabilizatörü olan enarodustat'ın (JTZ-951), diyabetik böbrek hastalığının erken evrelerinde renal enerji metabolizması üzerindeki etkilerini, streptozotosin ile indüklenen diyabetik sıçanlar ve alloksan ile indüklenen diyabetik fareler kullanarak analiz ediyoruz. Transkriptom analizi, enarodustat'ın diyabetik böbrek metabolizmasındaki değişiklikleri önlediğini ortaya koydu. Transkriptom analizi, diyabetik böbrek dokusunda yağ asidi ve amino asit metabolizmalarının yukarı regüle edildiğini ve enarodustat tarafından aşağı regüle edildiğini, buna karşın glukoz metabolizmasının yukarı regüle edildiğini gösterdi. Bu simetrik değişiklikler metabolom analizi ile doğrulandı. Diyabetik hayvanların böbrek dokusunda glikoliz ve trikarboksilik asit döngüsü metabolitleri birikir ve amino asitler azalırken, bu metabolik bozukluklar enarodustat ile hafifletildi. Ayrıca, enarodustat, diyabetik hayvanların böbrek dokusunda glutatyon-glutatyon disülfid oranını arttırdı ve oksidatif stresi hafifletti. Böylece, HIF stabilizasyonu, başlangıç ​​döneminde meydana gelen renal enerji metabolizmasındaki değişiklikleri etkisiz hale getirir.şeker hastasıböbrekhastalık.

Cistanche Böbrek fonksiyonu için çok iyidir

Çeviri Bildirimi

Hipoksi ile indüklenebilir faktör (HIF) prolil hidroksilaz inhibitörleri (HIF stabilizatörleri olarak da bilinir) endojen eritropoietin üretimini arttırır ve anemiye karşı yeni terapötik ajanlar olarak hizmet eder.kronikböbrekhastalık. Sıçan ve fare diyabetik modellerinde böbrek dokusuna ilişkin transkriptom ve metabolom analizlerimiz, bir oral HIF stabilizatörü olan enarodustat'ın (JTZ-951), diyabetik böbrek hastalığının erken evrelerinde renal enerji metabolizması değişikliklerini etkisiz hale getirdiğini ortaya koymuştur. Sonuçlar, HIF stabilizatörlerinin renal enerji metabolizması üzerindeki etkilerinin klinik ortamlarda ekstrapolasyonu için önemli veriler sağlar, ancak HIF stabilizatörleri tarafından bu renal metabolizmanın yeniden programlanmasının böbreklerin ilerlemesini nasıl etkilediğini açıklığa kavuşturmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.şeker hastasıböbrekhastalık.

Giriş

Hipoksi ile indüklenebilir faktör (HIF) prolil hidroksilaz inhibitörleri, endojen eritropoietin üretimini arttırır ve kronik hastalarda anemiye karşı yeni terapötik ajanlar olarak hizmet eder.böbrekhastalık. Hücreler hipoksiye karşı bir savunma mekanizmasına sahiptir ve HIF bu savunmanın ana düzenleyicisidir. Böbrekler fizyolojik olarak hipoksiye maruz kalır ve kronik hipoksi, son dönem böbrek hastalığına yol açan son ortak yol olarak kabul edilir. HIF'nin hipoksi yanıtları ile ilgili çeşitli genlerin ekspresyonunu indüklediği göz önüne alındığında, HIF stabilizatörlerinin progresyon üzerinde pleiotropik etkileri olabilir.böbrekhastalıklarkronik anemide iyileşmenin yanı sıraböbrekhastalık. İlginç bir şekilde, HIF, mitokondriyal trikarboksilik asit (TCA) döngüsünü beslemek için piruvat kullanmasını engelleyen piruvat dehidrojenazın glikolitik genlerin ve piruvat dehidrojenaz kinazın ekspresyonunu indükler.6,7 TCA döngüsünden glikolize doğru bu metabolik yeniden programlama oksijen tüketimini bastırır ve kritiktir hipoksik ortamlara maruz kalan hücrelerin adaptasyonu için. Bununla birlikte, HIF stabilizasyonu ile böbrek dokusunun metabolik yeniden programlanmasının böbrek hastalığının patofizyolojisini nasıl etkilediği belirsizliğini koruyor.böbrek hastalıklar. Diyabetik böbrek hastalığı (DKD), son dönem böbrek hastalığının başlıca nedenidir. Hiperglisemi ve dislipidemi gibi sistemik metabolik bozukluklar böbrek metabolizması değişikliklerine neden olarak DKD dahil böbrek fonksiyon bozukluğuna yol açar. Önceki çalışmalar, diyabetik renal kortikal dokuda, mitokondriyal disfonksiyon ve DKD progresyonu ile ilişkili olabilecek artan metabolik akış ve glukoz ve TCA döngüsü metabolitlerinin birikimini göstermiştir. HIF stabilizatörlerinin, hipoksiye adaptif bir yanıt olarak HIF'nin oksijen tüketimini bastırmak için hücrelerdeki metabolik akışı azalttığını göz önünde bulundurarak, diyabetik renal kortikal dokudaki metabolizma değişikliklerini tersine çevirebileceğini varsaydık. Bu nedenle, transkriptom ve metabolom analizlerini kullanarak, bir oral HIF stabilizatörü olan enarodustat'ın (JTZ-951), DKD'nin erken evrelerinde meydana gelen renal metabolizma değişikliklerini nasıl etkilediğini kapsamlı bir şekilde anlamak için bir kavram kanıtı çalışması gerçekleştirdik.

SONUÇLAR: Enarodustat, renal proksimal tübül hücrelerinde TCA döngüsünden glikolize kadar metabolik yeniden programlamayı indükler

Renal korteks esas olarak proksimal tübüllerden oluştuğundan, önce enarodustat'ın renal proksimal tübül hücrelerinin metabolik akışı üzerindeki etkilerini in vitro olarak inceledik. İlk olarak, bir insan proksimal tübül epitel hücre dizisi olan kültürlenmiş HK-2 hücrelerinde Mito Stres Testi (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) ve Glikolitik Hız Testi (Agilent) yapıldı (Şekil 1a). Enarodustat, mitokondriyal solunumu (TCA döngüsü) önemli ölçüde azalttı ve bazal glikolizi artırdı, bu da TCA döngüsünden glikolize metabolik yeniden programlamayı gösterir (Şekil 1; Ek Şekil S1). Ayrıca HIF-1 için küçük enterferans yapan RNA (siRNA) kullanarak bir deney yaptık (Şekil 2; Ek Şekil S2). siRNA tarafından HIF-1 yıkımı, enarodustat tarafından indüklenen metabolik değişiklikleri (bazal solunum, maksimum solunum, yedek solunum kapasitesi ve adenosin trifosfat [ATP] üretimi) tersine çevirdi, bu da metabolik yeniden programlamanın esas olarak HIF yoluyla olduğunu gösterdi-1 stabilizasyon (Şekil 2; Ek Şekil S2). Hücrelerin TCA döngüsünü beslemek için piruvat kullanması için önemli bir faktör olan piruvat dehidrojenaz aktivitesi, daha önce yayınlanmış gözlemlerle uyumlu olan enarodustat (Şekil 2f) tarafından da azaltıldı.

Streptozotosin ile indüklenen diyabetik sıçanların arka plan verileri

İn vitro deneylerin sonuçlarından, HIF stabilizatörlerinin, TCA döngüsünden glikolize metabolik yeniden programlama yoluyla diyabetik renal kortikal dokudaki metabolizma değişikliklerini hafifletebileceğini varsaydık. İlk önce, yukarıda bahsedilen hipotezi test etmek için kavram kanıtı deneyi için model olarak streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik sıçanları seçtik. Bu modelde diyabet hızla indüklenir ve diyabet ve HIF stabilizatörlerinin böbrek dokusundaki enerji metabolizması üzerindeki net etkilerini kısa bir süre içinde gözlemlememizi sağlar. Çalışma protokolü ve STZ ile indüklenen diyabetik sıçanlardaki deneylerden elde edilen temel veriler Şekil 3a'da gösterilmektedir. Sıçanları 3 gruba ayırdık: grup A (sham), grup B (DKD) ve grup C (DKD + enarodustat). 14. günde kan plazma glukozu, glikosile edilmiş hemoglobin HbA1c, trigliserit ve toplam kolesterol seviyeleri diyabetik gruplarda A grubuna kıyasla önemli ölçüde artarken, B ve C grupları arasında anlamlı bir fark yoktu (Şekil 3d–g). Gruplar arasında plazma kreatinin seviyeleri farklı olmasa da, grup A ile karşılaştırıldığında grup B'de idrar albümin atılımı önemli ölçüde artmış ve glomerülomegali belirgindi ve enarodustat bu değişiklikleri tersine çevirme eğilimindeydi (Şekil 4). Kan üre nitrojen seviyeleri diyabetik gruplarda daha yüksekti ve diyabete bağlı dehidrasyonu yansıtıyordu. Özetle, çalışmamızdaki STZ ile tedavi edilen sıçanların böbrekleri DKD'nin erken evrelerini temsil etmektedir. Bu sıçanların renal kortikal dokusu kullanılarak transkriptom ve metabolom analizleri yapıldı.

Renal kortikal dokunun transkriptom analizi

Renal kortikal dokunun transkriptome analizinin sonuçları Şekil 5 ve 6'da gösterilmiştir. Temel bileşen analizi ve hiyerarşik kümeleme analizi, A, B ve C gruplarının sırasıyla farklı kümelere ayrıldığını göstermiştir (Şekil 5a ve b). Diferansiyel olarak eksprese edilen genler, │log2 kat değişimi (FC) │ 0.5'e eşit veya büyüktür ve Q değeri < 0.05="" ile="" seçildi.="" gen="" ontolojisi="" ve="" kanonik="" yol="" analizleri,="" yağ="" asidi="" metabolizması="" ile="" ilgili="" genlerin="" grup="" a'ya="" kıyasla="" b="" grubunda="" yukarı="" doğru="" düzenlendiğini="" ortaya="" koydu.="" buna="" karşılık,="" hif-1="" ağı="" dahil="" olmak="" üzere="" glikoz="" metabolizması="" ve="" hipoksi="" tepkisi="" ile="" ilgili="" genler,="" grup="" c'de="" karşılaştırıldığında="" grup="" c'de="" yukarı="" doğru="" düzenlendi.="" b="" grubu="" ile="" (şekil="" 5c="" ve="" d).="" ayrıca="" transkriptomik="" verileri="" kullanarak="" gen="" seti="" zenginleştirme="" analizi="" (gsea)="" gerçekleştirdik="" (şekil="" 6,="" tablo="" 1="" ve="" 2).="" yağ="" asidi="" ve="" amino="" asit="" metabolizmasının="" gen="" setleri,="" grup="" a'ya="" kıyasla="" grup="" b'de="" yukarı="" doğru="" düzenlenmiştir="" (şekil="" 6).="" buna="" karşılık,="" bu="" gen="" setleri,="" grup="" b'ye="" kıyasla="" grup="" c'de="" aşağı="" regüle="" edildi="" ve="" glukoz="" metabolizmasının="" gen="" setleri="" yukarı="" regüle="" edildi,="" bu="" da="" enarodustat'ın="" diyabetin="" neden="" olduğu="" metabolizma="" değişikliklerini="" tersine="" çevirdiğini="" gösterdi="" (şekil="" 6).="" ayrıca,="" tca="" döngüsünün="" gen="" setleri,="" in="" vitro="" çalışmamızda="" gözlemlenen="" proksimal="" tübüllerde="" enarodustat="" kaynaklı="" metabolik="" yeniden="" programlama="" kavramıyla="" uyumlu="" olan="" grup="" b'ye="" (tablo="" 2)="" kıyasla="" grup="" c'de="" aşağı="" regüle="" edildi.="" özetle,="" enarodustat,="" transkriptomik="" bakış="" açılarından="" diyabetik="" renal="" metabolizma="" değişikliklerini="">

Renal kortikal dokunun metabolom analizi

Her gruptan rastgele seçilen sıçanların renal kortikal dokusunda (her grup için n =4) 116 enerji ile ilgili metabolitin mutlak konsantrasyonlarını ölçtük (Ek Tablo S1; Ek Şekil S3). Sınıf ayrımının önemini değerlendirmek için kısmi en küçük kareler ayrım analizi (PLS-DA) yapıldı (Şekil 7). PLS-DA değişken önemi projeksiyon (VIP) puanı 1 olan metabolitleri kullanarak metabolit seti zenginleştirme analizi (MSEA) yaptık. Glisin, serin, metionin, aspartat, glutamat, arginin, prolin gibi amino asitlerin metabolizmasındaki farklılıklar, A ve B grupları arasında ve b-alanin not edildi. B ve C grupları arasında amino asit metabolizmasındaki farklılıklar da gözlendi. Ayrıca, glikoliz ve glukoneogenez gibi glikoz metabolizması süreçleri, B ve C grupları arasında farklı eğilimler gösterdi (Şekil 7).

Enerji metabolik yol haritasında transkriptom ve metabolom verilerinin görselleştirilmesi

Enerji metabolizması değişikliklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması için transkriptom ve metabolom verilerini görselleştirdik (Şekil 8). Glikoliz ve TCA döngüsü metabolitlerinin, DKD'de aşırı glikoz girişi ve yağ asidi metabolizmasının düzenlenmesi nedeniyle grup A'ya kıyasla grup B'de biriktiği bulundu. Amino asit metabolizmasının yukarı regülasyonunu yansıtacak şekilde, grup A'ya kıyasla grup B'de amino asit konsantrasyonu azalmıştır (Şekil 8a). Tersine, glikoliz metabolitlerinin birikimi, kolaylaştırılmış glikoliz akışı nedeniyle enarodustat tarafından hafifletildi. Enarodustat ayrıca TCA döngüsü metabolitlerinde ve amino asitlerde diyabetin neden olduğu değişiklikleri tersine çevirdi (Şekil 8b). Ayrıca, enarodustat diyabetik böbrek dokusunda glutatyon disülfid (GSSG) birikimini hafifletti ve böylece daha yüksek bir glutatyon/GSSG oranı gösterdi, bu da enarodustat'ın DKD'de oksidatif stresi azalttığını düşündürdü (Şekil 8a ve b). Oksidatif stresteki azalma, renal kortikal dokudaki lipit peroksidasyon belirteci malondialdehit seviyeleri ile doğrulandı: enarodustat, diyabetik renal kortikal dokuda malondialdehit birikimini tersine çevirdi (Ek Şekil S4). Özetle, transkriptom ve metabolom verilerinin entegrasyonu, enarodustat'ın DKD'nin erken evrelerinde meydana gelen renal enerji metabolizması değişikliklerine karşı koyduğunu göstermiştir.

Simetrik metabolizma değişiklikleri (diyabet vs. enarodustat) alternatif bir modelde doğrulanmıştır

Sıçan modelindeki bulgularımızı doğrulamak için başka bir diyabet hayvan modeli olan alloksan kaynaklı diyabetik farelerde transkriptom analizi yaptık. Fare modeli için çalışma protokolleri ve arka plan verileri Şekil 9'da gösterilmektedir. İdrar albümin atılımı, enarodustat tarafından tersine çevrilen grup A'ya kıyasla grup B'de önemli ölçüde arttı (Şekil 9d). Ek olarak, böbrekteki glomerülleri görselleştirmek için kapsamlı 3-boyutsal analiz (Net, Engelsiz Beyin/ Vücut Görüntüleme Kokteylleri ve Hesaplamalı analiz [KÜBİK]–böbrek)16 uyguladık. Enarodustat tarafından tersine çevrilen grup A ile karşılaştırıldığında B grubunda glomerülomegali farkedilirdi (Şekil 9e). Alloxan ile indüklenen diyabetik farelerde böbrek dokusunun transkriptom analizi, STZ ile indüklenen diyabetik sıçan modelinde olduğu gibi simetrik metabolizma değişiklikleri (diyabet ve enarodustat) gösterdi (Şekil 10): yağ asidi metabolizması diyabet tarafından yukarı regüle edildi, oysa glikoz metabolizma enarodustat tarafından yukarı regüle edildi. Ayrıca, amino asit metabolizması diyabet tarafından yukarı regüle edildi ve enarodustat tarafından aşağı regüle edildi. Böylece, enarodustat, alloksan ile indüklenen diyabetik fare modelinde ve ayrıca STZ ile indüklenen diyabetik sıçan modelinde DKD'nin erken evrelerinde meydana gelen renal enerji metabolizması değişikliklerini etkisiz hale getirdi.

TARTIŞMA

Bu çalışmada, bir oral HIF stabilizatörü olan enarodustat'ın (JTZ-951), sıçan ve fare diyabet modellerinde DKD'nin erken evrelerinde meydana gelen renal enerji metabolizması değişikliklerini önlediğini gösterdik. Transkriptom ve metabolom analizleri, böbrek dokusunda simetrik metabolizma değişiklikleri göstermiştir (diyabet ve enarodustat): DKD'de yağ asidi ve amino asit metabolizmaları yukarı doğru düzenlenirken, enarodustat bu yolları aşağı regüle etti ve ek olarak glikoz metabolizmasını yukarı regüle etti (Şekil 5-10).

HIF stabilizasyonunun DKD patofizyolojisi üzerinde koruyucu etkilerinin olup olmadığı tam olarak aydınlatılamamıştır. Önceki çalışmalar, diyabetik böbrek dokusunun hipoksiye17 maruz kaldığını ve diyabetik böbrek dokusunda HIF ekspresyonunun, kısmen oksidatif stresin neden olduğu hipoksik koşullarına yanıt vermede yetersiz olduğunu göstermiştir.18 Kobalt klorür ile HIF stabilizasyonu, oksidatif stres durumunu iyileştirmiş ve proteinüriyi azaltmıştır ve STZ ile indüklenen DKD'de tubulointerstisyel hasar.19 Hayvan çalışması sonuçları ayrıca, HIF stabilizasyonunun obezite gelişimine karşı korunduğunu,20 insülin duyarlılığını iyileştirdiğini,20 ve serum kolesterol seviyelerini düşürdüğünü göstermiştir.21 Bu sonuçlar, HIF stabilizasyonunun aşağıdaki hastalıkların gelişiminde koruyucu etkilerini göstermektedir. DKD. Buna karşılık, von Hippel-Lindau delesyonu ile suprafizyolojik HIF stabilizasyonunun renal fibrozisi indüklediği rapor edilmiştir.22 DKD progresyonunda HIF stabilizasyonunun rolü, HIF'nin pleiotropik etkileri ve çeşitli DKD fenotiplerinin varlığı göz önüne alındığında bağlama bağlı olabilir. Bu çalışmanın amacı, diyabetik böbrekte HIF stabilizasyonunun enerji metabolizması üzerindeki net etkilerini netleştirmekti. Önceki raporlar, DKD'de enerji metabolizması değişikliklerinin meydana geldiğini göstermiştir. Sas ve ark.10 diyabetik renal kortikal dokuda mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili olabilecek artan enerji metabolik akışı ve glukoz metabolitlerinin birikimini göstermiştir. You ve ark.23, bir TCA döngüsü metaboliti olan fumaratın diyabetik böbrek dokusunda biriktiğini ve DKD'nin ilerlemesine doğrudan katkıda bulunduğunu bildirdi. Daha önce diyabetik böbrek dokusunda biriken, sodyum-glukoz kotransporter 2 inhibisyonu veya kalori kısıtlaması ile tersine çevrilen TCA döngüsü metabolitlerinin olduğunu göstermiştik.11 Ayrıca, Qi ve ark.24, piruvat kinaz M2 (PKM2) dahil glikolitik yollardaki enzimlerin, DKD'si olmayan tip 1 diyabetli hastalarda, DKD'li hastalarla karşılaştırıldığında yukarı doğru düzenlenmiştir. PKM2 aktivasyonu, kısmen glikolitik akışı artırarak glikoliz metabolitlerinin birikimini tersine çevirdi ve mitokondriyal fonksiyonu restore etti.24,25 Bu önceki raporlar, glikoliz ve TCA döngüsü metabolitlerinin birikiminin, PKM2 dahil kolaylaştırılmış glikoliz ile hafifletilebilen DKD'nin ilerlemesini etkileyebileceğini düşündürmektedir. aktivasyon. Çalışmamızda, enarodustat ile HIF stabilizasyonu, enerji metabolizması değişikliklerini tersine çevirdi ve diyabetik renal kortikal dokuda glikoliz ve TCA döngüsü metabolitlerinin birikimini azalttı (Şekil 8). PKM2 dahil glikolitik enzimlerin ifadesi de enarodustat tarafından yukarı doğru düzenlenmiştir (Ek Şekil S4B). Ayrıca, enarodustat GSSG birikimini hafifletti ve glutatyon/GSSG oranını artırdı, bu da enarodustat'ın DKD'deki oksidatif stresi azalttığını gösteriyor (Şekil 8). Oksidatif stresteki bu enarodustat kaynaklı azalma, renal kortikal dokudaki malondialdehit seviyelerindeki değişikliklerle de doğrulandı (Ek Şekil S4A). Bu sonuçlar, HIF stabilizasyonunun DKD'nin patofizyolojisinde en azından metabolik perspektiflerden koruyucu rollere sahip olması gerektiğini göstermektedir. HIF stabilizasyonu ile metabolik yeniden programlamanın DKD progresyonu üzerinde doğrudan etkileri olup olmadığını inceleyemeyeceğimiz kesindir, çünkü HIF'nin pleiotropik rolü nedeniyle metabolizma değişikliklerinin böbrek sonucu üzerindeki net etkilerini ayırt etmek imkansız olabilir. Bununla birlikte, çalışmamızda diyabetin neden olduğu hafif idrar albümin atılımı ve böbrek patolojik anormallikleri (glomerülomegali ve glomerüler bazal membran kalınlaşması), böbrek enerji metabolizmasının normalleşmesi ile bağlantılı olarak enarodustat tarafından hafifletildi. Alloxan kaynaklı diyabetik fare modelindeki mikroarray verilerinden ekspresyon değişiklikleri idrar albümin seviyeleriyle (257 prob; 232 gen) korele olan genleri çıkardık ve yol zenginleştirme analizi yaptık (Ek Şekil S5). Sonuç olarak, mitokondriyal membran ve solunum elektron taşınması ile ilgili yollar, idrar albümin seviyeleri ile ilişkili olarak yukarı doğru düzenlenir, bu da mitokondriyal yükün idrar albümin atılımı ile yakından ilişkili olduğunu gösterir. Bu nedenle, diyabetik böbrek dokusunun HIF stabilizatörleri tarafından metabolik normalizasyonunun mitokondriyal yükü azaltması ve DKD'nin ilerlemesini hafifletmesi olasılığı vardır. Verilerimiz DKD'nin patofizyolojisini metabolik perspektiflerden şu şekilde ortaya koymaktadır: Hiperglisemi renal proksimal tübüllerde glukoz reabsorbsiyonu için enerji talebi yaratır; bu nedenle, mitokondrideki TCA döngüsü, DKD'nin erken evrelerinde enerji talebini karşılamak için zorla aktive edilir (yağ asidi ve amino asit metabolizmasının düzenlenmesi). Ve HIF stabilizatörleri, DKD ilerlemesine karşı koruyucu rollere sahip olabilecek TCA döngüsünden glikolize (yağ asidi ve amino asit metabolizmasının aşağı regülasyonu ve glikolizin yukarı regülasyonu) metabolik yeniden programlama yoluyla bu mitokondriyal yükü hafifletebilir. Böbrek dokusundaki mitokondriyal yükün DKD patofizyolojisini doğrudan nasıl etkilediğini netleştirmek için tek hücreli omikleri içeren ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Bir başka ilginç soru da, HIF stabilizatörlerinin proksimal tübüllerde glukoz emilimini doğrudan etkileyip etkilemediğidir. In vitro verilerimiz, ATP üretiminin, TCA döngüsünden glikolize kadar metabolik yeniden programlama yoluyla enarodustat tarafından önemli ölçüde azaldığını göstermiştir (Şekil 1 ve 2). ATP'nin sodyum-glukoz kotransporter 2 tarafından glikoz yeniden emilimi için gerekli olduğu göz önüne alındığında, ilk önce glikoz yeniden emiliminin enarodustat tarafından etkisiz hale getirilebileceğini varsaydık. Bununla birlikte, idrar glikoz seviyeleri, her iki hayvan modelinde de grup B ve grup C arasında önemli ölçüde farklı değildi (Ek Şekil S6). Muhtemelen, enarodustat tarafından ATP üretimindeki azalma, in vitro etkisine kıyasla fizyolojik bir durumda çok daha hafiftir; bu nedenle, HIF stabilizasyonu, en azından bizim hayvan deneylerimizde, sodyum-glukoz ortak taşıyıcı 2 yoluyla glukoz emilimini etkilemez. Çalışmamızın 2 sınırlaması vardı. İlk olarak, erken evre DKD modelleri olarak STZ ile indüklenen diyabetik sıçanları ve alloksan ile indüklenen diyabetik fareleri kullandık ve diyabetik durumların kısa vadeli etkilerini gözlemledik. Bununla birlikte, klinik ortamda, geç evre DKD'de anemisi olan hastalara HIF stabilizatörleri uygulanacaktır. Geç evre DKD'de HIF stabilizasyonunun renal metabolizma değişiklikleri üzerindeki etkisini anlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. İkincisi, çalışma, metabolom verilerindeki metabolit konsantrasyonlarının dağılımına ilişkin olarak yeterli istatistiksel güce sahip değildi, oysa transkriptome verileri, enerji metabolizmasının bütün resmini netleştirmeye yetecek kadar büyük istatistiksel güce sahipti. Pek çok metabolit gruplar arasında anlamlı bir fark göstermediğinden, PLS-DA'yı gerçekleştirdik ve MSEA için PLS-DA VIP skoru 1'den büyük veya eşit olan metabolitleri seçtik. Metabolomik verileri tek başına kullanarak bir metabolik değişikliği çapraz doğrulamak zor olsa da, metabolom analizinin sonuçları transkriptomik verilerle uyumluydu (Şekil 7 ve 8), transkriptom değişikliklerinin renal enerji metabolizması üzerinde gözlenen etkileri için ek destek sağladı. Sonuç olarak, bir oral HIF stabilizatörü olan enarodustat (JTZ-951), DKD'nin erken evrelerinde renal enerji metabolizması değişikliklerine karşı koyar. Çalışmamız, HIF stabilizasyonunun, DKD'de düzensiz renal enerji metabolizmasını hedefleyen potansiyel bir müdahale olarak hizmet edebileceğini düşündürmektedir.

YÖNTEMLER

Mito Stres Testi ve Glikolitik Hız Testi

HK-2 hücreleri, 1 x 10 yoğunlukta bir 96-kuyulu mikroplaka üzerine ekildi⁴hücreler/kuyu. Ertesi gün, metabolik akış, Mito Stress Test Kiti (103015-100; Agilent) veya Glikolitik Hız Test Kiti (103344- 100; Agilent) kullanılarak Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) ile gerçek zamanlı olarak ölçüldü. Kültür ortamında glukoz, piruvat ve glutamin konsantrasyonları sırasıyla 10 mmol/l, 1 mmol/l ve 2 mmol/l idi.

siRNA transfeksiyonu

HIF-1 yıkımı, insan HIF1A'sı için Stealth RNAi tarafından gerçekleştirildi (HSS104774 [#1] ve HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Negatif kontrol olarak Stealth RNAi siRNA Negatif Kontrol Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific) kullanıldı.

Western blotlama

Boyama için kullanılan birincil antikorlar, anti-insan HIF-1 antikoru (tavşan poliklonal, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) ve anti-insan aktin antikoru (tavşan poliklonal, 1:1000; Sigma-Aldrich, St) idi. .Louis, MO). İkincil bir antikor, yaban turpu peroksidazla konjuge keçi anti-tavşan IgG antikoruydu (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Hayvan deneyleri

Crl: CD (Sprague Dawley) sıçanları ve Crl: CD1 (Institute of Cancer Research) fareleri, Charles River Laboratories Japan Inc.'den (Yokohama, Japonya) elde edildi. Tüm deneyler, Tokyo Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı (onay numarası P17-110). Tüm hayvan prosedürleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine (Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu) göre yapıldı. Çalışma protokolleri Şekil 3 ve 9'da gösterilmiştir.

transkriptom analizi

Renal kortikal dokudan toplam RNA, GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich) kullanılarak izole edildi. Toplam RNA (100 ng), Düşük Giriş Hızlı Amplifikatör Etiketleme Kiti (Agilent) kullanılarak etiketlendi ve ardından SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Mikroarray (sıçan için; Agilent) ve SurePrint G3 Mouse GE v{{7 ile hibritlendi }}x60K Mikroarray (fare için). Tüm mikrodizi deneyleri, DNA Chip Research Inc. (Tokyo, Japonya) tarafından gerçekleştirilmiştir. Ham veriler, kantil normalizasyon yöntemini kullanarak arka plan düzeltmesi ve veri normalizasyonu gerçekleştirmek için Bioconductor'da (//www.bioconductor.org/) R paketi limma ile işlendi. Sıçan deneyinde parti etkileri ComBat (Bioconductor) tarafından kaldırıldı. Diferansiyel olarak eksprese edilen genler, │log2 FC│ 0,5'ten büyük veya eşit ve Q değeri < 0.05="" ile="" belirlendi.="" gen="" ontolojisi="" ve="" kanonik="" yol="" analizleri,="" basespace="" correlation="" engine="" (illumina,="" san="" diego,="" ca)="" kullanılarak="" yapıldı.="" mikrodizi="" verileri,="" ulusal="" biyoteknoloji="" bilgi="" gen="" ekspresyonu="" omnibus="" merkezinde="" gse131221="" (sıçan)="" ve="" gse139317="" (fare)="" serisi="" olarak="">

Gen Seti Zenginleştirme Analizi

GSEA, önceden tanımlanmış bir gen kümesinin 2 biyolojik durum arasında istatistiksel olarak anlamlı, uyumlu farklılıklar gösterip göstermediğini belirleyen bir hesaplama yöntemidir. GSEA, GSEA v.3.0 (Broad Institute, Cambridge, MA) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yanlış keşif oranı < 0.25="" olan="" yollar="" anlamlı="" kabul="">

Metabolom analizi

Metabolom ölçümleri, Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, Japonya) tarafından gerçekleştirilmiştir. Metabolit konsantrasyonları, iç standart alanına göre her metabolitin pik alanının normalleştirilmesi ve 3-nokta kalibrasyonlarından elde edilen standart eğriler kullanılarak hesaplandı. Ayrıca bkz. Ek Yöntemler.

Metabolit seti zenginleştirme analizi

Metabolomik verilerinin analizi, entegre web tabanlı platform MetaboAnalyst 4.0 kullanılarak yapıldı. PLS-DA yapıldı ve ilgili VIP puanları hesaplandı. MSEA için PLS-DA VIP skoru 1'den büyük veya eşit olan metabolitler kullanıldı.

Böbrek patolojilerinde glomerüler alanların miktar tayini

Her örneğin periyodik asit-Schiff boyama görüntüsünden rastgele 3 patolojik resim çektik ve sırasıyla Fiji (ImageJ dağılımı; Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) kullanarak her glomerüler alanı ölçtük.

KÜBİK-böbrek

Önceki makalelerimize göre CUBIC kullanılarak böbrek dokusundaki glomerüllerin kapsamlı 3-boyutlu görüntülemesi yapıldı. Kısaca, sabitlenmiş fare böbrekleri, delipidasyon için CUBIC-L'ye daldırıldı ve ardından immünofloresan boyamaya tabi tutuldu. Son olarak, kırılma indisi, numunelerin CUBIC-R plus'a yerleştirilmesiyle eşleştirildi. Şeffaf böbreklerden kapsamlı 3B boyutlu görüntüler, özel yapım ışık levhası floresan mikroskobu (MVX10-LS; Olympus, Tokyo, Japonya) ile elde edildi. Boyama için kullanılan birincil antikor, anti-podosin antikoruydu (tavşan poliklonal, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). İkincil antikor, Alexa Flour 555- konjuge eşek anti-tavşan IgG'siydi (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

istatistiksel analiz

Çoklu karşılaştırmalar için, uygunsa, {{0}}yollu varyans analizi ve ardından post hoc Tukey çoklu karşılaştırma testleri uygulandı. Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism 7 yazılımı (GraphPad Software, San Diego, CA) ile yapıldı. P < 0.05="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" kabul="" edildi.="" veriler="" ortalama±sd="" olarak="">

AÇIKLAMA

MN, KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim'dan ücret, danışmanlık ücreti veya araştırma fonu almıştır. ve Alexion. TT, JT'den araştırma bursu aldı. Enarodustat (JTZ-951), JT, Tokyo, Japonya tarafından sağlandı. EAS ve HRU, RIKEN'in sahip olduğu patentlerin ortak mucitleridir. Bu çalışmanın bir kısmı Olympus Corporation ve Bitplane tarafından desteklenen bir tür yazılım ile işbirliği içinde yapıldı. Diğer yazar, rekabet eden çıkarlar beyan etmemiştir.

TEŞEKKÜRLER

Değerli tartışmalar için Dr. Shuhei Yao ve Dr. Shinji Tanaka'ya minnettarız. Ayrıca teknik destekleri için Dr. Tsuyoshi Inoue, Dr. Satoru Fukuda ve Bayan Kahoru Amitani'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Tokyo Üniversitesi İzotop Bilim Merkezi desteğiyle gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma, Japon Bilimi Teşvik Derneği (JSPS) Araştırma Görevlisi (JSPS KAKENHI hibesi 19J11928'i SH'ye), Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (B) (JSPS KAKENHI hibesi 18H02824'ü MN'ye) için Yardım Hibesi tarafından desteklenmiştir. ), Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (C) (JSPS KAKENHI, TT'ye 17K09688 hibesi) ve Yenilikçi Alanlar Üzerine Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (KAKENHI hibesi 26111003 MN).