Yaşa Bağlı Nörodejeneratif Hastalıklarda Klinik Öncesi Çalışmaları İlerlemeye Giden Yol: Kemirgen ve HiPSC'den Türetilmiş Modeller Üzerine Bir Perspektif Bölüm 3

Benzer viral vektör yaklaşımları, çeşitli PD modellerinde değerlendirilmiştir; ilk versiyonlarda AAV2/2 veya LV'ler kullanılmıştır.123-126 Yetişkin sıçan beyinlerine enjekte edilen bu vektörler, hastalık için insan a-syn'inin WT, A30P veya A53T mutantlarını iletmek için kullanıldı. indüksiyon.

Virüsler ve hafıza arasındaki ilişki birçok kişiye olumsuz görünebilir çünkü virüsler sıklıkla fiziksel rahatsızlığa ve hastalığa neden olur. Bununla birlikte, virüsler aynı zamanda hafızanın iyileştirilmesinde de olumlu bir etkiye sahip olabilir, çünkü viral saldırılar bağışıklık sisteminin aktivitesini destekleyebilir.

Çalışmalar, viral saldırıların vücudun bağışıklık sisteminin tepki vermesine neden olabileceğini ve böylece vücudun virüslere karşı direncini artırabileceğini göstermiştir. Bu bağışıklık sistemi tepkisi, antikor üretiminin yanı sıra üretilen beyaz kan hücrelerinin ve diğer bağışıklık hücrelerinin sayısının arttırılmasını içerir. Bu tepkiler yalnızca vücudun virüs istilasına karşı direnmesine yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda bağışıklık sisteminin işlevini güçlendirmeye ve vücudun genel sağlığını iyileştirmeye de yardımcı olur.

Viral saldırılar aynı zamanda beyindeki bağışıklık hücrelerini de harekete geçirir. Bu bağışıklık hücreleri, beyindeki atık ve bozuk hücreleri uzaklaştırabilir, sinir sisteminin işlevini iyileştirebilir ve bilgi aktarımını ve hafıza işlemeyi destekleyebilir. Çalışmalar ayrıca belirli viral enfeksiyonlara sahip kişilerin hafıza görevleriyle uğraşırken daha iyi performans gösterdiklerini de göstermiştir.

Buna ek olarak, bazı çalışmalar belirli virüslerin vücudu, nöronların büyümesini ve gelişimini destekleyen bir madde olan beyinden türetilmiş nörotrofik faktör (BDNF) üretmesi için uyarabildiğini bulmuştur. Bu maddenin beyin fonksiyonu üzerinde olumlu bir etkisi vardır ve fiziksel onarımı ve hafıza gelişimini destekleyebilir.

Elbette virüsle mücadelede bağışıklık sistemimizin en iyi durumda olması için doğru yaklaşım ve stratejiyi benimsememiz, iyi hijyen alışkanlıklarını sürdürmemiz, yeterince uyku ve egzersiz yapmamız gerekiyor. Kısacası virüs her ne kadar bize fiziksel rahatsızlık verse de bağışıklık sisteminin aktivitesini de destekleyebildiğine, sağlığımız ve hafızamız üzerinde olumlu bir etkiye sahip olduğuna dair giderek artan kanıtlar var. Belleğimizi geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche hafızamızı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche aynı zamanda hafıza ve öğrenme için çok önemli olan asetilkolin ve büyüme faktörlerinin seviyelerini arttırmak gibi nörotransmitterlerin dengesini de düzenleyebilir. Ayrıca Cistanche kan akışını iyileştirebilir ve oksijen dağıtımını destekleyebilir, bu da beynin yeterli beslenme ve enerji almasını sağlayarak beyin canlılığını ve dayanıklılığını artırır.

Belleği geliştirmek için ekleri bil'e tıklayın

Yazarlar, nigral DA nöronlarında a-syn'in etkin ifadesini, moleküler ve hücresel patolojilerin ve zamanla yavaş yavaş gelişen nigralDA dejenerasyonunun eşlik ettiğini gösterdi.

Bununla birlikte, bu çalışmalarda kullanılan rAAV2/2 vektörlerinin ilk nesli, tirozin-hidroksilaz-pozitif nöronların nörodejenerasyonu ve zaman süreci oldukça değişken olmasına rağmen ilerleyici nöron kaybı sergilemiştir (%25-%80 ve 6 hafta ila 1 yıl). , sırasıyla).123,124

Buna karşılık, WT-, A30P- veya A53T mutasyona uğramış a-senyronunu kodlayan LV'ler, sıçanlarda nöronal hücre kaybını daha gecikmeli ve daha tutarlı bir şekilde (sırasıyla %25-%40 ve 5 ay) indükleyebildiğini göstermiştir.126 Her iki çalışma da göstermiştir. nörit uzunluğunda ilerleyici bir kayıp ve kalan DA nöronlarında perikaryanın şişmesi.

Ayrıca, hem hücre gövdelerinde hem de nöritlerde büyük sitoplazmik a-sin birikimleri bulundu. Bu sonuçlar yakın zamanda her iki viral platformun da kullanıldığı çok sayıda çalışmada tekrarlanmıştır.127-131

LV'ler ayrıca çeşitli fare PD modellerinde de kullanılmıştır. Örneğin, Lauwers ve meslektaşları125 striatum, amigdala veya SNof farelerinde a-syn'in WT veya A30P mutantını taşıyan LV enjeksiyonunun, PH ile ilişkili nörodejeneratif değişiklikleri zamana bağlı bir şekilde indükleyebildiğini ve bağımsız bir nöritik genişlemeyi içerdiğini gösterdiler. ve sitoplazmik kapanımlar.

Ayrıca bu çalışma, A30P-a-syn'in nigral aşırı ekspresyonunun 10-12 ayda yaklaşık %25 hücre kaybıyla sonuçlandığını gösterdi.125 A30P, E57K ve E35K'nin farenin SN'sine LV kullanılarak verilmesi DA nöronunda da benzer bir etki gösterdi WT'ye (%30) kıyasla kayıp (%50 civarında) olurken, aynı çalışmada kullanılan daha hızlı fibril oluşturan mutant A53T, DA hücre sayısında önemli bir azalma göstermedi.

İlginç bir şekilde, farelerde gözlemlenen genel nöropatolojik özellikler (yani başlangıç ​​ve ciddiyet), sıçanlara kıyasla daha az şiddetli göründü; ancak bu farklılıklar, viral saflığın veya enjekte edilen virüsün üretim titrelerinin ve/veya diğer ilgili teknik tutarsızlıkların bir eseri olabilir.

AD ve PD Viral Vektör Modelleri İçin Önemli Hususlar

AAV2/1, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8, AAVrh10, DJ ve DJ8'i de içeren yeni serotiplerin geliştirilmesi, hücresel hedefleri genişletti ve AAV transdüksiyon verimliliklerini iyileştirdi.

Bu yeni kapsidlerle serotiplenen AAV'ler, a-syn'i aşırı eksprese etmek üzere sıçanlarda ve insan olmayan primatlarda test edilmiştir.132-137 AAV2/5 ve AAV2/6 aracılığıyla iletilen S129Aformun aşırı ekspresyonu, nörodejenerasyon sürecinde sürekli olarak artan toksisite sergiler.134,138

Bu deneyler aynı zamanda aşırı ekspresyon transgeninin dikkatli dozlanmasının çok önemli olduğunu gösterdi; çünkü sadece yüksek titrelerde verilen floresan raportörleri taşıyan kontrol vektörleri bile spesifik olmayan toksik etkiler gösterebilir.135

AAV'ye dayalı kurtarma deneyleri tasarlanırken bu uyarının dikkatle dikkate alınması gerekir. Örneğin, SNCA'yı hedef alan küçük müdahaleci RNA'yı (siRNA) barındıran terapötik AAV'nin, yüksek düzeyde toksisiteye yol açtığı ve nigrostriatal DA nöronlarında önemli bir kayba neden olduğu gösterilmiştir. Bu çalışma ayrıca hayvan çalışmalarında AAV uygulamalarının sınırlamalarını vurguladı.

Bununla birlikte, nörotoksisitenin, sıçan modellerinde SNCA seviyelerinin güçlü bir şekilde azalmasından kaynaklandığı göz ardı edilemez; asa-syn, DA nöronlarında çok önemli bir biyokimyasal rol oynar ve güçlü bir şekilde azaltılması, hücre canlılığını azaltabilir.139 Birlikte ele alındığında, bu, Gen terapisi yaklaşımlarını tasarlamak için hastalıkla ilişkili genlerin ekspresyonunun ince ayarını yapmak için bir araç geliştirmek.

Bu bağlamda, daha yeni CRISPR-dCas9-tabanlı sistem, gen ifadesinin kesin ve ince ayarlı bir biçimde modüle edilmesi için daha avantajlı bir sistem sunabilir.

Bu doğrultuda yakın zamanda SNCA gen ifadesinin hassas ve ince ayarlı regülasyonunu sağlamak için LV-CRISPR-Cas9 sistemini geliştirdik. Çalışma, gen ekspresyonunun epigenom düzenlenmesi yoluyla manipülasyonunun (örneğin aşırı ekspresyonun tersine çevrilmesi), gen düzensizliğinin neden olduğu Parkinson hastalığı140 gibi nörolojik bozukluklar için değerli bir terapötik strateji olduğuna dair kanıt sağladı.

Bu nedenle, a-syn proteininin aşırı ekspresyonu için LV ve AAV'yi kullanan viral vektör PD modelleri, DA nörodejenerasyonu ile ilişkili PD patolojisini gösterir ve yeni AAV serotiplerinin kullanımı, AAV2/2 ile karşılaştırıldığında DA nöronlarında a-syn ekspresyonunu geliştirir.

Genel olarak, hem AAV'ler hem de LV'ler transgen ekspresyonunu indükleme yeteneğine sahiptir ve DA nöronları için yüksek düzeyde tropizm sergileyerek benzer düzeyde nörodejenerasyona neden olur. Hücresel PD fenotiplerinin yavaş ilerlemesini ve nispeten düşük düzeydeki davranış bozukluklarını önlemek için bu viral sistemlerin daha da geliştirilmesi gerekecektir.

İn Vitro Hücre Kültürü ModelleriMevcut İn Vitro AD ve PD Modellerine Genel Bakış: Sınırlamalar ve Fırsatlar

Geçtiğimiz kırk yılda, göreceli hastalık patofizyolojisinin temel yönleri arasındaki etkileşimleri incelemek için çeşitli AD ve PD in vitro modelleri geliştirildi ve daha sonra klinik öncesi terapötik tarama için kullanıldı.

Mevcut AD ve PD in vitro modelleri öncelikle mitokondriyal fonksiyon bozukluğu, oksidatif stres, hücre sağkalımı ve hücre içi ve/veya hücre dışı protein agregatlarının varlığı gibi moleküler ve hücresel hastalık işaretlerini özetlemeyi amaçlamaktadır. Örneğin, AD'nin en öne çıkan ve yaygın olarak kullanılan hücresel modelleri, Ab40 42 agregatlarının indüksiyonuna veya tau hiperfosforilasyonu ve agregasyonuna dayanmaktadır141,142 (Tablo 1).

Benzer şekilde, PD'nin in vitro modelleri, yukarıda bahsedilen toksin kaynaklı mitokondriyal disfonksiyona (örneğin, MPTP, rotenon, paraquat, 6-OHDA) ve bozulmuş proteostazise (örneğin, thapsigargin, iyonomisin, tunikamisin), a-sin aşırı ekspresyonuna ve ekspresyonuna dayanmaktadır. mutasyona uğramış PD ailesel genlerinin (örneğin, a-syn, Parkin, PINK1)92 (Tablo 2).

Bu hücre kültürü modelleri, ilgili nörobiyolojiye ilişkin anlayışımızı ilerletmede çok değerli olmasına rağmen, henüz önlemeyi, başlangıcı geciktirmeyi veya hastalığın ilerlemesini yavaşlatmayı amaçlayan uygulanabilir DMT'lerle sonuçlanmadı; bu da bunların alaka düzeyini ve çeviri geçerliliğini sorgulamaya yol açtı.

Bu modellerdeki bazı açık sınırlamaların, mevcut klinik öncesi uygulamaları geliştirmek için kabul edilmesi önemlidir.

Örneğin, ilgili hastalıkla ilişkili genlerin aşırı ekspresyonuna ve nakavt/aşağılanmasına dayalı modeller, protein seviyelerindeki kantitatif değişiklikler ve gen ekspresyonunda değişiklikleri tetiklemek için kullanılan yöntemler (yani viral aracılı, üreme bazlı, kurucu veya geçici ekspresyon) açısından herkesin bildiği gibi değişkendir. bu çelişkili veri ve çıkarımlara yol açabilir.92

Hastalıkla ilişkili fenotiplerin ortaya çıkarılmasındaki bu tutarlılık eksikliği, potansiyel DMT'leri test etmek için bu modelleri kullanan klinik öncesi çalışmalara bir uyarı getirmektedir. Ayrıca, klinik öncesi NDD modellerinde gözlemlenen hücresel fenotiplerdeki ve metodolojideki değişkenlik (örneğin, protein aşırı ekspresyonunun kat değişimi veya devrilme), mevcut hücre modellerinde tam olarak keşfedilemeyen daha büyük bir genetik heterojenliği kuvvetle önerir.

Bu durum, ailesel varyantların genel NDD vakalarının küçük bir azınlığını temsil etmesine rağmen, ailesel kohortlarda tanımlanan genetik varyantlara dayalı hücre modellerinin yaygınlığı nedeniyle daha da karmaşık hale gelmektedir.109,143

Ortaya çıkarılmamış genetik nedenlerden dolayı, klinik öncesi modellerde sporadik NDD kohortlarını veya Mendel olmayan genetiğe sahip hastalık alt tiplerini doğru bir şekilde temsil etmek zor olmaya devam ediyor, bu da ilgili hastalık mekanizmalarının aydınlatılmasında, potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesinde ve ilaç geliştirmede önemli bir engel oluşturuyor.

Bu zorluklar göz önüne alındığında, araştırmacılar iyileştirme alanlarını belirlemek ve yeni hücre kültürü tekniklerinin sunduğu fırsatları değerlendirmek için bu modelleri değerlendirmek zorunda kaldılar.

Son yıllarda, yeni gen düzenleme teknolojisini dahil ederek ve GWAS'larda elde edilen önemli genetik hastalık ilişkilerini iyileştirilmiş doku kültürü modellerinde değerlendirerek bu modeller üzerine inşa ettik.144,145

HiPSC teknolojisinin artan katılımı, NDD in vitro modelleme alanında büyük bir ilerlemeyi temsil eder ve insan genomu bağlamında hastalık patogenezini araştırmak için hastalardan türetilen hastalıkla ilgili hücre tiplerinin kullanılmasına yönelik daha önce mevcut olmayan fırsatlar sağlar.

HiPSC'den türetilmiş NDD modellerinin, özellikle AD ve PD ile ilgili olanların tüm avantajları ve sınırlamaları bir sonraki bölümde tam olarak incelenmektedir.

hiPSC'den Türetilmiş NDD Modelleri: Çok Yönlü ve Genetik Olarak "Sadık"

Hücre kültürü teknolojisindeki modern gelişmeler, gelişmiş hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kişiselleştirilmiş tıp için fırsatlar sağlayarak, NDD araştırmalarında en heyecan verici buluşlardan birini temsil etmektedir.

Yakın zamana kadar, ölüm sonrası beyin muayenesi, insandaki nörodejeneratif durumların patolojik süreçlerine dair içgörü elde etmek için altın standart insan bazlı biyolojik materyal olarak kabul ediliyordu.

Bununla birlikte, hastaya özel nöronların ve glial hücrelerin analizi de dahil olmak üzere modern kök hücre teknolojileri, NDD'lerin patolojik mekanizmalarını araştırmak için yeni yollar açmış ve AD ve Alzheimer gibi gelişmiş genetik karmaşıklığa sahip NDD'lerin moleküler diseksiyonunda giderek daha fazla kullanılmaktadır. Polis.

Çeşitli alternatif biyolojik numunelere ek olarak hasta cilt numunelerinin basit, invaziv olmayan bir biyopsisi yoluyla, hiPSC'lerin üretilmesi, araştırmacıların önceki hücre kültürü yöntemleriyle imkansız olan bir şekilde NDD'lerin altında yatan moleküler yolları ve hastalık mekanizmalarını ortaya çıkarmasına olanak tanır.

Şu anda en yaygın donör hücreleri, yayınlanan tüm yeniden programlama deneylerinin %80'inden fazlasında kullanılan fibroblastlardır;146 ancak hiPSC'ler, embriyonik kordon kök hücreleri, göbek kordon kanı, kornea epitel hücreleri, ve periferik kan mononükleer hücreleri gibi kan hücreleri147-149(Şekil 1).

Sonuç olarak, hiPSC'den türetilmiş modeller mevcut hücresel hastalık modellerine çok yönlü bir alternatif temsil eder ve plazmidler, vektörler (örneğin epizomal) ve viral transdüksiyon (örneğin epizomal) gibi çeşitli yeniden programlama araçlarının kullanımı yoluyla pluripotensiteye zorlanan hasta somatik dokularından elde edilir. , adenovirüs, Sendai virüsü, lentivirüs; bu yöntemler Brouweret ark.150 ve Malik ve Rao151'de kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir.

Bu hücreler kendi kendini yenileyebilir ve embriyonik kök hücrelere (ESC'ler) alternatif olarak etik kaygılar ve sosyal kaygılar sunar. Şu anda NDD'li hastalardan ve yaşları eşleştirilmiş sağlık kontrollerinden elde edilen hiPSC hatlarını toplayan ve dağıtan, numuneleri merkezileştirmek ve bunları araştırmacıların kullanımına hazır hale getiren birkaç hiPSC deposu bulunmaktadır (Tablo S2).

HiPSC'lerin başlıca uygulamalarından biri spesifik hücre tiplerine farklılaşmadır ve bunlar sonuç olarak nörogelişimsel152 ve nörodejenerasyon çalışmaları,144 ex vivo transplantasyon,153,154 hastalık modelleme, hedef doğrulama ve ilaç keşfi dahil olmak üzere çeşitli biyolojik bağlamlarda kullanılmıştır.155

Bugüne kadar sadece jenerik nöronlar değil aynı zamanda uyarıcı, kolinerjik, DA'lar ve inhibitör GABAerjik nöronlar dahil spesifik nöronal hücre tipi popülasyonları da üreten çeşitli hücresel farklılaşma protokolleri geliştirilmiştir.156-158 HiPSC'lerden çeşitli spesifik glial alt popülasyon hücreleri de türetilmiştir. astrositler,159-161oligodendrositler,162,163 ve mikroglia dahil.164-166

CRISPR-Cas9, çinko parmak nükleazları (ZFN) ve transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazları (TALENS) içeren çeşitli yeni gen düzenleme teknikleri, hiPSC'den türetilen sisteme ek bir boyut kazandırdı; aynı genetik arka plana sahip izojenik modellerin yaratılması ve yalnızca seçilen mutasyonda farklılık gösterir.167

Hücre farklılaşma protokollerinin çeşitliliği, mekanik çalışmaları kolaylaştırdı ve izojenik çizgilerin mevcudiyeti, gen fonksiyonunun genetik analizlerini ve bunun NDD'lerdeki patojenik rolünü destekledi. hiPSC'den türetilen modeller, hastalıkla ilgili önemli özellikler sergiledikleri için bu araştırmalar için uygundur.

Örneğin, PS1 ve PS2 mutasyonlarını (sırasıyla A246E ve N14II)168 ve APP çoğaltma mutasyonunu169 taşıyan fAD ve sAD'den türetilen hiPSC nöron modelleri, Ab salgılanması, artan Ab42:Ab40 oranı ve yüksek hiperfosforile tau dahil olmak üzere önemli AD biyokimyasal özellikleri sergiler.

Ab ile ilişkili fenotipler üreten hiPSC modellerinin kullanımının, geleneksel ektopik ekspresyon modelleri veya Ab agregatlarının takviyesi ve/veya indüksiyonunu gerektiren modellerle karşılaştırıldığında, AD nörodejenerasyonunda Ab ekspresyonunun rolünü keşfetmenin daha doğru bir yolunu temsil ettiğini belirtmek önemlidir. bunlar Ab birikintileriyle ilgili "doğal" meydana gelen patolojik süreçleri benimser.

For more information:1950477648nn@gmail.com