Renal Fibrogenez Programı Oksidatif Metabolizmayı Düzenleyen MikroRNA'lar Tarafından Kontrol Edilir
Mar 29, 2022
İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob , Diego Rodríguez-Puyolc ,d
Santiago Lamesa,**
Fizyolojik ve Patolojik Süreçler Programı, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madrid, İspanya
b Genomik Tesis, Parque Científico de Madrid, Madrid, İspanya
c Patoloji Bölümü, Hospital Universitario "Ramn y Cajal", IRYCIS, Madrid, İspanya
d Tıp ve Tıpta Uzmanlık Bölümü, Üniversite Hastanesi Araştırma Vakfı "Príncipe de Asturias", IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madrid, İspanya
Anahtar Kelimeler: MikroRNAS, Böbrek fibrozu, Yağ asidi oksidasyonu, Hücre dışı matris, CPT1A, Mitokondri
cistanche vücut geliştirme böbrek fonksiyonu için çok iyidir
A B S T R A C T
Aşırı hücre dışı matris (ECM) birikimi, fibrotik hastalıkların ayırt edici özelliğidir. Böbrekte, kronik böbrek yetmezliğine yol açan yaygın hastalıkların son ortak yoludur. TGF- gibi sitokinler miyofibroblast transformasyonunda temel bir rol oynasa da, son çalışmalar, renal tübüler epitel hücreleri için ana enerji kaynağını tehlikeye atan mitokondriyal disfonksiyon ve kusurlu yağ asidi oksidasyonunun (FAO) temel katkılar olduğu öne sürülmüştür. böbrek fibrozunun gelişimi ve ilerlemesi için. Transkripsiyon sonrası gen ekspresyonunu düzenleyen mikroRNA'ların (miRNA'lar) renal fibrogenezi kontrol ettiği bildirilmiştir. Renal fibrozun metabolik düzensizliğine dahil olan miRNA'ları belirlemek için, tek taraflı üreter tıkanıklığının (UUO) fare modelinde bir miRNA dizi ekranı gerçekleştirdik. MiR-150-5p ve miR-495-3p, insan patolojisiyle bağlantıları, mitokondriyal metabolizmadaki rolleri ve yağ asidi mekik enzimi CPT1A'yı hedeflemeleri nedeniyle seçildi. Hem UUO hem de folik asit kaynaklı nefropati (FAN) modellerinde sırasıyla miR-150-5p ve miR-495-5p'nin 2- ve 4-kat artışını bulduk , TGF- 1 ise insan renal tübüler epitel hücre hattı HKC-8'deki ifadelerini yukarı doğru düzenler. Bu miRNA'lar, fibrozis ile ilişkili belirteçler Açta2, Col1 1 ve Fn1'i güçlendirerek pro-fibrotik etkisine ilişkin olarak TGF- ile sinerji oluşturdu. Biyoenerji çalışmaları, her iki miRNA'nın varlığında HKC-8 hücrelerinde FAO ile ilişkili oksijen tüketim oranında (OCR) bir azalma olduğunu göstermiştir. Tutarlı bir şekilde, mitokondriyal ilişkili hedef genleri CPT1A, PGC1 ve mitokondriyal transkripsiyon faktörü A'nın (TFAM) ekspresyon seviyeleri, bu miRNA'lara maruz kalan renal epitel hücrelerinde yarı yarıya azaldı. Buna karşılık, mitokondriyal kütle ve transmembran potansiyeli (ΔѰm) veya mitokondriyal süperoksit radikal anyon üretimindeki değişiklikleri tespit etmedik. Verilerimiz, miR-150 ve miR- 495'in, tübüler epitel hücrelerinde kritik olarak yer alan metabolik yetmezliği ağırlaştırarak ve sonuçta fibrozise yol açarak renal fibrogeneze katkıda bulunabileceğini desteklemektedir.
1. Giriş
Kronik böbrek hastalığı (KBH), böbrek fonksiyonundaki azalmanın devam ettiği klinik bir durumdur. Genellikle geri döndürülemez ve ilerleyici olarak kabul edilir. Genel nüfusun yüzde 12-14'ünü etkileyebilen önemli bir halk sağlığı sorununu temsil eder [1]. Diabetes mellitus ve hipertansiyon gibi oldukça yaygın patolojileri olan hastaların yaklaşık yüzde 30-40'ında mevcut olabilir ve burada evrimi ve prognozu belirlemeye katkıda bulunur. Hastalığın etiyolojisinden bağımsız olarak, KBH'nin ilerlemesi tübül-interstisyel ve glomerüler fibrozise yol açar [2]. Tubulo-interstisyel fibroz, inflamatuar hücreler, tübüler hücre kaybı ve miyofibroblast birikimi ile bağlantılı olarak matris proteinlerinin (ECM) (ağırlıklı olarak kollajen tip I ve III ve fibronektin) birikmesi yoluyla tübüler bazal membran ve peritübüler kılcal damarlar arasındaki boşluğun genişlemesini içerir. [3].
Dönüştürücü büyüme faktörü- (TGF-) her yerde bulunan çok önemli bir pro-fibrotik sitokin ve fibrozda miyofibroblast farklılaşmasının ana düzenleyicisi olarak kabul edilir [4]. Son çalışmalar, tübüler epitel hücreleri için ana enerji kaynağında bir uzlaşmaya yol açan, yağ asidi oksidasyonunda (FAO) global bir kusurun böbrek fibrozisinin gelişiminde önemli bir rol oynadığını göstermiştir [5,6]. TGF-, FAO'yu SMAD3-ve PGC1A'ya bağlı bir şekilde bastırır, dolayısıyla CPT1A dahil olmak üzere yağ asidi alımı ve oksidasyonunun transkripsiyonel düzenleyicilerini etkiler [5]. FAO'daki değişiklikler sonunda hücre içi lipid birikimi ve ATP tükenmesi ile sonuçlanarak fibrozise yol açar [5,7]. Bu nedenle, KBH'de işleyen metabolik düzensizliği düzeltmeyi amaçlayan stratejiler, terapötik seçenekler sağlayabilir [8].
MikroRNA'lar (miRNA'lar), transkripsiyon sonrası düzenleme üzerindeki etkileriyle gen ekspresyonunun kritik düzenleyicileri olarak ortaya çıkmıştır. Böbrekte miR'lerin nefrogenez, homeostaz ve hastalıkta kritik roller oynadığı gösterilmiştir [9]. MiRNA'lar ayrıca fibrotik süreçleri düzenleme yeteneğine sahiptir ve "fibrozis" olarak adlandırılmıştır [10]. Ek olarak, renal fibrogenezi önlemek veya geri döndürmek için etkili bir tedavinin olmaması nedeniyle [11], miRNA mimiklerinin veya inhibitörlerinin in vivo verilmesiyle miRNA ekspresyonunun manipülasyonu, CKD için umut verici bir terapötik strateji olarak önerilmiştir [12]. Ek olarak, dolaşımdaki miRNA'lar tanısal ve hatta prognostik biyobelirteçler oluşturabilir [13].
Böbrek fibrozunun MiRNA aracılı kontrolü, esas olarak, ana hedeflerden biri olarak Smad yolunu kullanan, hücreye bağlı ve içeriğe bağlı bir şekilde TGF- 1 sinyallemesinin düzenlenmesi yoluyla gerçekleşir [14]. Önceki çalışmada, spesifik metabolik yolları düzenleyerek renal fibrozis üzerinde etkisi olan birkaç miRNA tanımlamıştık [15,16]. MiR-9-5p'nin aşırı ekspresyonu, tübüler epitelyal renal hücre farklılaşmasını önler ve fibrozla ilişkili metabolik düzensizliği yeniden programlar [16], miR-33'nin işlev kaybı, ister genetik ister farmakolojik olsun, artışa neden olur. FAO ve tübüler epitel hücrelerinde lipid birikiminin önlenmesi. Bu, artan enerji kaynağı, gelişmiş mitokondriyal biyoenerji ve deneysel renal fibrozisin önlenmesi ile ilişkilidir [15]. Böylece hücresel biyoenerjetiği düzenleyen miRNA'lar böbrek fibrojenezini de düzenleyebilir. Bu çalışmada, metabolik yolların modifikasyonu yoluyla renal fibrotik fenotipte yer alan miRNA'ları belirlemek için tek taraflı üreteral obstrüksiyon (UUO) kronik böbrek hasarı modelinde miRNA dizisine dayalı bir strateji kullandık. Mitokondriyal fonksiyonla ilgili birkaç gen (CPT1A, TFAM, PGC1A) seçerek, hem miR-150 hem de miR-495'ı, FAO ile ilişkili oksijen tüketim oranını (OCR) azaltabilen ve TGF'yi destekleyebilen miRNA'lar olarak tanımladık{ {21}}insan renal tübüler epitel hücre hattı HKC'de indüklenmiş fibrojenik transformasyon-8. Bulgularımız, miRNA'ların renal fibrogenezde yer alan mitokondriyal metabolik düzenleyiciler olarak önemini vurgulamaktadır.
2. Malzeme ve yöntemler
Hücre hatları ve kültür koşulları. İnsan renal proksimal tübüler epitel hücreleri (HKC-8), 15 mM HEPES, yüzde 5 ile takviye edilmiş DMEM/F12 (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı 1:1 (h/h)) (Corning, New York, NY) içinde kültürlendi. (hacim/hacim) fetal sığır serumu (FBS)
(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0.5 ug/ml hidrokortizon (Sigma, St. Louis, MO), 50 birim/ mL penisilin ve 50 ug/mL streptomisin (Gibco, Rockville, MD) 37°C'de ve yüzde 5 CO2. Bu hücre dizisi, nazikçe Dr. Susztak'ın laboratuvarı (Philadelphia, Pennsylvania, ABD) tarafından sağlandı. İnsan rekombinant 10 ng/ml TGF- 1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) ile tedaviler, HKC-8 hücrelerinin 12 saat boyunca serumsuz aç bırakılmasından sonra gerçekleştirildi.
Transfeksiyon prosedürü. Hücreler, yüzde 70'lik bir birleşmeye ulaşmak için 60 mm'lik kültür tabaklarına ekildi. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) kullanılarak miR-150, miR-495 veya mirVana™ miRNA mimik negatif kontrolünün (Ambion şirketi, ABD) 40 nM'lik mirVana™ miRNA taklitçisi ile transfekte edildiler. . Hücreler lipofektamin-pre-miRNA 37 ◦C ile 6 saat inkübe edildi. Daha sonra, kültür tabaklarına yüzde 10 FBS içeren 5 ml taze ortam ilave edildi ve hücreler, sonraki deneyler için kullanılana kadar 6 saat boyunca kültürde tutuldu. TGF- 1 tedavisi ile kombinasyon durumunda, bir önceki bölüme göre miRNA'ların aşırı ekspresyonundan sonra hücrelere uygulandı.
İmmünoblot. Hücreler PBS içinde yıkandı, homojenleştirildi ve 150 mM NaCl, yüzde 0.1 SDS, yüzde 1 sodyum deoksikolat, yüzde 1 NP-40 ve 25 mM Tris– içeren 100 μL RIPA lizis tamponunda lize edildi. HCl pH 7.6, proteaz (Complete, Roche Diagnostics, Mannheim, Almanya) ve fosfataz inhibitörleri (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) varlığında ve kazıma yoluyla hasat edildi. Her böbrek numunesinin çeyrek parçası (hem boyuna hem de çapraz olarak yarıya bölündükten sonra elde edildi), 5 mm paslanmaz çelik boncuklar (Qiagen, Valencia, CA) ile 300 ul RIPA tamponu içinde TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA) titreşen kullanılarak homojenleştirildi. 4 ◦C'de 15 dakika 50 Hz. Örnekler 10,000 g'de 4 ◦C'de 15 dakika santrifüj edilerek berraklaştırıldı. Ardından pelet atıldı ve süpernatant protein lizatı olarak tutuldu. Protein konsantrasyonları, BCA Protein Test Kiti (Thermo Scientific, Rockford, IL) ile belirlendi ve Glomax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI) içinde ölçüldü. Toplam özütten eşit miktarlarda protein (10-50 ug) yüzde 8-10 SDS-poliakrilamid jeller üzerinde ayrıldı ve yarı kuru bir ortamda 20 dakika boyunca 12 V'ta nitroselüloz lekeleme zarlarına (GE Healthcare, Chicago, IL) aktarıldı. Trans-Blot Turbo sistemi (Bio-Rad, Hercules, California).
Zarlar, 0%5 Tween-20 içeren PBS içinde yüzde 5 yağsız süt ile 1 saat süreyle inkübasyonla bloke edildi ve gece boyunca spesifik antikorlarla lekelendi: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{ {26}}; 4 ◦C gece), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦C gece), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15000; 1 saat, oda sıcaklığı ). IRDye 800 keçi anti-tavşan ve IRDye 600 keçi anti-fare (1:15,000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) ikincil antikorları ile inkübasyondan sonra, membranlar Odyssey Kızılötesi Görüntüleme Sistemi (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Bant dansitometrisi, ImageJ 1.48 yazılımı (/rsb.info.nih.gov/ij) kullanılarak yapıldı ve GAPDH'ye normalize edilerek nispi protein ekspresyonu belirlendi. Katlama değişiklikleri, kontrol koşulunun değerlerine normalleştirildi.
RNA ekstraksiyonu. Toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) kullanılarak HKC-8 hücrelerinden veya fare böbreklerinden ekstre edildi. RNA miktarı ve kalitesi 260 nm'de bir Nanodrop-1000 spektrofotometresi (Thermo Scientific, Rockford, IL) ile belirlendi.
mRNA ifadesinin analizi. Ters transkripsiyon (RT), iScript™ cDNA Sentez kiti (Bio-Rad, Hercules, CA) kullanılarak 500 ng toplam RNA ile gerçekleştirildi. qRT–PCR, bir C1000 Termal Döngüleyicili (Bio-Rad, Hercules, CA) üreticinin talimatlarına göre. Üretici tarafından sağlanan CFX96 analiz yazılımı kullanılarak her amplifikasyon eğrisinden bir Ct değeri elde edildi. Göreceli mRNA ifadesi, 2 - ΔΔCt yöntemi [17] kullanılarak belirlendi. 18S geni normalizasyon amacıyla kullanıldı. mRNA kantifikasyonu için kullanılan primer dizileri şunlardı: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA-TAGCCACGCTCCG), COL1A1 (FW: TGCCGACT) GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCACTCCGCCCTA,GTCAGTATCGTATCGTATCGTATCGTCAGTCAGGCTGGGGGGTAGG). Katlama değişiklikleri, kontrol koşulunun değerlerine normalleştirildi.
miRNA ifadesinin miktar tayini. miRNA'ların ifadesinin miktar tayini, miRCURY Kilitli Nükleik Asit (LNA) miRCURY LNA RT Kiti (Exiqon, Geribildirim, Danimarka) kullanılarak yapıldı. RT'yi takiben cDNA şablonu, olgun miR150-5p veya miR-495-3p (Exiqon, Geribildirim, Danimarka) için mikroRNA'ya özgü LNA primerleri kullanılarak amplifiye edildi. qRT–PCR, üreticilerin talimatlarına göre iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) kullanılarak bir C1000 Termal Döngüleyicili 96-kuyucuklu Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Sisteminde gerçekleştirildi. . CFX Manager Bio-Rad yazılımı (Bio-Rad, Hercules, CA) kullanılarak her amplifikasyon eğrisinden üçlü kuyucuklar için bir Ct değeri elde edildi. Ct değerleri, endojen kontrol 5S rRNA'ya normalleştirildi. Plazma miRNA seviyeleri miR-103a-5p'ye normalleştirildi. Göreceli miRNA ekspresyonu, 2 - ΔΔCt yöntemi [17] kullanılarak belirlendi. Katlama değişiklikleri, kontrol koşulunun değerlerine normalleştirildi.
Böbrek fibrozunun fare modelleri. Fareler, tüm prosedürler için AB düzenlemelerine uygun olarak CBMSO'daki Spesifik Patojen İçermeyen (SPF) hayvan tesisinde barındırıldı. Hayvanlar, Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/EU sayılı Direktifinde yer alan Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak ele alınmıştır. Onay, Madrid'deki Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa"nın yerel etik inceleme kurulu, CSIC'deki Etik komitesi ve Comunidad de Madrid'den Hayvan Deneysel Prosedürleri Düzenleme Birimi tarafından verildi.
Tek taraflı üreter obstrüksiyonu (UUO): UUO cerrahi prosedürü daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [18]. Kısaca, farelere izofluran (indüksiyon için yüzde 3-5 ve bakım için yüzde 1-3) ile anestezi uygulandı ve iki deney grubuna ayrıldı: UUO grubu ve sahte operasyon grubu. UUO grubunda, farelerin karınlarının sol tarafı traş edildi, deriden bir neşter ile dikey bir kesi yapıldı ve cilt geri çekildi. Böbreği ortaya çıkarmak için peritondan ikinci bir kesi yapıldı. Sol üreter, cerrahi ipek ile renal pelvisin 15 mm altına iki kez bağlandı ve üreter daha sonra iki ligatür arasında kesildi. Daha sonra bağlanan böbrek nazikçe doğru anatomik pozisyonuna geri yerleştirildi ve sıvı kaybını yenilemek için steril salin eklendi. Kesikler dikildi ve fareler ayrı ayrı kafeslendi. Sham operasyonu benzer şekilde ama üreter ligasyonu yapılmadan yapıldı. Analjezik olarak buprenorfin kullanıldı. İlk doz ameliyattan 30 dakika önce ve ardından her 12 saatte bir 72 saat boyunca 0.05 mg/kg'lık bir dozda subkutan olarak uygulandı. Bu modelde renal kan akışı ve glomerüler filtrasyon hızı 24 saat içinde önemli ölçüde azalır ve interstisyel inflamasyon (2-3 günde pik), tübüler dilatasyon, tübüler atrofi ve fibroz 7 gün sonra belirginleşir. Tıkanmış böbrek, işlemden yaklaşık 2 hafta sonra maksimum işlev bozukluğuna ulaşır. Fareler aşırı CO2 dozu ile öldürüldü ve kontrol ve tıkalı böbrek ve kan örnekleri, UUO'dan 3, 5, 7, 10 ve 15 gün sonra PBS ile perfüzyondan sonra toplandı.
Folik asit ile indüklenen nefropati (FAN): Bu modelde, böbrek fibrozu, içinde çözünen kg vücut ağırlığı başına 250 mg folik asit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ile intraperitoneal (ip) enjeksiyonla indüklendi. 0.3 M sodyum bikarbonat (araç) daha önce tarif edildiği gibi [19]. Kontrol hayvanları, 0.3 ml araç (ip) aldı. Fareler aşırı CO2 dozu ile öldürüldü ve 15 günlük FA uygulamasından sonra PBS ile perfüzyondan sonra böbrekler ve kan örnekleri toplandı.
mikroRNA profilleme. Fibrotik sonucu düzenleyen spesifik miRNA'ları tanımlamak için, mikroRNA profili oluşturma platformu olarak bir Özel miRCURY LNA mikroRNA dizisi (Exiqon, Geri Bildirim, Danimarka) seçildi. Bu platform, Sanger miRBase v22.1'de (/microrn a.sanger.ac. Birleşik Krallık) bulunan fare miRNA'larına özgü toplam 175 benzersiz tahlilden oluşuyordu. Her bir mikroRNA için, analiz için hakim olan iplik seçilmiştir. MiR seçimi, böbrek fibrozu, mitokondriyal metabolizma, redoks süreçleri ve sirkadiyen ritim ile ilgili öngörülen hedef genlere dayanıyordu. Bu analiz, dizi bazlı miRNA hedef tahmini için biyoinformatik araçlarla yapıldı, mikrokozmos [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) ve miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). 7 günlük UUO böbrek örneklerinden RNA ekstraksiyonundan sonra, 20 ng toplam RNA'da bulunan miRNA fraksiyonu, üreticinin talimatlarına göre miRCURY LNA RT Kiti (Exiqon, Feedback, Danimarka) kullanılarak ters transkripsiyona tabi tutuldu. Elde edilen cDNA'lar, miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Geribildirim, Danimarka) kullanılarak bir Roche LightCycler 480 Real-Time PCR sisteminde miRCURY miRNA PCR Panelleri ile analiz edildi. Her numune iki kopya halinde analiz edildi. Bu prosedür Fundacion Parque Científico de Madrid'in (Madrid, İspanya) Genomik Tesisinde gerçekleştirilmiştir. Her bir miRNA için Cq değerleri (Cq) elde etmek için LC480 yazılımı kullanıldı. Delta Ct (ΔCt) değeri, Ct değerlerinin endojen temizlik snRNAU6'ya normalleştirilmesiyle hesaplandı. Isı haritası, ΔCt olarak sunulan gerçek zamanlı PCR verileriyle oluşturulmuştur. Hiyerarşik kümeleme, ΔCt değerlerine göre oluşturulmuştur. Delta Ct (ΔΔCt) değeri, referans numune grubunun (kontrol böbreği) ΔCt'sinin her tıkalı böbrek numunesinin ΔCt'sinden çıkarılmasıyla hesaplandı. Göreceli niceleme (RQ) veya her bir miRNA'nın kat değişimi, 2 - ΔΔCt yöntemi [17] kullanılarak üretildi. Diferansiyel olarak eksprese edilen miRNA'lar, parametrik Limma testi ile tanımlandı. Çoklu hipotez testlerini hesaba katmak için, Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı (FDR) düzeltmesi [25] kullanılarak P değerleri ayarlandı (sıf.). Sonuçlar bir yanardağ grafiğinde grafik haline getirildi.
CKD hastalarından alınan kan plazmasında miRNA analizi. Seçilen miRNA'ların seviyeleri, aşağıda ayrıntıları verilen 100 CKD hastası kohortundan alınan plazma örneklerinde analiz edildi. Periferik venöz kan, EDTA sprey kaplı vacutainer'larda (BD, Franklin Lakes, NJ) toplandı. Plazma elde etmek için kan 400 g'de 20 dakika santrifüjlendi, süpernatan yeni bir tüpe aktarıldı ve 800 g'de 20 dakika santrifüjlendi. Plazma toplandı ve alikuotlar içinde −80 °C'de dondurularak saklandı. Plazma miRNA, miRCURYTM RNA İzolasyon Kiti—Biofluids ve UniSp2 Spike-in RNA (Exiqon, Vedbaeck, Danimarka) kullanılarak kandan ekstrakte edildi. Bu numunelerdeki miR-150 seviyelerinin analizleri, miRNA ekspresyon prosedürünün nicelendirilmesi bölümünde açıklandığı gibi yapıldı. Oksijen tüketim hızı ölçümleri. Yağ asidi oksidasyonu ile ilişkili oksijen tüketim hızı (OCR) (oksidatif fosforilasyona bağlanır) ve hücre dışı asitleşme hızı (ECAR) (laktat üretimi ve glikoliz ile ilişkili), üreticinin talimatlarına göre Seahorse Bioscience metabolik analizörü kullanılarak incelenmiştir [26]. HKC-8 hücreleri bir p60 plakasına ekildi ve 48 saat sonra yüzde 70'lik bir birleşme noktasına ulaştıklarında yukarıda açıklandığı gibi mikroRNA transfeksiyonu yapıldı, HKC-8 hücreleri 10 ng/ml TGF{{ ile işlendi. 18}} 48 saat. Daha sonra hücreler, bir Seahorse Bioscience XFe24 hücre kültürü mikroplakasında (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) oyuk başına 2 x 104 hücre olacak şekilde tohumlandı. Hücre yapışmasından sonra, büyüme ortamı, substrat sınırlı bir ortam ile değiştirildi, Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), 0.5 mM Glikoz ve 1 mM Glutamat ile desteklendi. Tahlil ölçümünden bir saat önce hücreler, yüzde 0.2 karnitin takviyeli Krebs-Henseleit Tamponu (KHB) deney ortamı ile 37°C'de CO2 olmadan inkübe edildi. Testten on beş dakika önce CPT1 inhibitörü Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 µM karşılık gelen kuyucuklara ilave edildi ve hücreler 37 ◦C'de CO2'siz inkübe edildi. Son olarak, testten hemen önce BSA veya 200 μM Palmitate-BSA FAO Substratı (Agilent Technology, Santa Clara, CA, ABD) eklendi. Hemen, XF Hücre Mito Stres Testi, bir Seahorse XFe24 enerji analizöründe, sırayla birkaç mitokondriyal fonksiyon modülatörü eklenerek gerçekleştirildi. İlk olarak, bazal ölçümün ardından ATP sentaz inhibitörü oligomisin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 uM) kullanıldı. Bu, ETC'den elektron akışını azaltarak mitokondriyal solunumda bir azalmaya neden olur. Daha sonra, proton gradyanını çökerten ve mitokondriyal membran potansiyelini bozan ayırma maddesi siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 uM) eklendi. Sonuç olarak, ETC'den elektron akışı engellenmez ve kompleks IV tarafından oksijen tüketimi maksimuma ulaşır. Üçüncü ve son enjeksiyon, kompleks III ve I inhibitörlerinin anti-misin/rotenon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM) karışımıdır. Bu kombinasyon mitokondriyal solunumu kapatır ve mitokondri dışındaki süreçler tarafından yönlendirilen mitokondriyal olmayan solunumun hesaplanmasını sağlar. Substratlar/inhibitörler, deneyin yapıldığı aynı ortamda hazırlandı ve belirtilen zamanlarda reaktif portlarından otomatik olarak enjekte edildi. Ölçümler 3-dakikalık süreler için (toplam 2 saatlik bir süre boyunca) kaydedildi ve değerler toplam protein içeriği için normalleştirildi. Protein, yüzde 0.1 NP-40-PBS solüsyonu ile kuyulardan ekstrakte edildi ve bir BCA protein tahlili (Thermo Scientific, Rockford, IL) ile nicelendirildi. Her deney grubu için dört kuyu kullanıldı. Mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerini belirlemek için denizatı XFp Hücre Mito Stres Testi kullanıldı: bazal mitokondriyal solunum, ATP bağlantılı solunum, proton sızıntısı (-- ATP bağlantılı oksijen tüketimi), maksimum solunum, mitokondriyal olmayan solunum ve daha önce tarif edildiği gibi rezerv solunum kapasitesi [27].
Lusiferaz tahlili. İnsan CPT1A 3′-UTR'sindeki miRNA-150 ve miRNA-495 aday bağlanma bölgelerini karakterize etmek için, CPT1A 3′-UTR'yi (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, Product) içeren bir lusiferaz raportör tahlili ID S814347) kullanıldı. 3′ - UTR'ler içindeki tahmin edilen miR-150 ve miR-495 sitelerinin tohum bölgelerindeki siteye yönelik mutasyonlar, Multisite-QuikChange yönlendirmeli mutajenez kiti (Stratagene, La Jolla, CA) kullanılarak üretildi. üreticinin protokolüne. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACAGCATGAG), Tüm yapılar, uygun yapı olduklarını doğrulamak için kullanımdan önce dizildi. HKC-8 hücreleri ap24-kuyu plakasına ekildi ve 200 ng pLightSwitch_CPT1A_3′-UTR (sağlam veya mutasyona uğramış yapılar) ve 4 ile geçici olarak birlikte transfekte edildi. ng pGL3-Promoter (SV40 promotörünün kontrolü altındaki bir ateş böceği lusiferazı) (Promega Corporation, Madison, WI, ABD) raportör plazmitleri ve miR-150, miR'nin mimiklerinden herhangi birinin 40 nM'si mirVana™ miRNA -495 veya mirVana™ miRNA, yukarıda açıklandığı gibi yüzde 70'lik bir birleşme noktasına ulaştıklarında lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) kullanılarak negatif kontrolü (Ambion şirketi, ABD) taklit eder. Her deney grubu için dört kuyu kullanıldı. Lusiferaz deneyleri, 24 saat sonra Dual-Luciferase raportör sistemi (Promega, Madison, WI) kullanılarak yapıldı. Vanilya ve ateş böceği lusiferaz sinyalleri, bir Glomax çoklu algılama sistemi (Promega Corporation, Madison, WI, ABD) kullanılarak tespit edildi. Renilla lusiferaz aktivitesi, ateş böceği lusiferaz aktivitesi ile normalleştirildi.
Mitokondriyal membran potansiyeli (MMP). MMP'deki değişiklikler, tetrametilrodamin metil ester (TMRM) floresansındaki farklılıklar olarak belirlendi (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD). Negatif yüklü polarize mitokondride birikir ve turuncu renkte floresan verir. Apoptotik veya metabolik olarak stresli hücrelerde mitokondriyal membran potansiyeli çöktüğünde, TMRM reaktifi hücre sitozolü boyunca dağılır ve floresan seviyeleri önemli ölçüde düşer. HKC-8 hücreleri, hücre kültürü ve transfeksiyon prosedürü bölümlerinde tarif edildiği gibi kültürlendi ve transfekte edildi. Daha sonra, büyüme ortamı, 10 mM Hepes ile fenol kırmızısı içermeyen Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ile değiştirildi. 5 dakika boyunca oligomisin (5 uM) ve FCCP (4 uM) ile yapılan tedaviler, pozitif ve negatif kontrol koşulları olarak kullanıldı. Daha sonra hücreler 250 nM TMRM ile 37 oC'de 30 dakika boyunca boyandı. Hücreler tripsin ile toplandı, santrifüjlendi (3000 rpm, 5 dakika) ve pelet yüzde 1 ile 200 μL HBSS içinde yeniden süspanse edildi. Sığır Serumu Albümini (BSA) ve 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA). Floresan yoğunluğu, bir BD FacsCantoTM II sisteminde (BD Bioscience, San Jos, CA) TMRM (FL2) [28] için 570 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak akış sitometrisi ile ölçüldü ve FlowJo 10.2 yazılımı (FlowJo, LLC, Ashland) ile analiz edildi. , VEYA). Her deney koşulu için, en az 20.000 singlet üç kopya halinde analiz edildi.
Mitokondriyal süperoksit radikal anyon üretimi. Süperoksit radikal anyon üretiminin değerlendirilmesi, üreticinin talimatlarına göre canlı hücrelerde mitokondriyal süperoksit radikal anyonu için oldukça seçici bir florojenik boya olan Mito-SOX™ Red mitokondriyal süperoksit radikal anyon göstergesi (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak yapıldı. Talimatlar. HKC-8 hücreleri, hücre kültürü ve transfeksiyon prosedürü bölümlerinde tarif edildiği gibi kültürlendi ve transfekte edildi. Daha sonra, büyüme ortamı, 10 mM Hepes ile fenol kırmızısı içermeyen Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ile değiştirildi. Pozitif ve negatif kontrol koşulları olarak antimisin A (150 μM) ve karbonil siyanür m-klorofenilhidrazon (CCCP) (50 μM) ile 5 dakika muamele kullanıldı. Daha sonra hücreler, 37 °C'de 30 dakika boyunca 5 μM MitoSOX™ Red ile boyandı. Hücreler mitokondriyal membran potansiyeli bölümünde tarif edildiği gibi toplandı. Floresan yoğunluğu, bir BD FacsCantoTM II sisteminde (BD Bioscience, San Jos, CA) MitoSOX™ Red (FL2) için 580 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak akış sitometrisi ile ölçüldü ve FlowJo 10.2 yazılımı (FlowJo, LLC, Ashland, VEYA). Her deneysel koşul için en az 20,000 singlet üç kopya halinde analiz edildi.
Mitokondriyal etiketleme. Mitokondriyal içeriğin değerlendirilmesi, üreticinin talimatlarına göre mitokondriyal membran potansiyelinden bağımsız olarak plazma zarı boyunca pasif olarak yayılan ve aktif mitokondride biriken MitoTracker™ yeşil FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak yapıldı. HKC-8 hücreleri, hücre kültürü ve transfeksiyon prosedürü bölümlerinde tarif edildiği gibi kültürlendi ve transfekte edildi. Daha sonra, büyüme ortamı, 10 mM Hepes ile fenol kırmızısı içermeyen Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ile değiştirildi. Hücreler, 37 °C'de 30 dakika boyunca MitoTracker™ yeşil FM ile 150 nM ile boyandı. Akış sitometrisi analizi için hücreler, mitokondriyal membran potansiyeli bölümünde tarif edildiği gibi toplandı. Floresan yoğunluğu, bir BD FacsCantoTM II sisteminde (BD Bioscience, San Jos, CA) MitoTracker™ yeşil FM (FL1) için 516 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak ölçüldü ve FlowJo 10.2 yazılımı (FlowJo, LLC) ile analiz edildi. , Ashland, VEYA). Her deneysel koşul için en az 20,000 singlet üç kopya halinde analiz edildi. Floresan görüntüleme için çekirdekler ayrıca DAPI (Sigma, St. Louis, MO) ile oda sıcaklığında 5 dakika boyandı. Canlı hücreler, bir Hücre gözlemlenmiş, bir 63X/1.2 Su C-Apo-kromat Corr UV-VIS-IR M27 objektifi ile ters çevrilmiş bir Zeiss LSM 710 konfokal mikroskobu ile görselleştirildi ve Zeiss Zen2010B sp1 yazılımı (Zeiss, Oberkochen, Almanya) ile analiz edildi. .
Mitokondriyal kopya sayısı belirleme. Genomik DNA, üreticinin talimatlarına göre DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) kullanılarak HKC-8 hücrelerinden ekstrakte edildi. Mitokondriyal bolluk, İnsan Mitokondriyal DNA Kopya Sayısı Tahlil Kiti (Detroit R&D, Detroit, MI) ile belirlendi. Göreceli mtDNA kopya numarası, mtDNA-nükleer DNA oranı olarak sunuldu.
İnsan CKD hasta örnekleri. miRNA plazma düzeylerinin analizi için Principe de Asturias Hastanesi'nden 100 CKD hastasından (evre 3-4) oluşan bir kohort seçildi. 24 aylık bir süre boyunca GFR MDRD göstergesine [29] dayalı olarak böbrek işlevlerinin gelişimine göre sınıflandırılan iki farklı alt grubu içermiştir: 50 hasta, hastaların yüzde 10'undan azını sunmuştur.böbrekgeri kalanı böbrek fonksiyonunda en az yüzde 40'lık bir azalma yaşamış veyaböbrekyerine koyma tedavisi (diyaliz). Ayrıca fibrozisin derecesini de ölçtük.böbrekgreft disfonksiyonu olan 26 hastadan oluşan farklı bir kohorttan biyopsilerböbrekHastane Ramn y Cajal'dan nakil. Tüm biyopsiler Banff 2007 kriterlerine göre değerlendirildi [30].
İstatistiksel analiz. Veriler, belirtilenler dışında parametrik olmayan testler kullanılarak analiz edildi. İki bağımsız grup arasındaki fark Mann-Whitney testi ile incelenirken, ikiden fazla grup Kruskall-Wallis testi ile karşılaştırıldı. 0 P değeri.05 veya daha az istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0.001).="" veriler,="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca)="" kullanılarak="" analiz="" edildi.="" veriler,="" ortalama="" ±="" ortalamanın="" standart="" hatası="" (sem)="" olarak="" rapor="">
3. Sonuçlar
UUO kaynaklı fibrotikte miRNA ekspresyon verileriböbrekler. miRNA'ların metabolik düzenlemeye katkısını deşifre etmekböbrekfibrogenez, 7 günlük UUO modeli, WT farelerinde gerçekleştirildi. RNA, kontrol ve fibrotikten izole edildi.böbrekörnekler ve miRNA ifade profili, özelleştirilmiş bir mikroRNA dizisinde analiz edildi. miRNA'ların seçimi, "in silico" analizinden sonra mitokondriyal metabolizma, redoks süreçleri ve sirkadiyen ritimde yer alan anahtar enzimleri potansiyel hedeflemelerine dayanıyordu (daha fazla ayrıntı Yöntemler bölümünde). Isı haritası, fibrotik ve kontrolü karşılaştırırken bazı miRNA'larda açıkça farklı ifade kalıpları ortaya çıkardı.böbrekörnekler (Şekil 1A). Volkan grafiği analizi, 175 miRNA'nın 73'ünün, kontrollere kıyasla fibrotik böbrek örneklerinde 17 yukarı ve 56 aşağı regüle edilmiş, farklı olarak eksprese edildiğini gösterdi (Şekil 1B, Ek Tablo1). Bunların arasından böbrekteki fibrotik sonucu metabolik yollar aracılığıyla düzenleyebilen spesifik miRNA'lar seçildi. Bu amaçla, metabolik ve mitokondriyal fonksiyonlarda yer alan spesifik genlerin 3′UTR'sinin (çevrilmemiş bölge) siliko analizinde, CPT1A, TFAM, PGC1A üç bağımsız tahmin aracıyla (Targetscan, miRWalk ve miRanda) yapıldı. Seçim kriterleri ayrıca böbrek ekspresyon seviyesini, hedeflerin yeniliğini, metabolik yol hakkındaki bilgi derecesini ve biyolojik önemi içeriyordu. İnsan patolojisi, böbrek dokusu ekspresyon düzeyi, mitokondriyal metabolizmadaki rolleri ve yağ asidi mekik enzimi CPT1A'yı potansiyel olarak hedeflemeleri, bizi üç miRNA'ya odaklanmaya teşvik etti, miR-150-5p, miR-495-3p ve miR-33-5p, renal fibrogenez ile ilişkili metabolik değişiklikleri düzenleyebilen adaylar olarak (Şekil 1C). Not olarak, CPT1A 3′-UTR, miR-150 için bir tohum sitesi ve miR-495 için iki tohum sitesi içerir. miR-150 ve miR-495'nin, CPT1A 3′-UTR içeren bir lucif-deles haberci testinin aktivitesini sırasıyla ~ yüzde 15 ve yüzde 25 azalttığını gözlemledik. Bu aşağı regülasyon, miR-150 bağlanma bölgesi (PM2) için CPT1A'nın 3′-UTR'sindeki nokta mutasyonları (PM'ler) durumunda tamamen iptal edildi ve her iki miR-495 bağlanma bölgesinde (PM1) kısmen yok ve PM3) (Ek Şekil 1A ve B). Bu veriler, CPT1A'nın miR-150 ve miR-495 ile doğrudan etkileşimini gösterir. MiR-33-5p ayrı bir çalışmanın konusu olmuştur [15]. MiR-150-5p ve miR-495-3p, kontrol örneklerine kıyasla fibrotik böbrek örneklerinde 3,69 katlık bir değişiklikle yukarı doğru düzenlenmiştir (P-değeri: 0.012). ) ve 1,95 (P-değeri: 0,012), sırasıyla.
MiR-150 ve miR-495, insanda TGF-profibrotik yanıtı artırırböbrektübüler epitel hücreleri. UUO'da miRNA ekspresyon profili ile tanımlanan miR-150-5p ve miR-495-3p ifadesinin değişimini doğrulamak için kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT–PCR) yapıldı.böbrekörnekler (Şekil 2A ve B). Ek olarak, UUO prosedüründen 3, 5, 7, 10 ve 15 gün sonra böbreklerde miR-150-5p ve miR- 495-3p ekspresyonunun kinetiği qRT-PCR ile analiz edildi. Bu miRNA'ların ekspresyonu, UUO'dan 5 gün sonra 2-kat önemli ölçüde arttı ve UUO'dan 15 gün sonra yüksek kaldı (Şekil 2C ve D). Bu miRNA'ların ekspresyon seviyesi de folik asit nefropatisi (FAN) modelinde değerlendirildi. Fibrotikte sırasıyla miR-495-3p ve miR-150-5p'nin 4- ve 2-kat artışını bulduk.böbrekFAN modelinden örnekler (Şekil 2E). Fibrogenezin ana düzenleyicilerinden biri olan TGF- 1 ayrıca HKC-8 hücrelerinde miR-150 ve miR{3}} ifadesini 2-kattan fazla ve {{ 6}}sırasıyla, 48 saat sonra katlanarak, bu miRNA'lar için TGF-sinyalleme ile ilgili olaylarda potansiyel bir rolü destekler (Şekil 3A ve B). MiR-150 ve miR-495'nin tübüler epitel hücrelerinin TGF- 1 tarafından pro-fibrotik transformasyonuna dahil olup olmadığını değerlendirmek için, insan hücre dizisi HKC-8 miR ile transfekte edildi. -150-5p veya miR-495-3p ve farklı zamanlar için TGF- 1 ile tedavi edildi. Artan miR-150-5p ve miR-495-3p seviyeleri, fibrozis ile ilişkili işaretleyiciler Acta2, Col1 1 ve Fn1'in TGF- 1-indüklenen mRNA seviyesi ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdı ( Şekil 3C ve D). Benzer şekilde, miR-150-5p veya miR-495-3p'nin aşırı ekspresyonu, CPT1A'yı güçlü bir şekilde azalttı ve -SMA protein bolluğunu arttırdı (Şekil 3E ve F). Bu veriler, bu miRNA'ların hastalık patogenezine katılabileceğini düşündürmektedir.böbrektübüler hücrelerin TGF- 1-bağımlı epitelyal farklılaşmasını teşvik ederek ve ayrıca FAO'da yer alan kritik bir enzimin ekspresyonunu tehlikeye atarak fibrozis.
MiR-150 ve miR-495, mitokondriyal biyoenerjetik değişiklikleri indükler ve önemli mitokondriyal işlevde yer alan genlerin ekspresyonunu azaltır. miR-150-5p veya miR-495-3p uygulamasının neden olduğu metabolik sonuçlar hakkında fikir edinmek için, insan vücudunun biyoenerjetik profilini inceledik.böbrektübüler epitel hücreleri.
Şekil 1. UUO ile indüklenen fibrozda miRNA ekspresyon verileri. (A) Kontralateral ve obstrüksiyonun nispi miRNA ekspresyonunu gösteren ısı haritasıböbrekler7 gün boyunca UUO prosedürüne tabi tutulan C57/BL6-J fareleri (n=6). Ölçek çubuğu yeşilden kırmızıya (yüksekten düşüğe) değişir ve sayılar ΔCt değerlerini temsil eder. Sol tarafta, çalışma için seçilen miRNA'lar belirtilmiştir. (B) UUO ile modüle edilmiş miRNA'ların volkan arsa analizi. Log10 bağıl nicelik (RQ) ve negatif ( − ) log10 ayarlı (sıf.) P değerleri sırasıyla x ve y ekseninde çizilir. Her miRNA bir nokta ile temsil edilir. 175 miRNA'nın 73'ü fibrotik numunelerde değiştirilmiş bir ifade gösterdi (sıf. P-değeri Büyük veya 0.05'e eşit). Daha fazla analiz için seçilen miRNA'lar vurgulanır. (C) miR-150-5p ve miR-495-3p, CPT1A, TFAM ve PGC1A genlerinin in siliko hedeflemesi için güçleri temelinde seçilmiştir. Seçilen her bir mikroRNA için, bu genlerin 3'UTR'sindeki korunmuş tohum hedef bölgeleri, bunların kat değişimi ve önemi (sıf. P-değeri) belirtilir.
Şekil 2. miR-150-5p ve miR-495-5p'nin ifade seviyeleriböbreklerUUO ve FAN modellerinden. (A, B) miR-150-5p (A) ve miR-495- 3p (B) ifadesinin qRT-PCR analiziböbreklerDaha önce mikroRNA dizisi ile analiz edilen örneklerde UUO'dan 7 gün sonra farelerden. (C–E) FAN modelinden (C) ve 3, 5, 7, 10 ve 15 gün sonra miR-150-5p ve miR-495-3p ifadesinin qRT-PCR analizi miR-150-5p (D) ve miR{{10}}p (E) için UUO. Çubuk grafikler, grup başına 6 (A, B, E) ve 3 (C ve D) fareden elde edilen kat değişimi ifade düzeylerinin ± sem ortalamasını temsil eder. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" ilgili="" kontrol="" koşullarıyla="" karşılaştırıldığında;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01="" kontrole="">böbrekleraynı deneysel tedaviye sahip farelerden.
TGF- 1, pro-fibrotik ilişkili değişikliklerde yer alan model sitokin olarak kullanıldı. Bu hücrelerin biyoenerjetik durumunu belirlemek için, palmitat varlığında mitokondriyal aktiviteyi modüle eden bileşiklerle sıralı tedavi sırasında FAO ile ilişkili oksijen tüketim hızı (OCR) ve HKC-8 hücrelerinin hücre dışı asitlenme hızı (ECAR) ölçüldü. , bir Seahorse XF24 Hücre Dışı Akı Analizörü kullanarak (daha fazla ayrıntı Yöntemler bölümünde). TGF- 1 ile 48 saat sonra, miR-150-5p varlığında HKC-8 hücreleri bazal, ATP üretimine bağlı OCR, ATP bağlantılı solunum ve maksimal solunumda tutarlı bir azalma gösterdi. FCCP'ye duyarlı OCR ile ilgilidir (Şekil 4A). OXPHOS'taki bozulma, miR-150-5p'yi aşırı ifade eden HKC-8 hücrelerindeki ATP içeriğindeki bir azalma ile yansıtılmıştır (Şekil 4C). Bu miRNA'ların ECAR'da varyasyonları indüklediğini gözlemlemedik (veriler gösterilmemiştir). Bununla tutarlı olarak, mitokondriyallerinin mRNA ekspresyon seviyeleri
ilgili hedef genler CPT1A, PGC1 ve mitokondriyal transkripsiyon faktörü A (TFAM), miRNA mimik NC ile tedavi edilen hücrelere kıyasla miR-150 mimik ile tedavi edilen hücrelerde yarı yarıya azaldı (Şekil 4E). miR-495-3p ile aynı deneysel yaklaşımı kullanan çalışmalar benzer sonuçlar verdi (Şekil 4B, D, F). Bununla birlikte, mtDNA kopya numarası ve MitoTrackerTM yeşil FM ile mitokondriyal boyama ile belirlenen mitokondriyal kütle, hem bazal koşullarda hem de TGF tedavisi altında miRNA-150 ve miRNA- 495 tarafından önemli ölçüde modüle edilmedi. Bu parametrede temel olarak azalan bir eğilim gözlendi (Ek Şekil 2A, B, C). Genel olarak, bu veriler miR-150 ve miR-495'nin bir
mitokondriyal fonksiyonun bozulması yoluyla tübüler epitel hücrelerinde pro-fibrotik etki.
MiR-150 ve miR-495 mitokondriyal transmembran potansiyelini (ΔѰm) ve mitokondriyal süperoksit radikalini değiştirmez
Şekil 3. MiR-150 ve miR-495, insanda TGF- 1-bağımlı pro-fibrotik yanıtı artırırböbrektübüler epitel hücreleri. (A, B) 1{{24 ile tedavi edilen HKC-8 hücrelerinde miR{{0}p (A) ve miR-495-3p (B) ifadesinin RT–PCR analizi belirtilen süreler için }} ng/ml TGF- 1. (C, D) miR-NC ve mimik miR ile transfekte edilmiş hücrelerden alfa düz kas aktin ( -SMA), alfa 1 tipi-1 kollajen (Col1 1), fibronektin (FN) mRNA seviyeleri -150-5p (C) veya miR-495-3p (D), Sybr green kullanılarak qRT-PCR ile belirlendi. Hücreler, belirtilen yerlerde miRNA aşırı ekspresyonundan sonra TGF- 1 (10 ng/ml) ile işlendi (ayrıca yöntemler bölümüne bakın). (E, F) miR-NC ile transfekte edilmiş hücrelerde CPT1A ve -SMA seviyelerini gösteren immünoblotlar ve mimik miR-150-5p (E) veya miR{{20}}p (F) için belirtilen zaman noktaları. GAPDH normalleştirme amacıyla kullanıldı. Çubuk grafikler (sağ paneller), 3 bağımsız deneyden elde edilen kat değişimi ifadesinin ± sem ortalamasını temsil eder. *P < {{30}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" ilgili="" kontrol="" koşullarıyla="" karşılaştırıldığında;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001,="" aynı="" deneysel="" koşulla="" mir-nc="" ile="" tedavi="" edilen="" hücrelere="">
Şekil 4. MiR-150 ve miR-495, HKC-8 hücrelerinde TGF 1-indüklenen FAO baskısını arttırır. (A, B) ile transfekte edilmiş HKC-8 hücrelerinin oksijen tüketim oranı (OCR)
40 nM miR-NC ve miR-150-5p (A) veya miR-495-3p (B) taklit eder ve 10 ng/ml TGF'ye maruz kalır{{5} } miRNA aşırı ekspresyonundan sonra (ayrıca yöntemler bölümüne bakın). Çubuk grafikler (sağ paneller) bazal, proton sızıntısı, ATP bağlantılı, maksimum ve yedek kapasiteler ve mitokondriyal olmayan solunum durumları ile ilişkili OCR oranlarını gösterir. Veriler, protein miktarı ile normalizasyondan sonra temsil edilir. (C, E) miR-NC ve mimik miR-150-5p (C) veya miR-495-3p (E) ile transfekte edilmiş HKC-8 hücrelerindeki ATP seviyeleri. (D, F) miR-NC ve mimik miR-150-5p (D) veya miR-495-3p (F) ile transfekte edilmiş HKC-8 hücrelerinde CPT1A, PGC1A ve TFAM mRNA seviyeleri Sybr green kullanılarak qRT-PCR ile belirlendi. Çubuk grafikler, 4 bağımsız deneyin ortalama ± sem'sini gösterir. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" ilgili="" kontrol="" koşullarıyla="" karşılaştırıldığında;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001,="" aynı="" deneysel="" koşulla="" mir-nc="" ile="" tedavi="" edilen="" hücrelere="">
anyon üretimi. Proton pompaları (Kompleks I, III ve IV) tarafından üretilen mitokondriyal membran potansiyeli (ΔΨm), oksidatif fosforilasyon sırasında enerji depolama sürecinde önemli bir bileşendir. Artan ΔѰm mitokondriyal redoks pertürbasyonuna yol açarken, azalması ATP üretiminin azalmasına neden olarak hücre canlılığını tehlikeye atar [254]. Süperoksit radikal anyonu (O2•− ), ETC'nin birkaç adımında meydana gelebilecek elektron sızıntısının bir sonucu olarak mitokondride üretilebilen bir serbest radikaldir. Mitokondriyal matriks içinde O2•− üretimi de kritik olarak NADH/NAD plus ve CoQH2/CoQ oranlarına ve yerel O2 konsantrasyonuna bağlıdır [255]. Aşırı üretimi, AKI ve CKD dahil olmak üzere birçok patolojik durumla ilişkili bir durum olan farklı mekanizmalar yoluyla mitokondriyal redoks homeostazının kaybına yol açabilir [201]. ΔѰm, TMRM boyası ve süperoksit radikal anyon üretimi ile MitoSOX boyası ile incelenmiştir. İlk olarak, bu tahlilleri, insan hücre hattı HKC'de sırasıyla TMRM ve MitoSOX için sırasıyla TMRM ve MitoSOX için negatif kontroller olarak FCCP ve CCCP ve sırasıyla TMRM ve MitoSOX için pozitif kontroller olarak Oligomisin ve Antimisin A ile muamele ederek doğruladık{{7} }. TMRM testi durumunda, oligomisin tedavisi, kontrol boyasına kıyasla TMRM'nin floresan ortalamasında 3-katlık bir artışa neden olurken, FCCP tedavisi 9-katlık bir azalmaya neden oldu. Antimisin A ve CCCP, MitoSOX testinde sırasıyla 35-kat artış ve 2-kat azalma üretti (Ek Şekil 3A ve B). MiR-150 ve miR-495 mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerinin bu parametrelerdeki değişiklikleri tetikleyip tetiklemediğini belirlemek için, HKC-8 hücreleri bir miR-150-5p veya miR{{17} ile transfekte edildi. }p mimik veya ilgili miR-NC. Seçilen miR'ler ve miR-NC ile tedavi koşulları arasında TMRM veya MitoSOX problarının floresan nicelemesinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (Ek Şekil 3C).
MiR-150 ve miR-495 seviyeleri, KBH hastalarından alınan plazma ve böbrek örneklerinde etkilenmez. CKD'li hastalardan alınan plazma ve böbrek biyopsilerinde seçilen miRNA'ların ekspresyonunu değerlendirdik. 26 hastadan (Hospital Ramn y Cajal) alınan böbrek biyopsilerinin analizi, sırasıyla fibroz derecesi ile miR-150-5p ve miR-495-3p seviyeleri arasında bir korelasyon göstermedi (Ek Şekil 4A ve B) . İkisi arasında en yüksek böbrek ekspresyonuna sahip miRNA olan miR-150-5p'nin dolaşımdaki plazma seviyeleri de 100 CKD hastasından oluşan bir kohortta (Hospital Principe de Asturias) belirlendi. Numune mevcudiyetindeki sınırlamalar nedeniyle, bu kohortta miR- 495-3p serum değerlerini belirleyemedik. Bu hastalar daha önce 24 aylık bir süre boyunca böbrek fonksiyonlarının gelişimine dayalı olarak iki alt gruba ayrılmıştı, böylece 50 hasta böbrek fonksiyonlarında yüzde 10'dan daha az bozulma gösterirken, geri kalanı böbreklerinde en az yüzde 40'lık bir azalma yaşadı. işlev. miR-150-5p plazma seviyelerinin qRT-PCR nicelemesi, iki hasta alt grubunda farklı bir ifadeye doğru net bir eğilim göstermedi (Ek Şekil 4C).
4. Tartışma
Patofizyolojik süreçlerin kilit düzenleyicileri olarak miRNA'ların keşfi, böbrek hastalığı da dahil olmak üzere hemen hemen her klinik ortamda terapötik ajanlar olarak kullanımları üzerine araştırmaları teşvik etmiştir [31]. Renal fibrozis, etiyolojiden bağımsız olarak kronik böbrek hastalığının (KBH) oldukça yaygın bir sonucudur ve varlığı evrimin açık bir göstergesidir. Bu nedenle, böbrek fibrozu ile bağlantılı miRNA'ların tanımlanması için önemli bir çaba sarf edilmiştir [32,33]. Bu çalışmada, metabolik düzensizliğin giderek artan önemli rolüne odaklandık.böbrekzararve önceden bilinmeyen aktörler olan miR-150 ve miR-495 adlı iki miRNA belirledik. Ayrıca, TGF ile sinerji oluşturarak ve yağ ile ilgili temel metabolik yolları değiştirerek hücresel biyoenerjetik üzerinde derin bir etki sergilediklerini bulduk.asit oksidasyon.
Epitel hasarı yağ dokusunda bir defekt ile birlikte bulunur.asitoksidasyon, tübüler epitel hücreleri için ana enerji kaynağı [5]. Tübüler fonksiyon bozukluğunu indükleyen, hücre döngüsü durmasını tetikleyen ve interstisyel miyofibroblastların aktivasyonuna katkıda bulunabilecek kritik pro-fibrotik sitokinlerin salınımını teşvik eden farklılaşmalarına yol açar [5,34]. Farede MiR-150 ve miR-495 ifadesi artırıldıfibrotikböbreklerveinsan böbrekTGF- ile tedaviden sonra epitel hücrelerinin (HKC-8), pro-fibrotik yanıta dahil olduklarını düşündürür. İlgi çekici olan, miR-150 ve miR-495 kodlayan genomik bölgelerin in silico analizi, TGF-sinyallemesi ve UUO hasarına dahil olan diğer yollar ile ilgili transkripsiyon faktörleri için bağlanma bölgelerinin tanımlanmasına izin verir (aramalar miR-150 ve miR-495 için genecards.org). Hem miR-150 hem de miR-495, hedef genleri CPT1A, PGC1 ve TFAM'nin ekspresyon seviyesini azalttı; bu, tedaviden sonra azalmış bazal, ATP bağlantılı ve maksimal OCR ve ATP içeriğine yansıdı. miR-150 ve miR-495. Bu etkiye, HKC-8 hücrelerinde gelişmiş bir TGF-pro-fibrotik tepki eşlik etti. TGF-'nin mitokondriyal kütleyi ve mitokondriyal DNA'yı azalttığını bulduk. MiRNA-150 ve miRNA-495 ile tedaviden sonra, bazal koşullarda mitokondriyal içerikte anlamlılığa ulaşmasa da azalma eğilimi gözlendi. Bu, PGC1 veya TFAM'ın rolünden bağımsız bir mekanizmaya işaret eder ve büyük olasılıkla miRNA'ların varlığından etkilenen ana değişken olarak CPT1A aşağı regülasyonu ile bağlantılı bir metabolik etkiyle ilgilidir. Mitokondriyal biyoenerjetikteki değişiklikler böbrek hastalığında kritik öneme sahiptir [35]. Son zamanlarda, aşırı ekspresyonu böbrek fibrozundan koruduğu için CPT1A'nın sağlıklı bir tübüler bölmenin korunması için kritik bir enzim olduğunu gösterdik [6]. Ancak, PGC1
ve TFAM genleri de mitokondriyal fonksiyon ve biyogenez ile yakından ilişkilidir [36]. Bu genlerin bozulmuş ekspresyonu, CKD ile ilişkilidir ve korunması, çeşitli hasar modellerinde gösterildiği gibi böbrek bütünlüğüne katkıda bulunur. Böylece, Han ve ark. PGC1'in tübüler fonksiyon kazanımının fareleri Notch kaynaklı böbrek fibrozisine karşı koruduğunu ve bu modelle ilişkili mitokondriyal disfonksiyonu tersine çevirdiğini buldu [37]. Benzer şekilde, tübül hücrelerinde Tfam'ın yeniden ekspresyonu, Notch kaynaklı metabolik ve pro-fibrotik yeniden programlamayı önledi [38]. Bu nedenle, miR-150 ve miR-495 tarafından indüklenen bu mitokondriyal genlerin azalmış mRNA ekspresyonunun da hasarlı bir epitel fenotipine katkıda bulunduğu düşünülebilir.
Epitelyal hücre hasarı ile ilişkili OCR'de gözlemlediğimiz düşüş, miR-33 ve miR-9 ile yaptığımız çalışmalar da dahil olmak üzere önceki raporlarla uyumludur [15,16]. Kang ve ark. ayrıca böbrek fibrozunun insan ve fare modellerinde glukoz oksidasyonunun daha düşük olduğunu bildirmiştir [5], verilerimiz OCR'deki mikroRNA aracılı düşüşün ECAR'da kendiliğinden varyasyonları indüklemediğini göstermektedir, bu da fibrotik koşullarda glikolitik kapanmanın büyük olasılıkla aşağıdakilere bağlı olduğunu düşündürmektedir. Bozulmuş oksidatif fosforilasyondan ziyade fibrotik uyaranlar üzerinde. Arketip pro-fibrotik miRNA, miR-21 [39] dahil olmak üzere birkaç miRNA, mitokondriyal fonksiyonun ana değiştiricileri olarak tanımlanmıştır. miR-21 tarafından PPAR- ifadesinin baskılanması, bu miRNA'nın pro-fibrotik etkisini uyguladığı bir mekanizma olarak çağrılmıştır. FAO'yu inhibe etmeye ek olarak, miR-21 için hedef genler, bu miRNA'nın çok çeşitli mitokondriyal süreçleri susturduğunu gösterdi. Diğer örnekler arasında mir-9 [16], miR-33 [15] ve miR-30e [40,41] bulunur. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, böbrek fibrozu bağlamında CPT1A, PGC1 ve TFAM genlerinin mikroRNA düzenlemesini ele alan az sayıda rapor bulunmaktadır. İlginç bir şekilde, renal fibroz sırasında epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT) destekleyen microRNA-214, kolon kanseri hücrelerinde doğrudan TFAM'yi hedefler [42]. Bu baskı, miR-590-3p [43] için de rapor edildi. Organ fibrozunda ECM üretiminin en iyi karakterize edilmiş düzenleyicilerinden biri olan miR-29 ailesi, kardiyak homeostaziyi koruyarak doğrudan PGC1'i hedef alır. Bu nedenle, miR-29'in patolojik susturulması, kalp hastalığına katkıda bulunan mitokondriyal biyogenezde derin değişiklikler meydana getiren PGC1 upregülasyonuna yol açar [44]. Verilerimiz miR-150 ve miR-495'in böbrek fibrozisindeki rolünü açıkça desteklerken, bu iddiayı doğrulamak için daha fazla in vivo çalışma gerekli olacaktır.
Mitokondriyal elektron taşıma zincirinin (ETC) bütünlüğünü değerlendirmek için iki özelliğe odaklandık: ΔѰm ve süperoksit radikal anyon üretimi. miR-150 ve miR-495'nin bu parametreleri değiştirmediğini gözlemledik. Hücre canlılığı için kararlı bir ΔѰm gereklidir ve büyüklüğü hücre tipleri arasında değişir [45]. ΔѰm'deki bir artış redoks durumunda bozulmalara yol açabileceğinden, azalması ATP üretiminde bir azalmaya neden olduğundan ve apoptozu tetikleyebileceğinden, bakımı kesinlikle hassas bir şekilde ayarlanmıştır. Çalışmamızda, ΔѰm'deki değişiklikler katyonik floresan boya TMRM ile ölçülürken, mitokondriyal süperoksit radikal anyon üretimi florojenik boya MitoSOX Red ile ölçülmüştür. Bu araçların böbrek fonksiyonunu etkileyen durumlarda kullanılması literatürde dikkat çekici değildir. Bununla birlikte, çalışmamızda değişiklik olmaması karşısında, redoks hormesisini değerlendirmek için derinlemesine başka stratejiler izlemedik ve bu nedenle, bu miRNA'ların nükleofilik tonu veya çeşitli bileşenlerin işlevini değiştirebileceğini göz ardı edemeyiz. ETC.
Klinik ortamda, miR-150, TGF sinyalini modüle ederek lupus nefritinde pro-fibrotik bir miRNA olarak önerilmiştir [46,47], miR-495 ise diyabetik kalp hastalığında koruyucu bir rol ile ilişkilendirilmiştir. fibrozis [48]. KBH'ye potansiyel katılımlarını bulmak için iki farklı hasta kohortunda serum ve parankimal düzeylerini değerlendirdik. CKD progresyonu için potansiyel biyobelirteçler olarak miRNA'ların serum seviyeleri önerilmiştir [49,50]. Bu nedenle, idrar eksozomlarında serum dolaşımdaki miR-21 seviyeleri ve miR-29c bolluğu böbrek fibrozu ile koreledir, bu da biyolojik belirteçler olarak potansiyel rollerini ortaya koyar [51, 52]. Ancak miR-150 ve miR-495 seviyeleri, KBH hastalarından alınan plazma veya böbrek örneklerinde farklı değildi. Türler ve hücre tipleri arasındaki farklı mikroRNA ekspresyon paternleri, fibrotik dokudaki miR-150 ve miR-495 seviyelerindeki bu farklılık olmamasını açıklayabilir [53]. Bazı vakalarda rapor edilen mikroRNA plazma seviyeleri böbrek dokusundaki seviyeleri yansıtıyor olabilirken, miRNA'ların dolaşım sistemine salgılanması veya bu salgılamanın diğer organlar tarafından dengelenmesi ile ilgili diğer mekanizmalar da dikkate alınmalıdır [13,54].
Genel olarak, sonuçlarımız miR-150 ve miR-495'nin tanıtımını destekliyorböbrekepitelhücrebüyük olasılıkla CPT1A, PGC1 ve TFAM mitokondriyal fonksiyonla ilgili genlerin baskılanmasıyla iletilen enerji yoksunluğu yoluyla farklılaşma. Ayrıca, teşhis veya prognostik biyobelirteçler olarak potansiyel faydalarının yanı sıra in vivo rollerini sürdürmek için bir temel sağlarlar.
Yazar Katkıları
SL araştırmayı tasarladı ve yönetti. VM, deneylerin çoğunu tasarladı, gerçekleştirdi ve analiz etti. RR, microRNA dizi analizine yardımcı oldu. DRP ve LGB, iki farklı KBH hastası kohortunda çalışmalar yaptı. Tüm yazarlar sonuçların tartışılmasına yardımcı oldu ve SL ve VM makaleyi yazdı.
Rekabetçi çıkar beyanı
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkür
Bu çalışma, İspanya Bilim Bakanlığı SAF2015-66107-R ve PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/ 01513 (DRP) tarafından Avrupa Birliği tarafından ortak finanse edilen hibelerle desteklenmiştir. Bölgesel Kalkınma Fonu, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 ve RD16/ 0009/0016 (SL ve DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid "NOVELREN" B2017/BMD3751 (SL ve DRP), İspanyol Nefroloji Derneği'nden (Fundacin Senefro 2017) SL ve Fundacion'a bir hibeböbrekHepsi İspanya'dan "Iigo Alvarez de Toledo" (SL). CBMSO, Fundacion "Ramn Areces"ten kurumsal destek almaktadır. VM, İspanya Bilim Bakanlığı'ndan FPI Programının (BES- 2013-065986) doktora öncesi bursuyla desteklendi.