Herba Cistanches'in Statin Kaynaklı Miyotoksisite Üzerine Koruyucu Etkisi in Vitro
Mar 24, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
Elaine Wat a,b,1, Chun Fai Ng a,b,1, Chi Man Koon a,b, Eric Chun Wai Wong a,b, Brian Tomlinson c, Clara Bik San Lau a,b,n
Çin Tıbbı Enstitüsü, Hong Kong Çin Üniversitesi, Shatin, Yeni Bölgeler, Hong Kong
b Batı Çin'deki Fitokimya ve Bitki Kaynakları Devlet Anahtar Laboratuvarı, Hong Kong Çin Üniversitesi, Shatin, Yeni Bölgeler, Hong Kong
c Klinik Farmakoloji Anabilim Dalı, Tıp ve Tedavi Bölümü, Hong Kong Çin Üniversitesi, Shatin, Yeni Bölgeler, Hong Kong
Soyut:
Etnofarmakolojik alaka düzeyi: HerbaMesafeler(HC,Cistanche (Sistanşe)çölicolaveyaCistanche (Sistanşe)tubulosa) geleneksel olarak kas problemleri için kullanılan bir Çin bitkisidir. Önceki çalışmalar, HC ekstraktının kas hasarını azaltabileceğini ve egzersiz sonrası sıçanlarda ATP depolamasını iyileştirebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, statin kaynaklı kas toksisitesi üzerindeki etkisi hiç araştırılmamıştır.
Amaç:Bu çalışmanın amacı, HC'nin (HCE) sulu ekstraktının L6 sıçan iskelet kası hücrelerinde simvastatin kaynaklı toksisiteyi önleyip önleyemeyeceğini ve verbascosid'in etkilere katkıda bulunan ana biyoaktif bileşen olup olmadığını belirlemektir.
Gereç ve yöntemler:MTT, HCE (0-2000 mg / ml) veya verbascosidin (0-160 mM) 'nin simvastatin (10 mM) ile tedavi edilen L6 hücreleri üzerindeki etkilerini belirlemek için yapıldı. Ek V-FITC/PI apoptoz testi ve Kaspaz 3 testi, HCE'nin simvastatin kaynaklı hücre ölümü üzerindeki koruyucu rolünü belirlemek ve HCE'nin koruyucu etkisini kaspaz yolu boyunca uygulayıp uygulamadığını değerlendirmek için yapıldı. ATP üretimi, HCE'nin in vitro ATP üretiminde simvastatin kaynaklı azalmayı önleyip önleyemeyeceğini araştırmak için ölçüldü.
Sonuç -ları:Simvastatin, L6 hücrelerinde apoptotik hücre ölümünü önemli ölçüde arttırdı. HCE, muhtemelen bir kaspaz-3 yolu aracılığıyla, simvastatin ile indüklenen apoptotik hücreler üzerinde doza bağımlı bir azalma uyguladı. Simvastatin, HCE tarafından doza bağımlı olarak önlenen L6 hücrelerinde ATP üretimini azalttı. Simvastatin kaynaklı kas toksisitesinin korunması üzerinde sadece bir eğilim vardı, ancak verbascosidin (yüksek doz hariç) önemli bir etkisi yoktu.
Sonuç:Sonuç olarak, HCE'nin in vitro simvastatin kaynaklı toksisite üzerinde doza bağımlı koruyucu bir etki gösterebileceğini ilk kez gösterdik, bu da verbascoside varlığı nedeniyle olası değildi. Çalışmamız, simvastatin kaynaklı kas toksisitesi durumunda HC'nin potansiyel kullanımını önermiştir.
Anahtar kelime -ler:HerbaMesafeler, StatinKolesterol, Hiperlipidemi, Kas toksisitesi, Verbascoside, Kaspaz-3
1. Giriş
HMG-CoA redüktaz inhibitörleri (statinler), tarihte dünyanın en çok satan reçeteli ilaç sınıfı olarak, orta ve yüksek kardiyovasküler hastalık (CVD) riski olan farklı yaşlardaki her iki cinsiyetten hastalara faydalı olduğu iyi belgelenmiştir (Golomb ve Evans, 2008). Daha sonra pravastatin, atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pitavastatin, rosuvastatin ve simvastatin dahil olmak üzere farklı statinler klinik olarak geliştirildi ve onaylandı. Genel olarak, tüm statinler, kolesterol üretimini azaltmak için mevalonat yolunun erken evresinde HMG-CoA'nın mevalonik aside indirgenmesini inhibe ederek hareket eder (Kromer ve Moosmann, 2009; Thompson ve ark., 2003). Statinler genellikle iyi tolere edilmesine rağmen, en önemli ve iyi bilinen klinik yan etkilerden biri iskelet kası toksisitesidir (rabdomiyoliz) (Kobayashi ve ark., 2008). İskelet kası anormallikleri benign miyaljiden ciddi miyopatiye kadar değişebilir. Bir mekanizma karışımı önerilmiş ve statinin kas yan etkilerinden sorumlu olabilirken, mitokondriyal mekanizmaların önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır (Golomb ve Evans, 2008). Mevalonat sadece kolesterolün öncüsü değil, aynı zamanda selenoproteinler, dolikol ve ubikinon gibi diğer bileşikler için de geçerlidir (Kaufmann ve ark., 2006; Vaklavas ve ark., 2009). Bu nedenle, statinlerin mevalonatı inhibe etme yeteneği, anti-oksidatif savunma mekanizmasının korunmasında önemli enzimler olan glutatyon peroksidaz (GPx) gibi selenoproteinlerin üretimini de inhibe edecektir (Kromer ve Moosmann, 2009). Statinler ayrıca ubikinon tükenmesine yol açarak oksijen tüketiminin ve ATP sentezinin azalmasına neden olabilir (Beltowski ve ark., 2009). Ayrıca, artan in vitro ve in vivo çalışmalar, statinin, doza bağımlı bir şekilde Ca2þ-bağımlı membran geçirgenlik geçişini (MPT) indüklemek için doğrudan doku mitokondrisi üzerinde de etkili olabileceğini göstermiştir (Beltowski ve ark., 2009; Velho ve ark., 2006). Aynı zamanda artmış reaktif oksijen türleri (ROS) ve mitokondriyal oksidatif stres ile ilişkilidir, hücre ölümüne yol açar ve bu nedenle karaciğer ve kas hasarına katkıda bulunur (Beltowski ve ark., 2009; Velho ve ark., 2006).
HerbaMesafelerCistanche deserticola YC Ma'nın tüm kurutulmuş bitkisi veya Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (Orobanchaceae familyası), ağırlıklı olarak kuzey ve kuzeydoğu Çin'in çöl bölgelerinde yetişen paraziter bitkilerdir (Siu ve Ko, 2010).HerbaMesafeleröncelikle iktidarsızlık, kısırlık, erken boşalma gibi semptomlarla böbrek eksikliğini tedavi etmek için kullanılan Yang'ı canlandıran bir Çin tonik bitkisidir. Bitkinin ağır ve tıkayıcı doğası da bağırsakları nemlendirir ve kabızlığı hafifletmeye yardımcı olur. Aynı zamanda geleneksel olarak bel ve dizlerde ağrı için hastalara reçete edilen bir Çin bitkisidir ve kas problemlerinin tedavisi için Çin formülasyonlarında yaygın olarak kullanılan bir bitkidir (Siu ve Ko, 2010; Xiong ve ark., 1998). İlginçtir ki, bu aynı zamanda polisakkarit bakımından zengin ve feniletanoid bakımından zengin bir ekstraktın yorulma önleyici aktivitelerini gösteren modern bilimsel çalışmalarla da tutarlıdır.HerbaMesafelersıçanlarda kas hasarını azaltarak ve ATP depolamasını iyileştirerek egzersiz sonrası (Cai ve ark., 2010). Son çalışmalar, Herba Cistanches'in metanol ekstraktının mitokondriyal ATP üretimini artırabileceğini göstermiştir (Leung ve Ko, 2008). Siu ve Ko (2010) şunu gösterdi:HerbaMesafelerayrıca glutatyon sentezi ve GPx seviyelerine aracılık ederek mitokondriyal glutatyon durumunu artırabilir, böylece dokuları sıçanların kalplerindeki oksidatif stresten koruyabilir. Siu ve Ko (2010) da şunu gösterdi:HerbaMesafelermitokondriyal Ca2þ içeriğini azaltabilir, böylece Ca2þ'ye bağımlı MPT'yi azaltabilir. AyrıcaHerbaMesafelerAyrıca çeşitli organlarda güçlü bir antioksidan ve serbest radikal temizleyici olduğu, oksidatif stresi ve ROS aktivitelerini in vivo çalışmalarda azalttığı kanıtlanmıştır (Lu ve ark., 1995; Sui ve ark., 2011). Daha da ilginci, yorgunluk önleyici aktiviteye katkıda bulunan aktif fraksiyonu belirleme girişimindeHerbaMesafeler, verbascosid'in aktif fraksiyondaki ana bileşen olduğu bulunmuştur (Cai ve ark., 2010). Verbascosid'in, muhtemelen antioksidatif aktiviteleri nedeniyle kurbağalarda kas yorgunluğunu azalttığı da gösterilmiştir (Liao ve ark., 1999), verbascosid'in Herba Cistanches'in yararlı etkilerine katkıda bulunan biyoaktif bileşen olabileceğini düşündürmektedir.
Bu çalışmanın amacı, bitkisel Cistanches su ekstresi (HCE) kullanımının in vitro simvastatin tarafından indüklenen kas toksisitesini azaltıp azaltamayacağını belirlemektir. HCE kullanımının, simvastatinin neden olduğu kas toksisitesinin yan etkilerini düzeltebileceği varsayılmıştır. Yararlı etkilerinin olup olmadığını belirlemek için de bir girişimde bulunuldu.HerbaMesafelerverbascoside varlığına atfedilir.
2. Gereç ve yöntemler
2.1. Bitkisel materyallerin doğrulanması ve hazırlanması
Hammaddesi bitkiselHerbaMesafelerGuangzhou, Çin'deki ünlü bir tedarikçiden satın alındı.HerbaMesafelerÇin Farmakopesi (CP), 2010'a uygun olarak ince tabaka kromatografisi (TLC) kullanılarak, kimyasal belirteçler olarak verbascoside ve ekikosid ile kimyasal olarak doğrulanmıştır (veriler gösterilmemiştir). Kimyasal kimlik doğrulama üzerine, herbaryum kuponu örneğiHerbaMesafelerHong Kong Çin Üniversitesi (CUHK) Çin Tıbbı Enstitüsü Müzesi'ne 2014-3434 numaralı kupon örneği ile yatırıldı.
Kısaca, 1 kg ham bitki 1 saat ıslatıldı, ardından her ekstraksiyon için 10 damıtılmış su kullanılarak 100 ° C'de reflü altında 1 saat ısıtılarak iki kez ekstraksiyon yapıldı. Sulu ekstraktlar (HCE) birleştirildi ve filtrelendi. Filtrasyon, 60 ° C'de azaltılmış basınç altında yoğunlaştı. Konsantre ekstrakt kuruluğa liyofilize edildi. Verim yüzdesi w / w% 50.1 idi. Ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) kullanılarak verbascoside ve ekikosid miktarını belirlemek için az miktarda kullanıldı. Ekstrakte edilen tüm tozlar vakumla paketlendi ve kullanıma kadar saklandı.
2.2. Sulu ekstraktın UPLC analizi
UPLC analizleri Waters Acquity Ultra Performance LC Sistemi (Waters, ABD) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. UPLC analizleri için gerekli tüm çözücüler, Hong Kong Çin Üniversitesi Kimya Bölümü'nden satın alındı. Verbascoside ve echinacoside, Çin Ulusal Farmasötik ve Biyolojik Ürünlerin Kontrolü Enstitüsü'nden satın alındı. Numune çözeltisi, Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Ön Sütunu (5-2.1 mm2 i.d., partikül boyutu 1.7 mm) ile Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Ön Kolonu (5-2.1 mm2 i.d., partikül boyutu 1.7 mm) içine enjekte edildi. Tüm çözücüler 0,45 mm Millipore filtre diski (Millipore) ile önceden filtrelenmiş ve gazdan arındırılmıştır. Gradyan elüsyonu, aşağıdaki çözücü sistemler kullanılarak gerçekleştirildi: mobil faz A - asetonitril; mobil faz B – çift damıtılmış su / formik asit (99.9 / 0.1; v / v). Elüsyon aşağıdaki gibi bir gradyan prosedürü ile gerçekleştirildi: 0-5 dakika,% 88 B; 5–10 dakika, %88 B'den %83 B'ye kadar. Kullanılan debi 0.4 ml/dak idi ve CP'ye (2010) uygun olarak 331 nm'de tespit yapıldı. Her numune (5 μl), 0,2 mm'lik bir filtre diskinden filtrasyondan sonra kolona enjekte edildi. Kimyasal belirteçlerin tanımlanması, bilinmeyen piklerin tutma süreleri ve UV absorbansı standartlarınkilerle karşılaştırılarak gerçekleştirildi. Bir kalibrasyon eğrisi, niceleme için bir dizi verbascoside ve ekikosid konsantrasyonu (40, 20, 10, 5, 2.5 ve 1.25 mg / ml) ile çizildi. Bitkisel ekstrakt içinde verbascoside ve ekikosidin nicelleştirilmesi üçlü olarak gerçekleştirildi. Sistem, veri toplama, entegrasyon ve analiz için Waters MassLynx Yazılımı ile donatılmış bir bilgisayar tarafından izlendi.
2.3. Hücre kültürü
L6 sıçan iskelet kası hücre hattı, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC, Manassa, VA, ABD) satın alındı. Hücreler, Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamında (DMEM, ATCC, Manassas, VA, ABD) subkonfluent yoğunlukta tutuldu,% 10 v / v fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin (P / S) ile desteklendi ve% 5 CO2 ve% 95 hava içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edildi.
HCE'nin statin kaynaklı kas toksisitesi üzerindeki etkilerini belirlemek için, L6 hücreleri, toksisiteyi indüklemek için 48 saat boyunca 10 μM'de simvastatin ile muamele edildi. HCE (0, 250, 500, 1000 ve 2000 μg / ml konsantrasyonlarında) veya verbascoside (0, 20, 40, 80 ve 160 μM konsantrasyonlarında), bitkisel ekstraktın iskelet kası hücrelerinde statin kaynaklı toksisitesini önleyip önleyemeyeceğini ve verbascosidin bitkisel sulu ekstrakt ile benzer koruyucu etkiler gösterip gösteremeyeceğini belirlemek için bir statin ile birlikte tedavi olarak eklenmiştir.
Herba Cistanche ekstresi in vitro simvastatin kaynaklı toksisite üzerinde koruyucu etki
2.4. İn vitro sitotoksisite
L6 hücreler (1x10)5/well) bir gecede 96 kuyucuklu düz tabanlı kültür plakalarına (Iwaki, Japonya) tohumlandı, ardından 48 saat boyunca çeşitli HCE dozları (0-2000 μg / ml) veya verbascoside (0-160 μM) ile birlikte veya olmadan 10 μM simvastatin ile muamele edildi. Kontrol kuyularına düz ortam (DMEM) eklendi. Bitkisel ekstrakt ve bileşik DMEM'de çözüldü.
48 saatlik tedaviyi takiben, tüm hücrelerden alınan ortam atıldı ve 30 μl 5 mg / ml 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil-tetrazolyum bromür (MTT; Sigma, ABD) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde her bir kuyucuğa ilave edildi ve plakalar 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edildi. Süpernatant daha sonra çıkarıldı ve mor formazan kristallerini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. ABD) çözmek için her bir kuyucuğa 100 μl DMSO eklendi. Her numunenin absorbansı bir mikroplaka okuyucu (Biotek μ-Quant, ABD) kullanılarak 540 nm'de okundu. Sonuçlar, kontrol hücrelerine göre MTT absorbans yüzdesi olarak ifade edildi.
2.5. Ek-V FITC/PI boyama testi
L6 hücreleri (3 x10)5/well) simvastatin ile birlikte, çeşitli HCE veya verbascoside dozları olsun veya olmasın tedavi edildi. Hücreler daha sonra üreticinin protokolüne (Trevigen, MD, ABD) göre ekin-V FITC kiti ile toplandı, yıkandı ve boyandı. Kısaca, hücreler 1 x bağlayıcı tamponla iki kez yıkandı ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karanlıkta 1 μl annexin-V FITCconjugate ve 10 μl PI içeren 100 μl etiketleme çözeltisinde inkübe edildi. Örneklerin floresansı akış sitometrisi ile tespit edildi (Becton Dickinson FACSCanto II, ABD).
2.6. Kaspaz 3 aktivite testi
Kaspaz 3 aktivitesi, üreticinin talimatına göre florometrik, immünosorbent enzim testi (Sigma) kullanılarak belirlendi. Kısaca, simvastatin ile muamele edilen L6 hücreleri (3 105 / iyi), çeşitli HCE verbascoside dozları ile birlikte veya HCE verbascoside olmadan lizis tamponu kullanılarak lize edildi. Substratın Kaspaz 3 tarafından proteolitik bölünmesi yoluyla üretilen serbest 7-amino-4-metilkumarin (AMC), 360 nm'de uyarma dalga boyu ve bir BMG FLUOstarOptimamicroplate okuyucu (BMG LABTECH GmbH, Almanya) ile 460 nm'de emisyon dalga boyu ile florometrik olarak ölçüldü ve ölçüldü.
2.7. Hücresel ATP testi
L6 hücreler (3x10)5/well) simvastatin ile birlikte, çeşitli HCE veya verbascoside dozları olsun veya olmasın tedavi edildi. Tedaviyi takiben, hücreler toplandı ve ATP içeriği, lize hücrelerin gliserol fosfat içeriğinin ölçülmesi ve bir mikroplaka okuyucu (Biotek μ-Quant, ABD) kullanılarak 570 nm'de okunmasıyla ticari olarak temin edilebilen kolorimetrik kit (Abcam, İngiltere) kullanılarak ölçüldü. ATP üretiminin ölçümü, kontrol grubuna göre yüzde olarak ifade edildi.
2.8. İstatistiksel analiz
Veriler ortalama7SD, Prism 5 for Window(version 5.0c, GraphPad Software, Inc., USA) olarak istatistiksel analiz için kullanıldı. Tüm gruplar arasındaki anlamlı farklılıklar tek yönlü ANOVA ile değerlendirildi ve bunu Bonferroni'nin MultipleComparison Testi izledi. Po0.05 olasılığı istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
3. Sonuçlar
3.1. Herba Cistanches sulu ekstraktının UPLC analizi
Incir. S1A, ekikosid ve verbascoside içeren standart bir karışımın UPLC profilini gösterdi. Bu belirteçlerin her birinin tutma zaman noktaları,HerbaMesafelersulu ekstrakt (Şek. S1B). İçindeki ekikosid ve verbascoside miktarıHerbaMesafelersulu ekstraktın sırasıyla %0.45 w/w ve %0.085 w/w olduğu saptandı.
3.2. HCE ve verbascosid'in L6 iskelet kası hücrelerinde simvastatinin in vitro sitotoksisitesine etkisi
Şekil 1A'da gösterildiği gibi, simvastatin, 10 mM simvastatin'de L6 hücrelerinin yaşayabilirliğindeki önemli azalmanın yansıttığı gibi, L6 hücrelerine önemli sitotoksisiteye neden olmuştur. HCE tedavisi doza bağımlı ve önemli ölçüde simvastatin kaynaklı sitotoksisiteyi 500, 1000 ve 2000 mg / ml'de önlemiştir. Verbascoside, simvastatin ile birlikte tedavi edilen L6 hücrelerinin yaşayabilirliğini artırmak için bir eğilim uyguladı. Bununla birlikte, konsantrasyonların hiçbiri istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır (Şekil 1B).
Şekil 1. (a) HCE'nin koruyucu etkisi; ve (b) L6 hücrelerinde simvastatin kaynaklı sitotoksisite üzerinde verbascosid. Değerler means7SD'yi (n1/43) temsil eder. Tek başına simvastatin tedavisi ile Student'ın t-testini kullanan kontrol grubu arasında anlamlı bir fark: ### po0.001. Tek yönlü ANOVA kullanılarak HCE verbascoside birlikte tedavisi olan veya olmayan tüm simvastatin ile tedavi edilen gruplar arasında anlamlı fark: ** po0.01,*** po0.001.
3.3. HCE ve verbascosid'in L6 iskelet kası hücrelerinde simvastatin kaynaklı hücre ölümü üzerine etkisi
Simvastatin tarafından indüklenen hücre ölümünün modunu incelemek ve simvastatin kaynaklı hücre ölümü üzerinde HCE veya verbascosidin koruyucu rolünü belirlemek için, apoptotik hücrelerin oranı propidium iyodür (PI) boyama ile tespit edildi. Sonuçlar, simvastatinin, kontrol grubuna kıyasla erken apoptotik hücrelerin (Ek V-FITC pozitif ve PI negatif, Q4-2) ve geç apoptotik / ölü hücrelerin (Ek V-FITC pozitif ve PI-pozitif, Q2-2) oranında anlamlı bir artışa neden olduğunu göstermiştir. HCE ile birlikte tedavi, erken apoptotik ve geç apoptotik / ölü hücrelerin oranını doza bağımlı bir şekilde 1000 mg / ml'ye kadar azaltmıştır (Şekil 2A). Bu koruyucu etki, verbascoside birlikte tedavi gruplarında da gözlenmiştir. Bununla birlikte, test edilen konsantrasyonların hiçbiri istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır (Şekil 2B).
Şekil 2. HCE veya verbascoside birlikte tedavi olsun veya olmasın simvastatinin L6 hücrelerinde fosfatidilserin dışsallaşması üzerine etkisi. Hücreler Annexin-V FITC ve I ile boyandı ve akım sitometrisi ile tespit edildi.
3.4. Simvastatin ile tedavi edilen L6 iskelet kası hücrelerinde HCE ve verbascosid'in kaspaz 3 aktivitesi üzerine etkisi
Şekil 3A'da gösterildiği gibi, 10 mM simvastatin, L6 hücrelerinde önemli ölçüde kaspaz 3 aktivitesini indükledi, bu da simvastatinin kaspaz kaskadı yoluyla L6 hücrelerine apoptozu indüklediğini düşündürdü. Bununla birlikte, simvastatin ve HCE ile birlikte tedavi edilen L6 hücrelerinde, HCE dozuna bağımlı ve önemli ölçüde kaspaz 3 aktivitesini azaltmıştır, bu da HCE'nin kaspaz kaskadı yoluyla simvastatin kaynaklı apoptozu önleme yeteneğini düşündürmektedir. Öte yandan, verbascosid, kaspaz 3 enzim aktivitesindeki simvastatin kaynaklı artışı azaltmak için bir eğilim göstermesine rağmen, sadece 160 mM'deki konsantrasyon istatistiksel anlamlılığa ulaşmıştır (Şekil 3B).
Şekil 3. (a) HCE'nin koruyucu etkisi; ve (b) L6 hücrelerinde simvastatin kaynaklı kaspaz 3 enzimatik aktivitesi üzerinde verbascosid. Değerler means7SD'yi (n1/43–5) temsil eder. Tek başına simvastatin tedavisi ile Student'ın t-testini kullanan kontrol grupları arasında anlamlı bir fark: ###po0.001. HCE veya verbascoside ile birlikte tedavi edilen veya olmayan tüm simvastatin ile tedavi edilen gruplar arasında tek yönlü ANOVA kullanılarak anlamlı fark: * po0.05, **p o0.01, ***po0.001.
3.5. HCE'nin L6 iskelet kası hücrelerinde ATP üretiminde simvastatin kaynaklı azalma üzerine etkisi
Simvastatin (10 mM), L6 hücrelerinde ATP üretimini kontrol grubuna kıyasla yaklaşık% 60 oranında önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 4A). HCE ko-tedavi dozuna bağımlı olarak, simvastatin ile muamele edilen hücrelerde ATP üretimindeki azalmayı zayıflattı, bunlardan sadece 500, 1000 ve 2000 mg / ml'deki konsantrasyonlar istatistiksel anlamlılığa ulaşmıştı. Öte yandan, verbascoside, ATP üretimini 50 mg / ml'de geri kazanma eğilimi göstermesine rağmen, istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır (Şekil 4B).
Şekil 4. (a) HCE ve (b) verbascosid'in L6 hücrelerinde ATP üretiminde simvastatin kaynaklı azalma üzerine koruyucu etkisi. Değerler means7SD'yi (n1/43–5) temsil eder. Tek başına simvastatin tedavisi ile Student'ın t-testini kullanan kontrol grupları arasında anlamlı bir fark: ###po0.001. Tek yönlü ANOVA kullanılarak HCE veya verbascoside birlikte tedavisi olan veya olmayan tüm simvastatin ile tedavi edilen gruplar arasında anlamlı fark: * po0.05, **po0.01.
4. Tartışma
Tüm dünyada kardiyovasküler hastalık (KVH) prevalansının artması ve hiperkolesterolemi tanısı alan hastalarla statin kullanımı daha yaygın hale gelmiştir. Statinler genel olarak çok iyi tolere edilmesine rağmen, kas hasarı, ilacın başlatılmasından haftalar veya aylar sonra akut olarak ortaya çıkabilen, statin kullanımı ile ilişkili sıklıkla bildirilen bir yan etkidir (Fine, 2003). Kas semptomları, kreatin kinaz (CK) yükselmesi olan veya olmayan ağrı, hassasiyet veya zayıflık gibi hafif problemlerden, rabdomiyolizin en şiddetli durumuna kadar değişebilir (Armitage, 2007; Hu ve ark., 2012). Bu yan etkilerin ortaya çıkması ve statine bağlı kas toksisitesi için etkili bir tedavi bulunmaması nedeniyle, statinler az kullanılmaya devam etmektedir. Bir telefon görüşmesi yoluyla yapılan 10.409 Fransız denek üzerinde yapılan geniş bir ankette, statin tedavisi alan hastaların% 10'u kas semptomları bildirmiş ve bu semptomatik hastaların% 30'u tedavinin kesilmesiyle sonuçlanmıştır (Rosenbaum ve ark., 2013).
İlk defa su ekstraktınınHerbaMesafelerYaygın olarak kullanılan geleneksel bir Çin bitkisi, in vitro in L6 iskelet kası hücrelerinin simvastatin kaynaklı toksisitesine karşı koruyucu bir etki gösterebilir, bu daHerbaMesafelerStatin kaynaklı kas toksisitesi için koruyucu rolü nedeniyle sulu ekstrakt (HCE), statin alan hastalarda bilinen yaygın bir yan etkidir. HCE'nin statin kaynaklı kas toksisitesine karşı koruma sağlama konusundaki güçlü yeteneği bu nedenle büyük bir potansiyele sahip olacaktır.
TCM'deki geleneksel teoriye göre, Yang vücuttaki mitokondriyal enerji metabolizması ile ilgilidir ve Yang'ı canlandıran bitkilerin reçetesinin mitokondriyal ATP üretimini arttırdığı bulunmuştur (Ko ve Leung, 2007). İlginç bir şekilde, simvastatin ile tedavi edilen L6 iskelet kası hücrelerinde ATP üretiminde bir azalma gözlemledik ve ATP üretimindeki bu azalma HCE birlikte tedavisi ile önemli ölçüde iyileştirildi. Çalışmamızda, L6 sıçan iskelet kası hücrelerini kullanarak, simvastatinin neden olduğu hücre canlılığında bir azalma olduğunu gösterdik. Hücre canlılığındaki bu azalma, birlikte tedavi ile önemli ölçüde iyileştirilmiştir.HerbaMesafelerdoza bağımlı bir şekilde. Statin kaynaklı kas toksisitesinin kesin mekanizması tam olarak aydınlatılamamış olsa da, sağlıklı iskelet miyositlerinin statin kaynaklı apoptozunun, statin kullanıcıları tarafından yaşanan en yaygın yan etki olan miyopatiye neden olan katkıda bulunan bir faktör olduğu öne sürülmüştür (Dirks ve Jones, 2006). Çalışmamızda, simvastatin tarafından indüklenen apoptotik hücrelerde anlamlı bir artış gözlemledik, bu da önemli ölçüde artmış kaspaz 3 aktivitesi ile ilişkiliydi. Bu veriler ayrıca, çeşitli statinlerin iskelet miyoblastlarında, miyotüplerde ve diferansiye primer insan iskelet kası hücrelerinde kaspaz-9 ve kaspaz-3 aktivitelerinin aktivasyonu yoluyla apoptozu indükleyebileceğini gösteren önceki çalışmalarla da tutarlıdır (Dirks ve Jones, 2006). HCE'miz, kaspaz-3 aktive apoptozunda simvastatin kaynaklı bu artışı doza bağımlı bir şekilde önleyebildi.
HerbaMesafeler
Ayrıca, önceki literatür, verbascoside'ın içindeki başlıca aktif bileşenlerden biri olduğunu öne sürdü.HerbaMesafeler. Akteosid olarak da bilinen verbascoside, suda çözünebilen doğal olarak oluşan bir polifenolik bileşik grubu olan feniletanoid glikozitlerin üyesine aittir (Liao ve ark., 1999). Daha önce, verbascosid'in güçlü ROS-süpürücü ve antioksidatif aktiviteler sergileyebilen güçlü bir antioksidan olduğu gösterilmiştir (Liao ve ark., 1999). Çalışmamızda, verbascosid'in HCE'mizde gözlenen yararlı etkilere katkıda bulunan ana bileşen olup olmadığını belirlemek için, verbascosid'in etkilerini 0-160 mM konsantrasyonlarında test ettik. HCE'mizin 250-2000 mg / ml konsantrasyon aralığında aktif olduğunu gösterdiğimizden, HCE'mizin% 0.085 wt / wt konsantrasyonunda verbascoside içerdiğini öne süren HPLC sonuçlarımıza dayanarak, verbascosid'in aktif konsantrasyonu 0.2125-1.7 mg / ml (yani 0.34-2.72 mM) arasında değişmelidir, verbascoside aktif bileşen olmalı mıdır? Bununla birlikte, test edilen konsantrasyon aralığı ile verbascosidin önemli bir yararlı etkisini gözlemleyemedik, ancak verbascosidin L6 iskelet kası hücreleri üzerinde yararlı bir etkisi için doza bağımlı bir eğilim gözlemledik. Bu veriler, L6 iskelet hücrelerinde gözlenen HCE'mizin yararlı etkisinin, yalnızca verbascosidin etkisine atfedilmesinin muhtemel olmadığını, verbascoside dışındaki bileşenlerin gözlemlenen faydalı etkilerden sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. Verbaskosidin, yararlı etkilere katkıda bulunmak için ekstrakt içindeki diğer biyoaktif bileşiklerle etkileşime girmesi de mümkündür. Biyotahlil rehberliğinde fraksiyonasyon kullanan ek deneyler, HCE'nin simvastatin kaynaklı kas toksisitesi üzerindeki gözlemlenen koruyucu etkilerine katkıda bulunmaktan sorumlu biyoaktif bileşenlerin keşfi konusunda daha fazla bilgi sağlamada yararlı olacaktır.
Sonuç olarak, bu çalışma, HCE'nin in vitro kas hücresi canlılığında simvastatin kaynaklı azalma üzerinde güçlü koruyucu etkiler gösterebileceğini göstermektedir. Bu sonuçlar, HC sulu ekstraktımızın fonksiyonel bir gıda olarak terapötik değere sahip olabileceğini veya statin kaynaklı miyotoksisite nedeniyle statin tedavisinden çekilmesi gereken hiperlipidemik hastalara nutrasötik olabileceğini düşündüren ön kanıtları sunmaktadır.
TeşekkürBu çalışma, Gıda ve Sağlık Bürosu HKSAR, Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu no. 11120831 tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
Başvuru
Armitage, J., 2007. Klinik uygulamada statinlerin güvenliği. Lancet 370, 1781–1790.
Beltowski, J., Wojcicka, G., Jamroz-Wisniewska, A., 2009. Statinlerin olumsuz etkileri – mekanizmalar ve sonuçlar. Kıvırcık. İlaç Güvenli. 4, 209–228.
Cai, R.L., Yang, M.H., Shi, Y., Chen, J., Li, Y.C., Qi, Y., 2010. Cistanche deserticola'dan feniletanoid bakımından zengin ekstraktın antiyorulma aktivitesi. Fitoter. Res. 24, 313–315.
Dirks, A.J., Jones, K.M., 2006. Statine bağlı apoptoz ve iskelet miyopatisi. . J. Physiol. Hücre Fizyol. 291, C1208–C1212.
Fine, D.M., 2003. Statin ile ilişkili kas toksisitesi. Clin. Farmakol. 3, 554.
Golomb, B.A., Evans, M.A., 2008. Statin yan etkileri: mitokondriyal mekanizma için literatürün ve kanıtların gözden geçirilmesi. . J. Kardiyovaş. İlaçlar 8, 373–418.
Hu, M., Cheung, B.M., Tomlinson, B., 2012. Statinlerin güvenliği: bir güncelleme. Ther. Av. İlaç Güvenli. 3, 133–144.
Kaufmann, P., Torok, M., Zahno, A., Waldhauser, K.M., Brecht, K., Krahenbuhl, S., 2006. Statinlerin sıçan iskelet kası mitokondrisi üzerindeki toksisitesi. Hücre. Mol. Life Sci. 63, 2415–2425.
Ko, K.M., Leung, H.Y., 2007. Çin Yang ve Yin tonlaştırıcı otlar tarafından ATP üretim kapasitesinin, antioksidan aktivitenin ve immünomodülatör aktivitelerin arttırılması. Çene. Med. 2, 3.
Kobayashi, M., Kagawa, T., Narumi, K., Itagaki, S., Hirano, T., Iseki, K., 2008. Statinlere bağlı kas hasarında önleyici bir yol olarak bikarbonat takviyesi. J. Pharm. Pharm. Sci. 11, -8.
Kromer, A., Moosmann, B., 2009. Statine bağlı karaciğer hasarı, kolesterol ve selenoprotein biyosentetik yolları arasındaki çapraz konuşmayı içerir. Mol. Pharm. 75, 1421–1429.
Leung, H.Y., Ko, K.M., 2008. Herba Cistanche ekstresi, sıçan kalplerinde ve H9C2 hücrelerinde mitokondriyal ATP üretimini arttırır. Pharm. Biol. 46, 418.
Liao, F., Zheng, R.L., Gao, J.J., Jia, Z.J., 1999. İskelet kası yorgunluğunun iki fenilpropanoid glikozit tarafından geciktirilmesi: Pedicularis plicata Maxim'den verbascoside ve martensit. Fitoter. Res. 13, 621–623.
Lu, KG, Liu, H.B., Gu, Q.Q., 1995. Cistanche deserticola Ma'nın Kimyasal Bileşenleri Üzerine Çalışma. ve Cistanche salsa (C. A. Mey) G. Beck. Çene. Tradit. Ot. İlaçlar 26, 143.
Farmakope Komisyonu, 2010. Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi. Kimya Endüstrisi Basını, Pekin.
Rosenbaum, D., Dallongeville, J., Sabouret, P., Bruckert, E., 2013. Kas yan etkileri nedeniyle statin tedavisinin kesilmesi: gerçek hayatta bir anket. Nutr. Metab. Kardiyovas. Bölüm 23, 871-875.
Siu, A.H., Ko, K.M., 2010. Herba Cistanche ekstresi, sıçan kalplerinde mitokondriyal glutatyon durumunu ve solunumu arttırır, ayrıca uncoupling proteinlerinin olası indüksiyonu ile. Pharm. Biol. 48, 512–517.
Sui, Z.F., Gua, TM, Liu, B., Peng, S.W., Zhao, Z.L., Li, L., Shi, D.F., Yang, R.Y., 2011. Vücutlarından suda çözünür karbonhidrat bileşiğiHerbaMesafeler: izolasyon ve ciltteki serbest radikal üzerindeki temizleyici etkisi. Karbonhidrat. Polim. 85, 75.
Thompson, P.D., Clarkson, P., Karas, R.H., 2003. Statin ile ilişkili miyopati. JAMA 289, 1681–1690.
Vaklavas, C., Chatzizisis, Y.S., Ziakas, A., Zamboulis, C., Giannoglou, G.D., 2009. Statin ile ilişkili miyopatinin moleküler temeli. Ateroskleroz 202, 18–28.
Velho, J.A., Okanobo, H., Degasperi, G.R., Matsumoto, M.Y., Alberici, L.C., Cosso, R.G., Oliveira, H.C., Vercesi, A.E., 2006. Statinler kalsiyuma bağımlı mitokondriyal geçirgenlik geçişini indükler. Toksikoloji 219, 124–132.
Xiong, Q., Hase, K., Tezuka, Y., Tani, T., Namba, T., Kadota, S., 1998. Cistanche deserticola'dan feniletanoidlerin hepatoprotektif aktivitesi. Planta Med. 64, 120–125.
