Quercetin'in Hipoksi ve Reoksijenasyonla Yaralanan Endotel Hücreleri Üzerindeki Koruyucu Etkisi

Daha fazla bilgi için iletişimtina.xiang@wecistanche.com

Arka fon: Serebral küçük damar hastalığı (CSVD), beyindeki küçük damarların tüm patolojik süreçlerini kapsayan, inme ve ciddi bunamaya neden olabilen bir grup klinik sendromdur. Bununla birlikte, CSVD'nin patogenezi net olmadığı için tedavi sınırlıdır. Endotel hücre disfonksiyonu, hipertansiyon ve lökoz gibi klinik semptomlardan daha erkendir. Bu nedenle endotel hücrelerinin tedavisinin yeni bir atılım olması bekleniyor.kuersetin, çeşitli bitkilerde bulunan bir flavonoid, anti-inflamatuar ve anti-oksidasyon işlevine sahiptir. Bu çalışma, quercetin'in endotel hücre hasarı üzerindeki koruyucu etkisini araştırmayı ve klinikte sonraki uygulamalar için temel bir teori sağlamayı amaçladı.

Yöntemler: İnsan beyni mikrovasküler endotel hücreleri (HBMEC'ler) in vitro olarak kültürlendi ve endotel hücrelerinin hasar modeli hipoksi ve reoksijenasyon (H/R) ile belirlendi. Quercetin'in HBMEC'ler üzerindeki koruyucu etkileri, hücre canlılığı, hücre göçü, anjiyogenez ve apoptoz perspektiflerinden incelenmiştir. Quercetin mekanizmasını daha fazla incelemek için,oksidatif stresve endoplazmik retikulum stresi analiz edildi. Ayrıca kan-beyin bariyeri (BBB) ​​bütünlüğü de incelenmiştir.

Sonuçlar: kuersetinHBMEC'lerin canlılığını, göçünü ve anjiyogenezini teşvik edebilir ve apoptozu inhibe edebilir. Ek olarak, kersetin Keap1/Nrf2 sinyal yolunu da aktive edebilir, ATF6/GRP78 protein ekspresyonunu azaltabilir. Daha fazla çalışma, quercetin'in Claudin-5 ve Zonula occludens-1 ifadesini artırabileceğini gösterdi.

Sonuçlar: Deneylerimiz, quercetin'in HBMEC'leri, hücre proliferasyonunu, hücre göçünü ve anjiyogenezi teşvik eden, mitokondriyal membran potansiyel hasarını azaltan ve hücre apoptozunu inhibe eden H/R'den koruyabildiğini göstermektedir. Bu, antioksidasyonu ve endoplazmik retikulum stresinin inhibisyonu ile ilgili olabilir. Aynı zamanda, kersetin BBB connexin seviyesini artırabilir, bu da quercetin'in BBB bütünlüğünü koruyabileceğini düşündürür.

anahtar kelimeler: serebral küçük damar hastalığı, endotel hücreleri, kersetin, oksidatif stres, endoplazmik retikulum stresi, kan-beyin bariyeri

GİRİİŞ

Beyin küçük damar hastalığı(CSVD), beyindeki küçük damarları içeren tüm patolojik süreçleri kapsayan ve intrakraniyal arteriyolleri venülleri içeren çeşitli etiyolojilere sahip bir grup klinik, görüntüleme ve patolojik sendroma atıfta bulunan bir şemsiye terimdir.<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

kuersetinPolygonum cuspidatum Sieb gibi çeşitli bitkilerde bulunan bir flavonoiddir. et Zucc, güçlü antioksidan ve anti-inflamatuar aktivitelere sahiptir ve kardiyovasküler hastalık, metabolik bozukluklar, nörodejeneratif hastalıklar, diyabet, kanser ve obezite dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumlarda koruyucu etkiler gösterebilir (Dok-Go ve diğerleri, 2003; Comalada ve diğerleri, 2005; Cho ve diğerleri, 2006). Quercetin ile ön tedavi, iskemiden zarar görmüş hayvanların hipokampal CA1 piramidal nöronlarında endojen antioksidan enzimlerin ekspresyon seviyelerini önemli ölçüde arttırdı ve güçlü antioksidan ve nöroprotektif etkiler gösterdi (Chen ve diğerleri, 2017). Son çalışmalar ayrıca, kersetin'in BBB bütünlüğünü korurken iskemik hasara karşı nöroprotektif etkilere sahip olduğunu bulmuştur (Jin ve diğerleri, 2019). Bununla birlikte, hipoksi ve reoksijenasyon (H/R) hasarı altında beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC'ler) üzerindeki etkisi yeterince çalışılmamıştır ve BMEC'leri koruyan kersetin hedef proteini bildirilmemiştir.

Çalışmamızda, kültürde H/R tarafından yaralanan insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri (HBMEC'ler) üzerinde quercetin'in koruyucu etkisini araştırdık. Aynı zamanda, quercetin'in klinik tanıtımı için daha teorik bir temel sağlamak ve CSVD tedavisi için yeni fikirler sağlamak için koruyucu etkisinin olası mekanizmasını daha da inceledik.

MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Medya, Reaktifler ve Antikorlar

kuersetin(purity>Yüzde 98 ) Best Biological Technology Co, Ltd.'den (Chengdu, Çin) satın alındı. HBMEC'ler Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd'den (Shanghai, China) satın alındı. Fetal sığır serumu (FBS), Biological Industries'den (Kibbutz Beit Haemek, İsrail) elde edildi. Penisilin/streptomisin ve Dulbecco'nun değiştirilmiş kartal ortamı (DMEM) Hyclone'dan (GA, Amerika Birleşik Devletleri) satın alındı. Mitokondriyal membran potansiyeli (JC-1)test kiti, BCA protein test kiti, 2,7-diklorür-hidro floresein diasetat (DCFH-DA) ve NP40 lizatı Beyotime Biotechnology'den satın alındı (Şangay, Çin). Fosfataz preparasyonu ve Komple proteaz inhibitörü Roche'dan (Shanghai, China) satın alındı. Apoptoz Kiti BD Biosciences'tan (Sparks, MD, Amerika Birleşik Devletleri) satın alındı. Malondialdehit (MDA), Süperoksit dismutaz (SOD), Hücreler arası hücre yapışma molekülü-1 (ICAM-1), Vasküler hücre yapışma molekülü-1 (VCAM{{10}} )enzim-bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) (Cambridge, Abcam, d'den 1"一Birleşik Krallık şirketini satın aldı). Nuclear faktör E2-ilgili faktör 2(Nrf2), Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1)'e karşı antikorlar, Aktive edici transkripsiyon faktörü 6(ATF6), Glukoz regüle protein 78(GRP78), Zonula occludens 1 (ZO-1), Claudin-5, GAPDH Cell Signaling Technology'den (Danvers, Amerika Birleşik Devletleri) satın alındı. Horseradish peroksidaz (HRP)-konjuge anti-tavşan IgG, Jackson şirketinden (Pennsylvania, Amerika Birleşik Devletleri) temin edildi.SDS-PAGE hızlı dağıtım kiti ve ECL kromojenik solüsyonu, EpiZyme Biotechnology'den (Shanghai, Çin) satın alındı.Hücre Kültürü ve Yaralanma Modeli HBMEC'leri yüzde 1 0 FBS ve yüzde 1 penisilin-streptomisin içeren DMEM'de, yüzde 5 CO2 içeren 37Cinkübatörde kültürlendi. HBMEC'ler 12 saat hipoksi ve ardından 8 saat reoksijenasyon ile tedavi edildi ve spesifik prosedürler şu şekildeydi (Warpsinski ve diğerleri, 2020): HBMEC'ler ilk önce bir hipoksi inkübatöründe serumsuz ortamla inkübe edildi (yüzde 1) 12 saat boyunca yüzde 0.05 CO.94 N) ve daha sonra ortam yüzde 10 FBS içeren normal ortama değiştirildi, bu sırada bir normoxia inkübatöründe (yüzde 95 O2,5 CO2) 8 saat inkübe edildi. Quercetin Tedavisi 2 mg Quercetin, 1 mmol/L konsantrasyonda bir stok solüsyon oluşturmak üzere 331μL DMSO içinde çözündürüldü ve -20 derecede saklandı. Çalışma solüsyonu, DMSO yüzdesinin yüzde 0.1'in altında olduğu DMEM ile 0.1,0.5,1,2,5,10umol/L'ye seyreltildi. Hücreler yapıştıktan sonra, serumsuz ortam ile kersetin eklendi ve plakalar daha sonra hipoksi inkübatörüne yerleştirildi. 12 saat sonra hücreler çıkarıldı, serum ortamı ile kersetin olarak değiştirildi ve 8 saat süreyle bir normoksia inkübatörüne yerleştirildi.

Hücre Canlılığı Testi

EtkilerikuersetinHBMEC'lerin canlılığı, kullanım kılavuzuna göre Hücre Sayım Kiti-8 ile incelendi. Önce endotel hücrelerinde hasar yokken hücrelere güvenli quercetin dozları değerlendirildi, ardından hücre hasarı durumunda koruyucu etkileri test edildi. Tüm deneysel sonuçlar en az üç kez tekrarlandı.

Scratch Healing ve Tube Formation Assay Migrasyon deneyleri, bir hücre kazıma yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Quercetin işleminden önce, kültür plakasının altına düz bir dikey çizgi çizildi ve 0 saat boyunca kayıt için fotoğraflandı ve ardından hücreler, kayıt için fotoğraf çekmeden önce quercetin ve modelleme işlemine tabi tutuldu. Ön ve arka alanlar iki kez kontrastlandı.

Hücre anjiyogenik kabiliyetini taklit eden tüp oluşumu, Matrigel (9-12mg/ml) kültür plakasının altına yerleştirildi, ardından kersetin ve modelleme ile muamele edilmiş hücreler üste kaplandı, 8 saat sonra resimler çekildi. Kan damarlarının dallanma oluşumu ImageJ kullanılarak analiz edildi ve karşılaştırıldı.

Mitokondriyal Membran Potansiyelleri ve Apoptoz Testi

Hücre apoptozunu tespit etmek için mitokondriyal membran potansiyel değişikliği ve apoptoz kiti kullanıldı. Mitokondriyal membran potansiyelindeki değişiklik, HBMEC'lerin JC-1 floresan probu ile boyanmasıyla tespit edildi. JC-1(1×) boyama çalışma solüsyonu eklendi ve iki kez JC-1(1×)boyama tamponu ile yıkanmadan önce 37 derecelik bir Cinkübatörde 20 dakika inkübe edildi ve son olarak PBS için her kuyuya eklendi . Ardından, analiz için yüksek içerikli hücre görüntüleyici kullanıldı.

HBMEC'ler 6-kuyulu plakalardan toplandı, süpernatantı çıkarmak için santrifüjlendi, ardından hücreleri üflemek ve karıştırmak için 1 x Annexin V bağlama solüsyonu ekleyin, ardından karanlıkta oda sıcaklığında 10 süreyle inkübe etmek için FITC Annexin V boyası ekleyin. dakika, makineden 5 dakika önce propidium iyodür(PI) boyama solüsyonu ekleyin ve saptamak için Beckman akış sitometresi kullanıldı.

ELISA

Hücreler H/R veya kersetin ile muamele edildikten sonra süpernatan toplandı. ICAM-1, VCAM-1, SOD ve MDA, operatör kılavuzuna göre ELSA kitleri kullanılarak tespit edildi.

Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Tahlili ROS oluşturma yeteneği, yüksek içerikli hücre görüntüleyici tarafından değerlendirilen DCFH-DA probu tarafından tespit edildi ve ImageJ kullanılarak floresan ile analiz edildi. Western Blotlama

HBMEC'ler kültür plakalarından toplandı, NP40 lizat ekleyen fosfataz preparasyonu ve hücrelerden proteinleri çıkarmak için tam proteaz inhibitörü kullanıldı. Protein içeriği belirlendi ve immünoblotlama deneyleri için 30ug protein alındı. SDS-PAGE jeli elektroforez için kullanıldı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PVDF membranına elektrotransferden sonra yüzde 5 yağsız kuru süt ile bloke edildi. Sonra anti-Nrf2(tavşan, 1:1,000),anti-Keapl(tavşan,1:1,000),anti-ATF6(tavşan,1:1,000 ), anti-GRP78(tavşan,1:1,000), anti-ZO-1(tavşan,1:1,000), anti-Claudin-5( tavşan,1:1,000) antikorları gece boyunca 4C'de inkübe edildi. Ertesi gün yıkandıktan sonra seyreltilmiş Keçi anti-tavşan ikincil antikorları (IgG HRP, 1:10,000) ilave edildi ve 1 saat inkübe edildi. Son olarak, algılama, TBST'de üç kez yıkandıktan sonra geliştirildi.

Proteomik Analiz

HBMEC'ler, kersetin (1 umol/L) varlığında H/R ile tedavi edildi. Daha sonra hücreler bir hücre kazıyıcı ile kültür plakasından nazikçe kazınmış, kriyoviyallerde toplanmış, hızlı bir şekilde sıvı nitrojen içine yerleştirilmiş ve daha sonra 5 dakika süreyle -80 derecede saklanmıştır. p değeri olan proteinler<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 veya<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

İstatistiksel analiz

Veriler normal dağılıma uygundu ve verileri ifade etmek için ortalama ± standart sapma kullanıldı. İstatistiksel analiz için GraphPad Prism 8 kullanıldı. İki bağımsız numune t-testi ile analiz edildi ve ölçüm verileri ortalama ± Standart sapma (SD) ile tanımlandı. Gruplar arası karşılaştırma tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile yapılmıştır. p değeri<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

SONUÇLAR

Sonuçlar

Quercetin'in Hücre Canlılığı Üzerindeki Etkisi

Quercetin'in hücre canlılığı üzerindeki etkisini test etmek için, ilk olarak, Şekil 1A'da gösterildiği gibi, hücreler üzerinde, 0'da hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan güvenli bir kuersetin dozunu inceledik.1-10 umol/L. . Daha sonra, endotel hücre hasarı temelinde etkili bir doz aramak için, 0.1-1 μmol/L'deki kersetin'in Şekilde gösterildiği gibi H/R-HBMEC'lerde hücre canlılığını destekleyebileceğini gösterdik. 1B. Daha sonraki deneyler, bu konsantrasyon aralığında gerçekleştirilmiştir. İlaç konsantrasyonu 10 µmol/L'ye ulaştığında sitotoksisitenin ortaya çıktığını belirtmekte fayda var. HBMEC'ler H/R tarafından hasar gördüğünde toleranslarının azaldığını düşündük. Bu nedenle, ilaç konsantrasyonu biraz daha yüksek olduğunda, hücrelere verilen hasar arttı. Bu nedenle, ilaç konsantrasyonu 10 µmol/L olduğunda sitotoksisite meydana geldi.

Quercetin'in Hücre Göçü ve Anjiyogenez Üzerine Etkisi

Quercetin'in endotel hücrelerinin göç ve anjiyojenik kapasiteleri üzerindeki etkilerini incelemek için, HBMEC'ler, kersetin verilirken H/R tedavisine tabi tutuldu. Hücre göçü kabiliyetini test etmek için bir çizik tahlili gerçekleştirdik; bu, H/R tedavisinin kontrol ile karşılaştırıldığında H/R-HBMEC'lerin göç kabiliyetini zayıflattığını ve kersetin 0 konsantrasyonunda hücre göçünü önemli ölçüde destekleyebileceğini gösterdi. .1-1 μmol/L. Tubulogenez, in vitro anjiyogenezi taklit etmek için kullanıldı ve dal uzunluğu, anjiyojenik kapasiteyi temsil ediyor. Sonuçlar, H/R tedavisinin anjiyojenik kapasitede azalma ile sonuçlandığını, ancak quercetin 0.1-1 μmol/L'nin Şekil 2'de gösterildiği gibi bu yaralanmayı tersine çevirebileceğini gösterdi.

Quercetin'in Hücre Apoptozisine Etkisi

Quercetin'in endotelyal hücre apoptozunu inhibe etme potansiyelini test etmek için, değerlendirme için mitokondriyal membran potansiyeli ve apoptoz kullandık. Hücreler apoptotik olaylara maruz kalacak şekilde yaralandığında, mitokondriyal membran potansiyeli azaldı, sitoplazmik kırmızı floresan önemli ölçüde azaldı, yeşil floresan arttı ve sonunda Kırmızı/Yeşil (R/G) mitokondriyal membran potansiyelinin değişimini temsil etmek için benimsendi. mitokondriyal membran potansiyeli tehlikeye girdiğinde azalacaktır. Sonuçlarımız, artan yeşil floresan ile gösterildiği gibi, H/R işleminden sonra hücrelerin mitokondriyal membran potansiyelinin azaldığını gösterdi. Artan dozlarda quercetin ile kırmızı floresan sürekli olarak arttırıldı, bu da quercetin'in doza bağlı olarak mitokondriyal membran potansiyelini yükseltebileceğini gösteriyor (Şekil 3A, C). Ayrıca, hücre apoptozunu doğrudan incelemek için Akış sitometrisi kullanıldı. Sonuçlar, H/R tedavisinden sonra HBMEC'lerin yüksek bir apoptoz oranı sergilediğini, oysa 0.1-1 umol/L'de kersetin apoptozu inhibe etme konusunda açık bir yetenek sergilediğini gösterdi(Şekil 3B, D).

Quercetin'in Hücre Yapışması Üzerine Etkisi

Endotel hücreleri hasar gördüğünde, ICAM{{0} ve VCAM-1 gibi bazı adezyon molekülleri üretilir, toksik maddeleri KBB'ye emer ve beyin parankimine zarar verir (Hauptmann et al,2020). ). Quercetin'in H/R-HBMEC'lerin yapışma molekülleri üretme yeteneği üzerindeki etkisini incelemek için ICAM-1 ve VCAM-1 ELISA kullanılarak ölçüldü. Çalışmamızda H/R, ICAM-1 ve VCAM-1 düzeylerinin artmasına neden oldu, ancak 0 konsantrasyonunun altında kersetin eklenmesi1-1 umol/L bu etkiyi azalttı (Şekil 4).

Quercetin Oksidatif Stresi Engelleyebilir

Quercetin, güçlü antioksidan kapasiteye sahip bir flavonoiddir, bu nedenle ROS'u saptamak için bir DCFH-DA probu kullandık. Gözlemledik

H/R'ye maruz kalan HBMEC'lerde artan ROS üretimi, {{0}}} konsantrasyonlarında quercetin tedavisi ile belirgin şekilde azaltıldı.1-1 umol/L Bu arada, oksidatif stresin düzey değişikliklerini tespit ettik. ELISA ile SOD ve MDA ürünleri ve sonuçlar gösterdi ki 0.1-1 μmol/L konsantrasyonunda kersetin, H/R ile yükselen SOD ve MDA'yı azaltabiliyor, böylece kersetin'in azaltabileceğini gösteriyor. HBMEC'lerin oksidatif stresten zarar görmesi (Şekil 5).

Quercetin Keap1/Nrf2 ve ATF6/GRP78 Proteinlerini Düzenleyebilir

HBMEC'ler üzerindeki kersetin koruyucu mekanizmasını daha fazla araştırmak için, kersetin ekspresyon seviyelerini analiz ettik.oksidatif stresve endoplazmik retikulum stresi ile ilgili proteinler. Keap1/Nrf2'nin in vivo olarak antioksidan tepkileri düzenlediği bilinmektedir. Oksidatif stres hasarı, endotel hücrelerini stres tepkisine girmeye zorlar ve bu da Keapl/Nrf2 seviyelerinin artmasına neden olur (Warpsinski ve diğerleri, 2020). Bu çalışmada, H/R, hücresel antioksidan tepki mekanizmalarının aktivasyonu ve HBMEC'lerin antioksidan kapasitesini arttırmak için 0.5-1 umol/L'de kersetin tarafından daha da güçlendirilebilen Keapl ve Nrf2 seviyelerinin artmasıyla sonuçlandı. .ATF6/GRP78, endoplazmik retikulum(ER) homeostazını düzenleyen yollardan biridir. ER stresi endotel hücre hasarını kötüleştirebilir (Nie ve diğerleri, 2020). Çalışmamızda ER stresi H/R tarafından aktive edildi ve ATF6 ve GRP78 seviyeleri arttı. 1 umol/L'deki Quercetin, her ikisinin de protein seviyelerini önemli ölçüde azaltabildi, ER stresini engelledi ve HBMEC'leri H/R hasarından koruyabildi (Şekil 6).

Quercetin BBB Bütünlüğünü Koruyabilir

BMEC'ler, BBB yapısının omurgasıdır ve H/R yaralanmasından sonra ölümleri veya apoptozları, BBB bütünlüğünü ve işlevselliğini etkiler (Ding ve diğerleri, 2019). Bu yazıda, endotel hücrelerinin işlevi, ifadedeki değişikliklerin saptanmasıyla yansıtılmıştır. BBB ile ilişkili proteinler ZO-1 ve Claudin-5. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, ZO-1 ve Claudin-5 ifadesi şu şekildeydi:

H/R hasarında azalma, BBB'nin hasar gördüğünü ve bu hasarın 0.5-1 μmol/L konsantrasyonlarında kersetin tarafından tersine çevrilebileceğini gösterir, bu da kersetin endotel hücrelerinin işlevini koruyabildiğini gösterir. (Şekil 7).

Proteomik Analiz

H/R hasarlı HBMEC'lerin kersetin varlığında veya yokluğunda diferansiyel ekspresyon proteinlerini (DEP'ler) bulmak için proteomik analizini yürütmek için ITRAO kullanıldı. ap sergileyen proteinler<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 veya<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

TARTIŞMA

CSVD, artan bir tıbbi ve sosyoekonomik yük olarak hızla dikkatleri üzerine çekmiştir. Ancak şaşırtıcı bir şekilde, CSVD'nin patogenezi şu anda belirsizliğini koruyor ve tedavisi için de net bir şema vermiyor. CSVD'nin sonraki aşamalarının inme ve demans gibi ciddi sonuçlara ilerleyebileceği göz önüne alındığında, tedavi için erken lezyonları hedeflemek CSVD'nin ilerlemesini etkili bir şekilde geciktirebilir(Cannistraro ve diğerleri,2019). CSVD'nin erken patolojik değişikliklerinin endotel hücre disfonksiyonunda yattığı ve disfonksiyonunu stabilize eden ilaçların CSVD lezyonlarında serebral beyaz cevherin hassasiyetini artırabileceği gösterilmiştir (Rajani ve ark. 2018). CSVD'de endotel hücrelerinin oynadığı rol göz önüne alındığında, geleneksel Çin tıbbının endotel hücreleri üzerindeki koruyucu etkilerini HBMEC'leri kullanarak araştırmak için yola çıktık.

Quercetin, çeşitli bitkilerde bulunan bir flavonoiddir(Nawrot-Hadzik et al,2019). Güçlü antioksidan ve antienflamatuar aktiviteleri vardır ve çeşitli patolojik durumlarda koruyucu etkiler gösterebilir. Bu çalışmada, quercetin'in H/R hasarını iyileştirebileceğini gösterdik ve birkaç deneysel veri, quercetin'in hücre canlılığını, hücre göçünü, anjiyogenezi destekleyebileceği, mitokondriyal membran potansiyelini artırabileceği ve apoptozu engelleyebileceği sonucumuzu doğruladı.

Quercetin'in güçlü antioksidan aktiviteye sahip olduğunu göz önünde bulundurarak, quercetin'in HBMEC'leri antioksidasyon açısından koruduğu mekanizmayı araştırdık. ROS seviyeleri oksidatif stres tarafından önemli ölçüde arttırılabilir (Wu ve diğerleri, 2018) ve ROS birikimi kardiyovasküler hastalıklar, endotelyal disfonksiyon ve yaşlanma ile ilgili hastalıklar ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere birçok hastalığa neden olabilir (Chen ve diğerleri, 2015; Jakaria ve diğerleri, 2018; Santos ve diğerleri, 2018). Ayrıca, lipid peroksidasyonunda oksidatif stres meydana gelir ve vücudun oksidatif antioksidan dengesini bozacak ve endotel hücre hasarını artıracak MDA üretir (Yang ve diğerleri, 2021).

Keapl/Nrf2, şu anda en önemli kendi kendine anti-oksidatif stres yolu olarak kabul edilir ve bu yolun aktivasyonu, endotel hücre fonksiyon bozukluğunu önemli ölçüde iyileştirebilir. Özellikle ROS, Nrf2 sinyal yolunun aktivasyonunun desteklenmesine yardımcı olur (Selimoglu-Buet ve diğerleri, 2017). Quercetin'in Keapl ve Nrf2 protein ekspresyonunu arttırırken ROS ve MDA oluşumunu azaltabildiğini gösterdik, bu da quercetin'in Keapl/Nrf2 sinyal yolunu aktive ederek oksidatif stres tepkilerini azaltarak endotel hücre hasarını azaltabileceğini gösterdik.

Sadece bu değil, sürekli ER stresi, katlanmamış protein yanıtını aktive eder ve antioksidan genlerin ekspresyonunu değiştirerek endotel hücre apoptozisine yol açar (Tang ve diğerleri, 2019). Ayrıca, oksidatif stres ayrıca ER'de protein katlanmasının bozulmasına neden olabilir, ER stresini tetikleyebilir ve endotel hücre hasarını şiddetlendirebilir (Hetz, 2012). ER stresi şu üç yolla aktive edilebilir: PKR benzeri ER kinaz(PERK), enzim 1 (IRE1) gerektiren inositol ve homeostatik koşullar altında hücreleri ER stresinden koruyan aktive edici ATF-6(Hetz ve ark. ,2020). Ancak dış olumsuz uyaranlardan etkilendiğinde, bu üç yol ER stres yanıtını aktive eder ve hücre apoptozisini indükler. Ayrıca, çalışmalar ER stres yanıtının inhibisyonunun H/R kaynaklı endotel hücre işlev bozukluğunu tersine çevirebileceğini göstermiştir (Chen ve diğerleri, 2020). Çalışmamızda kersetin, H/R'nin neden olduğu yüksek ATF6/GRP78 içeriğini azaltabilir, endoplazmik retikulum stres yanıtı ve endotel hücrelerini korur.

BBB'nin önemli bir bileşeni olarak endotel hücrelerinin işlevleri, bütünlüklerini korumayı içerir. BBB disfonksiyonu, sıvıların, proteinlerin ve diğer plazma bileşenlerinin perivasküler dokulara sızmasına neden olarak serebral vazodilatasyon ve besin taşınmasını daha da bozar (Wardlaw ve diğerleri, 2019). Endotel hücreleri hasar gördüğünde ve BBB'nin bütünlüğü bozulduğunda, endotel hücrelerinin korunması BBB'nin bütünlüğünü daha da koruyabilir. Claudin-5 BMEC'lerde yüksek oranda eksprese edilir ve regüle etmek için sıkı bağlantı zincirlerinin omurgasını oluşturmada rol oynar. BBB geçirgenliği (Yang ve diğerleri, 2020). Endotel hücreleri, ZO -1 gibi iskele proteinleri tarafından aktin hücre iskeletine bağlanır ve BBB'nin sıkılığını koruyan endotel hücreleri arasında sıkı bağlantılar oluşturur (Zhang ve diğerleri, 2020). Çalışmamızda BBB bütünlüğünü temsil etmek için claudin-5 ve ZO-1 ifadesi kullanılmıştır. Sonuçlarımız, H/R hasarına maruz kalan HBMEC'lerde claudin-5 ve ZO-1 protein seviyelerinin azaldığını gösterdi, bu da BBB bütünlüğünün bozulduğunu ve quercetin'in claudin'i yükselterek bu hasarı azaltabileceğini gösterdi{{ 9}} ve ZO 1 protein seviyeleri.

Ayrıca, kuersetin'in HBMEC'ler üzerindeki potansiyel hedeflerini bulmak için, i-TRAQ hücrelere etiketlendi. Proteomik analizden sonra, ortak diferansiyel olarak eksprese edilen proteinlerin ilk 20'si araştırıldı. Bunlar arasında INSRR, DUSP3,

ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI endotel hücreleri ile ilgilidir. INSRR, bir tümör endotel belirteci olarak kabul edilir ve aşırı ekspresyonu, anjiyogenezi destekleyebilir (Nowak-Sliwinska ve diğerleri, 2019). Rekombinant ANXA2, hipoksik ve inflamatuar faktör yaralanma durumları altında endotel geçirgenliğini azaltabilir, bu da ANXA2'nin endotel hücre sıkılığının korunmasında rol oynayabileceğini gösterir (Li ve diğerleri, 2019). İnsan servikal kesitlerinin boyanmasında, endotel hücrelerinde güçlü DUSP3 ekspresyonu bulundu ve deneyler ayrıca DUSP3'ün temel fibroblast büyüme faktörü ile indüklenen mikrovasküler büyüme için gerekli olduğunu gösterdi (Amand ve ark. 2014). Endotel hücrelerinde HBAl ekspresyonunun vasküler tonusu ve fonksiyonu kontrol ettiği gösterilmiştir(Sangwung ve ark.,2017).PGK1'in ayrıca aterojenezi azalttığı düşünülmektedir(Zhang ve ark,2020). Dahası, VTN, vasküler yaralanma ortamında trombüs oluşumu için kritik olarak kabul edilir(Bowley ve diğerleri, 2017). GPI, hipoksik ortam altındaki romatoid artrit hastalarından alınan sinovyal dokunun mikrovasküler endotelyal hücrelerinde zenginleştirilmiştir ve anjiyogenezi indüklemek için romatoid artrit sinovyal fibroblastlarından vasküler endotelyal büyüme faktörünün salgılanmasını düzenler (Lu ve diğerleri, 2017). varikosel aracılı kısırlıkla ilgili eksprese edilen proteinler, Nrf2'nin ANXA2'nin yukarı akış düzenleyicisi olduğunu gösterdi (Panner Selvam ve diğerleri, 2021). PGK1'in inhibisyonu, Keapl/Nrf2 yolunu aktive edebilir ve hücre koruyucu antioksidan yanıtı uyarabilir (Bollong ve diğerleri, 2018). İki protein, Keapl/Nrf2 yolu yoluyla kersetin'in potansiyel hedefleri olabilir. Daha fazla çalışma, bu proteinlerin, kersetin'in H/R-HBMEC'ler üzerindeki etkisi üzerindeki rolünü doğrulayabilir.

Kuşkusuz, kersetin endotel hücreleri üzerinde koruyucu etkiler gösterebilir. Ancak belirli eylem hedefleri hala daha fazla araştırma gerektiriyor ve ek eylem yolları olup olmadığı bilinmiyor.

Sonuç olarak, bu çalışma, quercetin'in endotel hücrelerini koruyarak kan-beyin bariyerinin bütünlüğünü koruduğunu göstermiştir. Moleküler düzeyde, kersetin, Keapl/Nrf2 yolu aracılığıyla oksidatif strese karşı koruma sağlayarak ve ATF6/GRP78 yolu yoluyla endoplazmik retikulum stresini inhibe ederek endotel hücrelerinin korunmasında rol oynayabilir. Bu çalışma, TCM'nin endotel hücrelerini koruyarak CSVD'yi tedavi etmesinin temelini oluşturmaktadır.