Kronik Böbrek Hastalığının İlerlemesinde Fosfatın Proteinden Bağımsız Rolü

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Irene Faria Duayer¹ ve diğerleri

Soyut:Birkaç faktör katkıda bulunurböbrek fonksiyonuKBH hastalarında azalma ve diyetteki fosfat içeriğinin rolü hala tartışma konusudur. Bu çalışma, proteinden bağımsız olarak fosfatın CKD'nin ilerlemesi ile ilişkili olduğu mekanizmayı analiz etmeyi amaçlamaktadır. Yetişkin Münih-Wistar sıçanları 5/6 nefrektomiye (Nx) tabi tutuldu, düşük proteinli diyetle beslendi ve iki gruba ayrıldı. Sadece fosfat içeriği (düşük fosfat, LoP, 0%0,2; yüksek fosfat, HiP,0%0,95) diyetleri farklılaştırdı. Altmış gün sonra biyokimyasal parametreler veböbrekhistoloji analiz edildi. HiP grubu, daha yüksek PTH, FGF-23 seviyeleri ve fraksiyonel fosfat atılımı ile daha kötü böbrek fonksiyonu sergiledi. Böbrek dokusunun histolojik analizinde ayrıca daha yüksek oranda interstisyel fibroz, -aktin ekspresyonu, PCNA veböbrekmakrofajların infiltrasyonu. LoP grubu, HiP grubuyla karşılaştırıldığında otofajik akışın bir belirteci olan renal tübül hücrelerinde daha yüksek bir beclin-1 ifadesi sundu. Bulgularımız, fosfatın indüksiyondaki etkisini vurgulamaktadır.böbrekinterstisyel inflamasyon ve fibroz, böbrek hastalığının ilerlemesine katkıda bulunur. Fosfatın renal hücre otofaji mekanizmasının düzensizliği üzerindeki olası etkisi, klinik çalışmalarla daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyar.

Anahtar Kelimeler:fosfat;diyet; CKDilerleme;böbrekfibroz; otofaji;apoptoz

Anahtar Katkı:Fosfat diyetini kısıtlayarak böbrek koruma mekanizmaları henüz belirlenmemiştir. Bu çalışmada, fosfat aşırı yüklenmesi, inflamatuar yolakların aktivasyonu ve indüklenmesi yoluyla CKD'nin ilerlemesinde rol oynadı.böbrekinterstisyel fibroz. Hiperfosfateminin renal hücre apoptozu ve otofajik arkadaş üzerindeki etkisi daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyar.

Cistanche tubulosa böbrek hastalığını önler, numuneyi almak için buraya tıklayın

1. Giriş

Kronikböbrekhastalık (CKD) bir halk sağlığı sorunu olarak kabul edilir. Prevalansı yaşla birlikte artar ve dünya genelinde yüzde 11-13 arasında değişir [1]. KBH genellikle geri dönüşü olmayan bir durum olmasına rağmen, kan basıncının kontrolü, dislipidemi ve hiperglisemi, anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibitörü kullanımı ve düşük proteinli diyet gibi hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak için çeşitli yaklaşımlar kullanılabilir [2-7] . Bu stratejiler arasında, düşük proteinli bir diyet, geciktirme için en tartışmalı öneridir.böbrekuygunluğu, güvenliği ve etkinliği konusundaki endişeler nedeniyle işlev düşüşü. Diyette proteini azaltmanın yararları konusunda fikir birliği olmaması, diyetteki protein ve fosfat içeriğinin örtüşen rolüne dayanır. Protein kaynakları fosfat açısından zengin olduğundan, sınırlı bir fosfat alımını sağlamak için protein alımının azaltılması önerilir. Bunun tersi zor olsa da, fosfatı kısıtlamadan proteini kısıtlamak mümkündür.

Deneysel çalışmalarda, düşük proteinli bir diyetin etkisi, CKD modellerini glomerüler hasar ve proteinüriden korumuş [8], glomerüler filtrasyon hızının daha fazla korunmasını teşvik etmiştir [9]. Diyet proteini ve fosfatın yüksek oranda ilişkili olduğuna dikkat edilmelidir. Bu nedenle, bazı deneysel çalışmalar protein kısıtlamasının izole etkisini değerlendirmeye odaklanmış olsa da, yanlışlıkla fosfat kısıtlaması nedeniyle önyargılı da olabilirler. Öte yandan, fosfattan zengin bir diyetin KBH gelişimine bireysel katkısı açıkça gösterilmiştir [10,11]. Yüksek fosfatlı bir diyetin daha fazla interstisyel indüklediği gösterilmiştir.böbreküremik sıçanlarda minimal glomerüloskleroz ile fibrozis ve tübüler atrofi. İlginç bir şekilde, hasar fosfat kısıtlamasından sonra körelmiştir [12]. Unutulmamalıdır ki, diyetteki protein içeriği bu çalışmada belirtilmemiştir.

Klinik senaryoda, düşük proteinli bir diyet, konservatif bakımdan aşamalı diyaliz rejimlerine geçişte bile, üremik toksinlerin konsantrasyonunu azalttı ve kalan böbrek fonksiyonunu korudu [13].diyetproteinkısıtlama ayrıca yakın tarihli bir meta-analizde KBH ilerlemesini geciktirmiştir [14]. Bununla birlikte, protein kısıtlaması daha düşük serum fosfat seviyeleri ile ilişkili olduğundan, diyetin bu faydalı etkisi kısmen fosfat kısıtlaması ile açıklanabilirdi. Şimdiye kadarki en büyük prospektif çalışma olan MDRD [15], orta derecede böbrek yetmezliği olan hastalarda düşük proteinli bir diyetin sadece küçük bir faydasını gösterirken, şiddetli böbrek yetmezliği olan hastalarda böbrek hastalığının ilerlemesi etkilenmedi. Bununla birlikte, diyetteki fosfat içeriği bu denemede ele alınmamıştır ve bireysel katkısının yavaşlama üzerindeki etkisine değinilmemiştir.CKDilerleme bilinmiyor.

Fosfatın, antioksidatif ve antiapoptotik etkilerle [17] sitoproteksiyon ve antifibrozda yer alan yaşlanma karşıtı bir protein olan renal ve dolaşımdaki Klotho'yu [16] düşürebildiği bilinmektedir. Ek olarak, Klotho eksikliği nedeniyle böbrek hücrelerinde kusurlu otofaji zaten gösterilmiştir [18]. Otofaji, hücresel homeostazın korunmasında ve stres koşullarında hücre canlılığının korunmasında kritik işlevlere sahip katabolik bir süreçtir. Bazı kanıtlar, otofaji ile böbrek fibrozunun gelişimi için güçlü bir fibrojenik faktör olan TGF sinyali [19] dahil olmak üzere farklı yollardan CKD'nin ilerlemesi arasında bir ilişki olduğunu düşündürmektedir. TGF- hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını, apoptozu düzenleyen çeşitli biyolojik süreçleri etkiler ve SMAD proteinlerinin aracılık ettiği hücre içi sinyalleşmeyi indükleyen spesifik transmembran reseptörlere bağlanarak hareket eder [20]. Apoptoz, nekrozdan farklı, programlanmış hücre ölümü mekanizmasıdır. Fosfat, endotelyal [21], osteoblastik [22] ve peritoneal mezotelyal hücrelerin [23] deneysel modellerinde apoptozun bir aracısı olarak tanımlanmıştır. Apoptotik hücre ölümünün progresyonuna katıldığına dair kanıtlar vardır.böbrekyaralanma [24], ancak fosfatın renal hücre apoptozu üzerindeki etkisi henüz açıklığa kavuşturulmamıştır.

Yüksek fosfatlı bir diyetin CKD ilerlemesini hızlandırdığı mekanizma henüz tam olarak açıklanmadığından, bunun işlevsiz bir otofajik arkadaşla ilişkili olabileceğini varsaydık. Bu nedenle, mevcut çalışmada, iki grup Münih-Wistar sıçanını diyetlerindeki fosfat içeriğine göre değerlendirdik (düşük 0%0,2'ye karşı yüksek0.95) ve bir farenin etkisini test ettik. düşük fosfatlı diyetböbrekler' otofaji belirteci, beclin-1 dahil olmak üzere histolojik ve immünohistokimya değişiklikleri.

2. Sonuçlar

Düşük (LoP) ve yüksek fosfatlı diyet (HiP) gruplarından elde edilen hemodinamik, morfolojik ve biyokimyasal parametreler Tablo 1'de verilmiştir. Beklendiği gibi, 5/6- nefrektomi kreatinin klirensinde bir azalmaya ve bir artışa neden oldu. serum üre ve kreatinin her iki grupta da. HiP grubundan hayvanlar, daha yüksek kreatinin ve daha düşük kreatinin klirensi ile kanıtlandığı gibi, daha düşük böbrek fonksiyonu sergilemiştir; ayrıca daha düşük hematokrit ve daha düşük nihai ağırlık sergilediler. HiP grubu, paratiroid hormonu (PTH) ve fibroblast büyüme faktörü-23 (FGF-23) kadar serum ve fraksiyonel fosfat atılımında bir artış gösterdi. Not olarak, kaudal basınç, başlangıç ​​ağırlığı ve idrar albümin atılımı gruplar arasında benzerdi.

Histolojik bulgular Şekil 1-3'te gösterilmiştir. Glomerüloskleroz (GS) her iki grupta da zar zor bulundu. Bununla birlikte, HiP grubundaki sıçanlar arasında interstisyel fibroz yüzdesi önemli ölçüde daha yüksekti. Buna göre, bu hayvanlar ayrıca Tablo 2'de gösterildiği gibi ED-1 ekspresyonu ile değerlendirilen, düz kas aktin lekeli alan yüzdesine ve makrofajlar tarafından daha yüksek renal infiltrasyona sahipti. Fosforillenmiş SMAD (p-SMAD) ekspresyonu, TGF-beta yolu aktivasyonunun bir belirteci, gruplar arasında farklı değildi.

Proliferatif hücre nükleer antijeni (PCNA)-pozitif hücreler HiP grubunda baskındı, bu da aşırı fosfat yükünün daha yoğun renal hücre proliferasyonunu desteklediğini düşündürdü. Tersine, apoptotik hücre sayısı LoP grubunda daha yüksek olma eğilimindeydi. Benzer şekilde, LoP grubundaki tubulointerstisyel lezyonlarda beclin 1-pozitif hücreler önemli ölçüde daha yüksekti;böbrekdoku.

3. Tartışma

Bu deneysel çalışma, diyette fosfat kısıtlamasının, eşlik eden diyet protein kısıtlamasından bağımsız olarak, CKD'nin ilerlemesini yavaşlatmak için etkili bir adım olup olmadığını araştırdı. Tüm hayvanların düşük proteinli bir diyet aldığı bir 5/6-nefrektomi hayvan modelinde, farklı fosfat içeriğine sahip diyetlerin (yüzde {{0}}.2'ye karşı yüzde 0.95) etkisini inceledik. (yüzde 12). Bulgularımız, yüksek fosfatlı bir diyetin, PTH, FGF-23 ve dolayısıyla fosfatın fraksiyonel atılımındaki artışa rağmen hiperfosfatemi ile ilişkili olduğunu gösterdi. Ek olarak, HiP, böbrek fonksiyonunda bir bozulmaya ve daha yüksek aktin ekspresyonu, makrofaj infiltrasyonu ve hücresel proliferasyonun yanı sıra otofajinin inhibisyonu ile ilişkili olan interstisyel fibrozda bir artışa neden oldu.

Diyalize girmeyen 25.546 KBH hastasını içeren 12 kohort çalışmasının meta analizi, serum fosfat seviyeleri arasında bağımsız bir ilişki olduğunu göstermiştir.böbrekbaşarısızlık ve mortalite [25]. Ayrıca, 13.772 diyaliz hastası üzerinde yapılan retrospektif bir kohort çalışması, hiperfosfatemi ile CKD-mineral ve kemik bozukluğunun diğer anormallikleri arasında, rezidüel diyalizde daha keskin bir düşüş ile bir ilişki olduğunu ortaya koymuştur.böbrekişlev [26]. Fosfat kısıtlamasının CKD ilerlemesini geciktirdiği mekanizma henüz kurulmamıştır. Deneysel bir çalışmada, sabit bir paratiroid kullanarak paratiroidektomi ve 5/6-nefrektomi uygulanan Wistar sıçanlarında düşük fosfatlı bir diyete kıyasla fosfatla zenginleştirilmiş bir diyetin daha fazla böbrek fonksiyonu ile ilişkili olduğunu gösterdik. hormon (PTH) takviyesi [11]. Kusano et al. [10], böbrek fonksiyon korumasının, üremik sıçanlarda diyet protein içeriğinden bağımsız olarak düşük fosfatlı (0%0,3) diyetle ilişkili olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, normal fosfat (yüzde 0,5) diyetine sahip sıçanlar, bu faydaları ancak çok düşük proteinli (yüzde 8.4) bir diyetle beslendiklerinde gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar diyet fosfatının rolünün diyet proteininden daha güçlü olabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, yukarıda bahsedilen çalışmaların hiçbiri, fosfata bağlı böbrek hasarına dahil olabilecek potansiyel yolları araştırmaya çalışmamıştır.

CKD'nin ilerlemesinde fosfat aşırı yüklenmesinin etkisi, çeşitli çalışmaların konusu olmuştur. Etiketler ve ark. ilk önce bu olasılığı bir hayvan modelinde önerdi, ancak diyet proteini kontrol edilmedi, bu da muhtemelen fosfatın izole etkisini maskeledi. CKD senaryosunda protein kısıtlamasından ziyade fosfattan bağımsız bir kısıtlamanın sözde faydası büyük ilgi görmektedir çünkü serum fosfatını sınırlı protein alımıyla birlikte kontrol etme riski yetersiz beslenmeye ve daha yüksek ölümlere neden olabilir.

Fosfat diyet içeriği, KBH hastalarında serum fosfat konsantrasyonunu mutlaka belirlemez [28], bu elementin serum konsantrasyonundan bağımsız olarak diyet kısıtlamasının önemini vurgular. Fosfatın kemikler ve kardiyovasküler sistem üzerindeki patolojik etkileri, hiperfosfatemi tedavisine yönelik müdahaleleri motive eder. Klinik uygulamada, fosfat seviyelerini düşürmeye yönelik müdahaleler, diyet kısıtlamaları ve fosfat bağlayıcılardan oluşur. Bu yaklaşımın klinik sonlanım noktaları üzerindeki faydaları, küçük örneklemli bir çalışmada [29] sorgulanabilir olsa da, PTH ve FGF'nin aşırı üretiminden fosfat fazlasının sorumlu olduğu bilgisi karşısında-23, sürdürmek mantıklıdır. KBH olan hastalarda mümkün olduğu kadar düşük fosfat seviyeleri [30].

Düşük proteinli bir diyet, fosfatın düşük biyoyararlanımını indükler ve renal tübüler hücrelerde sodyuma bağımlı fosfat yeniden emiliminin bir aracısı olan serum FGF-23 [31,32]'yi azaltır. Bu, ileri KBH'deki fosfat düzenleme mekanizmasının, protein diyet içeriğinden tamamen bağımsız bir şekilde fosfat alımından bir şekilde etkilenebileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, 5/6-nefrektomi modelinde fosfat diyet içeriğinin CKD'nin ilerlemesi üzerindeki etkisini değerlendirdik. Daha önceki bir deneysel çalışma, fosfatın çok düşük proteinli bir diyete (0.3 g/kg) karşı antiproteinürik yanıtı değiştirebildiğini, serum fosfat seviyeleri ve fosfatüri arasında bir proteine ​​karşı antiproteinürik yanıtla bir korelasyon gösterdiğini göstermiştir. böbrek fonksiyonundan bağımsız olarak sınırlı protein diyeti [33]. KBH'li 11 hastayı (eGFR 30-55 mL/dk/m2) içeren çapraz bir çalışmada, serum fosfatın sirkadiyen ritmi, idrar fosfat atılımı, PTH veya FGF ile açıklanamayan yüksek fosfatlı bir diyetle değiştirildi. -23 [34]. Bu sonuç, bağımsız bir terapötik hedef olarak KBH hastalarında fosfat diyet kısıtlamasının önemini güçlendirmektedir.

Arter basıncı her iki grupta da benzer olduğundan, HiP grubunda hemodinamik durum böbrek fonksiyonunun kötüleşmesinde rol oynuyor gibi görünmemektedir. Ek olarak, modelimizde protein kısıtlaması ile açıklanabilecek önemli glomerüler hasar bulamadık. Ancak, HiP diyet grubunda daha fazla interstisyel fibrozis gözlemledik.

İnterstisyel fibroz, insanlarda ve sıçanlarda böbrek fonksiyon kaybı ile iyi ilişkilidir.

Önceki bir çalışma, peptidil-prolil izomeraz Pin 1 [35] yoluyla yüksek fosfatlı bir diyetle indüklenen renal fibroz gelişimini ilişkilendirirken, diğer makaleler aKlotho eksikliğinin zararlı rolüne dikkat çekmiştir.böbrekdoku fibrozu [36,37]. Deneysel modellerde Klotho'nun genetik olarak silinmesi yaşlanmaya, büyüme geriliğine ve kireçlenmelere neden olur [38]. FGF23-Klotho sinyali, renal fosfat yeniden emilimini engeller. CKD ortamında, renal tübüllerde Klotho ekspresyonu azalır [39]. Ayrıca, fosfattan zengin diyet, iskemi-reperfüzyon akut böbrek hasarı modelinde aKlotho eksikliğini şiddetlendirmiş veböbrekdoku fibrozu, CKD'nin ilerlemesini hızlandırır [18]. Fosfat diyetinin Klotho'nun renal ekspresyonu üzerindeki etkisi murin modellerinde zaten gösterilmiştir [40]. Muhtemelen, diğer yolların yanı sıra, aşırı fosfat yüklenmesi, tübüler hücrelerde Klotho ekspresyonunu modüle ederek böbrek fonksiyonunu kötüleştirir; ileriki çalışmalarda daha fazla araştırılmalıdır.

Apoptoz ve fibrozise TGF- [41,42] gibi sitokinler aracılık eder. Sekonder hiperparatiroidizm ve bunun sonucu olarak kardiyak yeniden şekillenme süreci üzerindeki daha yüksek TGF ekspresyonu ilişkisini tanımladık [43]. Güya, PTH aktivasyonu ile fibroblastların proliferasyonunu, kollajen sentezini ve fibrozisi uyaran TGF sinyali arasında bir ilişki vardır. TGF- ve PTH reseptörlerinin kemik hücreleri üzerindeki entegre etkisinin, kemiğin yeniden şekillenmesi sinyalleşmesini düzenlediğine dair deneysel kanıtlar bile vardır [44]. TGF-/Smad sinyallemesinin rolüböbrekhastalık zaten anlatıldı. TGF- bir transmembran reseptörüne bağlanır, Smads proteinlerinin fosforilasyonunu tetikler ve transkripsiyonel etkiler için çekirdeğe translokasyonlarını destekler. Bu nedenle, TGF- ailesinin üyelerinin sinyal iletimi için gereklidirler. Gerçekten de, KBH'li hayvan modellerinde fibrotik böbrekte Smad2 ve Smad3 proteinlerinin aşırı ekspresyonu zaten gösterilmiştir [45]. İlginç bir şekilde, gelişmiş glikasyon son ürünleri [46] ve anjiyotensin II [47] gibi TGF-'den bağımsız diğer aracılar tarafından Smads aktivasyonunun kanıtı vardır. Hiperfosfateminin CKD'nin ilerlemesi üzerindeki etkisi deneysel bir modelde PTH replasmanı tarafından etkilenmediği için [11], fosfatın böbrek Smad sinyallemesinde doğrudan bir rolü olup olmayacağını merak ediyoruz. Modelimizde renal tübüler hücrelerde p-Smad ekspresyonu üzerinde hiperfosfateminin etkisi yoktu.

Ancak bu, Smads fosforilasyonundan bağımsız olarak TGF yolu aktivasyonu olasılığını dışlamaz. Bu alternatif yolu araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Kemik dokusunun değerlendirilmesinde, aşırı fosfat yüklenmesi osteoblast benzeri hücrelerin apoptozunu indüklemiştir [22]. Rojas et al. transplante edilen hastaların kemik biyopsilerinde, düşük fosfatlılarda apoptotik hücre sayısının daha yüksek olduğunu ve PTH'nin osteoblastları artırmada ve apoptozu önlemede etkisi olacağını göstermiştir [48]. PTH'nin kemik hücre apoptozisi üzerindeki bu inhibitör etkisi daha önce gösterilmiştir [49]. Kemik dokusu üzerindeki etkilerin yanı sıra, apoptotik yolaklar da akut böbrek yetmezliği ile ilişkilidir [48] ve KBH'nin progresyonunda olası bir aracı olabilir. Modelimizde, istatistiksel alaka olmaksızın LoP grubunda apoptoz geçiren hücrelerin üstün bir oranını gözlemledik. Bu düşünceler, hiperfosfateminin neden olduğu bozulmuş bir apoptoz mekanizmasını düşündürür. Ancak, fosfatın fosfat üzerindeki münhasır etkisini değerlendirmenin mümkün olmadığını unutmamalıyız.böbrekhayvanlar da PTH ve FGF-23 yükselmesi geliştirdiğinde doku apoptozisi.

Mevcut çalışmada, yüksek fosfatlı bir diyetle böbrek yetmezliğinin bir başka olası mekanizmasını, otofagozomal membran çekirdeklenmesi için gerekli olan düzenleyici bir protein olan beclin-1 proteinini ölçerek otofaji disfonksiyonuna değindik [50]. Otofaji, hücresel bileşenlerin lizozomlar yoluyla parçalanmasını içeren katabolik bir yoldur [51,52]. Beclin-1 fosforilasyonu, fosfatidilinositol-3-fosfat kinaz kompleksi aktivasyonu ve otofagozom biyogenez membran bölgelerine alımı için otofajiye özgü sinyal olarak kabul edilmiştir [53]. beclin'in yıkılması-1 otofajiyi baskılar [54] ve iskemi-reperfüzyon seviyelerini arttırır [55]. Beclin'deki azalma- 1 ve eşlik eden mTOR yukarı regülasyonu, otofajinin hayatta kalma yanlısı etkisini vurgulayarak malign hücrelerin büyümesini azaltır [52].

Klotho'nun antifibrotik etkileri, aynı zamanda, AKI modelinde iskemik hasarın hafifletildiği ve yüksek fosfat seviyeleri tarafından bozulduğu bir yol olan yukarı regüle edilmiş bir otofaji süreci ile de ilişkilendirildi [18]. Deneysel çalışmalar, otofajik akışın makrofaj infiltrasyonunu ve fosfatın neden olduğu renal fibrozu azalttığını göstermiştir. Ek olarak, fosfat açısından zengin bir ortam, in vitro tübüler hücrelerde mitofajiye neden olur [56]. Verilerimiz, diyetteki fosfat içeriğinin, in vivo olarak renal tübüllerdeki beclin-1 ifadesini de modüle ettiğini gösterdi. Bir HiP diyeti ayrıca, sırasıyla PCNA ve TUNEL analizi ile gösterildiği gibi, daha fazla hücresel çoğalma ve daha düşük bir apoptotik orana doğru bir eğilim ile ilişkilendirildi. Bununla birlikte, modelimizde bunun fosfat aşırı yüklenmesinin doğrudan bir etkisi olarak mı yoksa hiperfosfateminin neden olduğu PTH ve FGF-23 düzeylerindeki anormallikler nedeniyle mi meydana geldiğini belirlemek mümkün değildi. Bu bulgunun klinik bir senaryoda doğrulanması gerekir.

Bu çalışmanın önemli bir avantajı, düşük proteinli bir diyette fosfat kısıtlamasının CKD progresyonu üzerindeki etkisini değerlendirmekti;böbrekdoku. Bildiğimiz kadarıyla bu, renal tübüler hücreler üzerinde bir otofaji belirteci olan beclin-1 ekspresyonunun modülasyonunu fosfat diyeti ile in vivo olarak gösteren ilk çalışmadır. Ana sınırlama, hiperfosfateminin etkisinin PTH ve FGF-23 yükselmesi gibi diğer CKD-MBD ile ilgili anormalliklerden ayrıştırılmasının imkansızlığıydı. Ara fosfat içeriği veya renal Klotho ekspresyonu olan bir diyeti de değerlendiremedik. Ancak modelimiz, bir HiP diyetinin genellikle hiperparatiroidizm ve yüksek FGF-23 seviyeleri ile ilişkili olduğu gerçek yaşam durumunu yeniden üretir.

4. Sonuçlar

Özetle, bu çalışma fosfat diyetinin KBH ilerlemesinde rol oynadığına ve muhtemelen interstisyel fibrozisi artırdığına dair kanıt sağladı. Ayrıca, fosfat açısından zengin bir diyet,böbrekotofaji süreci. Fosfatın böbrek fonksiyonunu kötüleştirdiği proteinden bağımsız bir yolun tanımlanması, klinik bir ortamda KBH ilerlemesini önlemeyi veya azaltmayı amaçlayan yeni yaklaşımların geliştirilmesi için önemli bir yol açabilir.

5. Malzemeler ve Yöntemler

Yerel bir tesisten temin edilen yetişkin erkek Münih-Wistar sıçanları bu çalışmaya dahil edildi. Sıçanlar, 23 ± 1 ◦C'de, hava nemi yüzde 60 ± 5'te, 12:12-saat aydınlık-karanlık döngüsü altında tutuldu. Tüm hayvanların musluk suyuna ücretsiz erişimi vardı ve düşük proteinli bir diyetle beslendi (yüzde 12 protein). Hayvanlar, kan, idrar ve böbrek dokusu analiz edildiğinde iki ay sonra kurban edildi. Tüm sıçanlarda kuyruk-kaf basıncı, kreatinin klirensi ve günlük idrar albümin atılımı belirlendi. Deney tasarımı Ek A'da gösterilmiştir (Şekil A1).

5.1. Analitik Teknikler

Nx'ten altmış gün sonra hayvanlara sodyum tiyopental (50 mg/kg BW) ile anestezi uygulandı ve kan örnekleri alındı. Serum kreatinin konsantrasyonu, kolorimetrik bir yöntemle değerlendirildi. Serum albümin, fosfat, üre, kalsiyum ve hematokrit standart yöntemlerle ölçüldü. PTH, ELISA (Immutopics, San Clemente, CA, ABD) ile ölçüldü. FGF-23, üreticinin protokolüne göre bir ELISA kiti (KAINOS, Japonya) kullanılarak ölçüldü. Glomerüler filtrasyonu kreatinin klirensi ile serum ve idrar kreatinin düzeylerine dayalı olarak hesapladık ve ml/dk olarak ifade edildi ve şu formülle hesaplandı: idrar kreatinin (mg/dL) × idrar arkadaşı (mL/dk)/serum kreatinin (mg/dL). İdrar albümini radyal immünodifüzyon ile belirlendi.

-solun üçte biriböbreksol renal arterin iki veya üç dalının kapanması ile. Sham ile ameliyat edilen sıçanlara anestezi uygulandı ve renal pediküllerin manipülasyonu böbrek kütlesinde azalma olmadan yapıldı. Anesteziden kurtulduktan sonra hayvanlar, takip eden 24 saat boyunca ısıtılan orijinal kafeslerine geri alındı.

Fraksiyonel fosfat atılımı (FEP), idrar ve serumfosfat (mg/dL), idrar ve serum kreatinin (mg/dL) yoluyla elde edildi ve aşağıdaki formülle yüzde olarak ifade edildi: (idrar/serum fosfat)/ (idrar/serum kreatinin) × 100.

5.2. Deney Grupları

Hayvanlar, aşağıda belirtildiği gibi, diyetteki fosfat içeriğine göre iki gruba ayrıldı: Düşük Fosfatlı diyet (LoP): n=20; hayvanlar TD-90016 aldı, yüzde 12 protein diyeti, yüzde 0.2 fosfat konsantrasyonu için modifiye edildi. Yüksek Fosfat diyeti (HiP): n=19; hayvanlar, yüzde 0,95 fosfat konsantrasyonu için modifiye edilmiş, yüzde 12 protein diyeti olan TD-90016 aldı.

5.3. Histolojik Teknikler

kalanböbrekgözlemlenen MAP'ta in situ salin solüsyonu ve ardından sabitleme için Duboscq-Brasil solüsyonu ile perfüze edildi. Tartıldıktan sonra, iki midkoronal renal dilim tamponlu yüzde 4 formaldehit içinde sonradan sabitlendi. Böbrek dokusu daha sonra parafine gömüldü ve daha önce tarif edildiği gibi histomorfometri ve immünohistokimya için hazırlandı [57].

Tüm morfometrik değerlendirmeler, gruplara kör olan tek bir gözlemci tarafından 4-µm-kalınlığındaki kesitlerde yapıldı. Her bir sıçan için, periyodik asit Schiff (PAS) ile boyanmış bölümlerde glomerülosklerozun (GS) şiddeti, küme alanının sklerozlu fraksiyonunu tahmin etmek için her bir glomerulusa (sıçan başına en az 120 incelenmiştir) bir puan verilerek tahmin edilmiştir. ve daha önce açıklandığı gibi her sıçan için bir GS indeksi (GSI) türetilmesi [58]. İnterstisyel genişlemenin derecesini değerlendirmek için, interstisyel fibrozis tarafından işgal edilen renal kortikal alanın yüzdesi (yüzde IF), bir nokta sayma tekniği ile Masson lekeli kesitlerde tahmin edildi [59].

5.4. immünohistokimya

Dört um kalınlığında, parafine gömülmüş böbrek kesitleri, yüzde 6 silan ile kaplanmış cam slaytlara monte edildi. Kesitler deparafinize edildi, yeniden hidratlandı ve daha sonra antijen alımını arttırmak için sitrat tamponunda ısıtıldı. Tris tamponlu salin (TBS) veya kazein bazlı Protein Blok solüsyonu (Protein Block; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, USA (PCNA, pSmad veBeclin için)), spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için. Primer antikor ile inkübasyon gece boyunca 4 ◦C'de gerçekleştirildi. Birincil antikor çıkarılarak negatif kontroller yapıldı.

Aşağıdaki birincil antikorlar kullanıldı: makrofaj tespiti için bir monoklonal fare anti-sıçan ED-1 antikoru (Serotec, Oxford, UK); -aktin tespiti için fare monoklonal anti-alfa pürüzsüz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ABD); otofaji analizi için poliklonal anti-Beclin 1 antikoru (Boster, Pleasanton, CA, ABD). Yıkandıktan sonra kesitler biyotinlenmiş anti-fare IgG (H artı L), (Vector, Burlingame, CA, ABD) ile 45 dakika inkübe edildi, ardından VECTASTAIN® ABC-AP Kit, Vector® Red (Vector, Burlingame, CA) takip edildi. , ABD) için30 dk. Kesitler daha sonra hızlı kırmızı bir boya çözeltisi ile geliştirildi.

Monoklonal fare anti-proliferatif hücre nükleer antijeni (Dako, Danimarka) ve fosfor-smad2 (Ser465/467) antikoru (Cell Signaling, Danvers, MA, ABD) için endojen peroksidaz inhibisyonu, yüzde 3 hidrojen peroksit çözeltisi ve 30 için metanol ile gerçekleştirildi. dk. Kesitler daha sonra 4 ◦C'de nemlendirilmiş bir odada birincil antikor ile gece boyunca inkübe edildi. Ertesi gün kesitler biyotinlenmiş anti-fare IgG (H artı L) veya biyotinlenmiş anti-sıçan IgG (H artı L) (Vector, Burlingame, CA, ABD) ile 45 dakika inkübe edildi, ardından VECTASTAIN® ABC- ile inkübe edildi. HRP Kiti (Vector, Burlingame, CA, ABD) 30 dakika. Kesitler daha sonra bir 3-amino-9-etil karbazol substrat kromojeni (AEC) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, ABD) kullanılarak geliştirildi. Tüm kesitler distile suda durulandı, Mayer's Hemalum solüsyonu (Merck, Darmstadt, Almanya) ile zıt boyandı ve Kaiser'in gliserin-jelatini (Merck, Darmstadt, Almanya) ile kaplandı.

ED-1, p-Smad, Beclin ve PCNA'nın interstisyel renal yoğunluk tahmini için, pozitif hücre sayısı/mm2, 400x büyütmede kör bir şekilde değerlendirildi. -aktin'i değerlendirmek için, bir video monitörüne bağlı bir 100-nokta okülere sahip bir mikroskop kullanarak bir nokta sayma tekniği kullandık. 3200 büyütme altında 25 alanı analiz ettik. Sonuçlar toplam alan dikkate alınarak yüzde olarak ifade edildi.

5.5. apoptoz

Apoptoz, Situ Apoptosis Detection Kit'te (S7101, Millipore Sigma, MA, ABD) Apoptag plusPeroxidase tarafından sağlanan talimatlar kullanılarak TUNEL tekniği (TdT aracılı X-dUTP Nick uç etiketleme) ile renal tübüler hücrelerde belirlendi. Apoptotik hücreler, hücre/mm2 olarak ifade edilen nihai değeri elde etmek için 1000x büyütme ile 25 alanda analiz edildi.

5.6. İstatistiksel analiz

LoP ve HiP grupları arasındaki farklar, buna göre bağımsız bir Student testi veya bir Mann-Whitney testi kullanılarak test edildi. Değişkenler arasındaki ilişkiler Spearman korelasyon katsayısı ile incelenmiştir. Veriler, aksi belirtilmedikçe ortalama ± SE olarak sunulur. p-değeri<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">

Finansman:Bu çalışma, Sáo Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP—Grant #. 2010/05409-6) tarafından desteklenmiştir. Moyses, Joorgetti, Zatz ve Elias, CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnol6gico) tarafından desteklenmektedir, ancak bu mali desteğin bu makalenin yazılmasında hiçbir rolü yoktur.

Kurumsal İnceleme Kurulu Açıklaması:Bu çalışma, yerel etik inceleme kurulunun tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP tarafından onaylandı (CEUA, süreç #090/10 ve onay tarihi 10 Ağustos 2010). Tüm deneysel prosedürler, laboratuvar hayvanlarının manipülasyonu ve bakımı için kesinlikle uluslararası standartları takip etti.

Veri Kullanılabilirlik Bildirimi:Bu çalışmada sunulan veriler, ilgili yazardan talep üzerine temin edilebilir.

Teşekkür:Yazarlar, uzman teknik yardımı için Wagner Dominguez'e teşekkür ediyor. Çıkar Çatışmaları: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Referanslar

1. Tepe, NR; Fatoba, ST; Tamam, JL; Hirst, JA; O'Callaghan, CA; Lasserson, DS; Hobbs, FD Kronik hastalığın küresel prevalansıböbrekhastalık—Sistematik bir inceleme ve meta-analiz. PLoS BİR 2016, 11, e0158765.

2. Wen, CP; Chang, CH; Tsai, MK; Lee, JH; Lu, PJ; Tsai, SP; Wen, C.; Chen, CH; Kao, CW; Tsao, CK; et al. Erken diyabetböbrekmüdahale yaşam beklentisini 16 yıl kısaltabilir. Böbrek İnt. 2017, 92, 388–396.

3. Kakinuma, Y.; Kawamura, T.; Faturalar, T.; Yoshioka, T.; Ichikawa, I.; Fogo, A. Anjiyotensin inhibisyonunun kronik böbrek yetmezliğinin vasküler lezyonları üzerindeki kan basıncından bağımsız etkisi.BöbrekInt. 1992, 42, 46-55.

4. Kızarmış, LF; Orchard, TJ; Kasiske, BL Lipid azalmasının böbrek hastalığının ilerlemesine etkisi: Bir meta-analiz.BöbrekInt. 2001, 59, 260-269.

5. İşidoya, S.; Morrissey, J.; McCracken, R.; Reyes, A.; Klahr, S. Angiotensin II reseptör antagonisti, tek taraflı üreter obstrüksiyonunun neden olduğu renal tübülointerstisyel fibrozu iyileştirir.BöbrekInt. 1995, 47, 1285–1294.

6. Audigier, JC; Kanjanbuch, T.; anne, LJ; Brown, NJ; Fogo, AB Aldosteronun inhibisyonu ile mevcut glomerülosklerozun gerilemesi. J. Am. Soc. Nefrol. 2005, 16, 3306–3314.

7. Nath, KA; Kren, SM; Hostetter, TH Sıçanlarda yerleşik böbrek hasarında diyet protein kısıtlaması. İlerleyici glomerüler disfonksiyonda glomerüler kapiller basıncının seçici rolü. J. Clin. Araştırın. 1986, 78, 1199-1205.

8. Brenner, BM; Meyer, TW; Hostetter, TH Diyet protein alımı ve progresif doğasıböbrekhastalık: Yaşlanma, renal ablasyon ve intrinsik böbrek hastalığında ilerleyici glomerüler skleroz patogenezinde hemodinamik aracılı glomerüler hasarın rolü. N. İngilizce J. Med. 1982, 307, 652-659.

9. Bellizzi, V. Kronik hastalarda düşük proteinli diyet veya beslenme tedavisiböbrekhastalık? Kan Purifi. 2013, 36, 41-46.

10. Kusano, K.; Segawa, H.; Ohnishi, R.; Fukuşima, N.; Miyamoto, K. Kronik hastalığın ilerlemesinde düşük protein ve düşük fosfor diyetinin rolüböbreküremik sıçanlarda hastalık. J. Nutr. bilim vitamin. 2008, 54, 237-243.

11. Neves, KR; Graciolli, FG; dos Reis, LM; Pasqualucci, CA; Moyses, RM; Jorgetti, V. Böbrek yetmezliği olan sıçanlarda hiperfosfateminin miyokardiyal hipertrofi, böbrek fonksiyonu ve kemik üzerindeki olumsuz etkileri.BöbrekInt. 2004, 66, 2237-2244. [CrossRef] [PubMed]

12. Finch, JL; Lee, DH; Liapis, H.; Ritter, C.; Zhang, S.; Suarez, E.; Ferder, L.; Slatopolsky, E. Fosfat kısıtlaması, yerleşik vasküler kalsifikasyona sahip üremik sıçanlarda mortaliteyi önemli ölçüde azaltır. Böbrek İnt. 2013, 84, 1145–1153.

13. Cupisti, A.; Blasco, P.; D'Alessandro, C.; Giannese, D.; Sabatino, A.; Fiaccadori, E. Artık böbrek fonksiyonunun korunması ve beslenme tedavisi: Son dönem böbrek hastalığı hastalarında üremik toksinlerin azaltılması için ilk adım stratejisi. Toksinler 2021, 13, 289.

14. Yan, B.; Su, X.; Xu, B.; Qiao, X.; Wang, L. Diyet protein kısıtlamasının kronik hastalığın ilerlemesine etkisiböbrekhastalık: Sistematik bir inceleme ve meta-analiz. PLoS ONE 2018, 13, e0206134. [CrossRef] [PubMed]

15. Klahr, S.; Levey, AS; Beck, GJ; Çağlayan, AW; Hunsicker, L.; Kusek, JW; Striker, G. Diyet protein kısıtlamasının ve kan basıncı kontrolünün kronik böbrek hastalığının ilerlemesi üzerindeki etkileri. Böbrek hastalığı çalışma grubunda diyetin değiştirilmesi. N. İngilizce

J. Med. 1994, 330, 877-884. [Çapraz Referans]

16. Hu, MC; Şi, M.; Cho, HJ; Adams-Huet, B.; Paek, J.; Tepe, K.; Shelton, J.; Amaral, AP; Faul, C.; Taniguchi, M.; et al. Klotho ve fosfat, patolojik üremik kardiyak yeniden şekillenmenin modülatörleridir. J. Am. Soc. Nefrol. 2015, 26, 1290-1302.

17. Hu, MC; Şi, M.; Cho, HJ; Zhang, J.; Pavlenco, A.; Liu, S.; Sidhu, S.; Huang, LJ; Moe, OW Eritropoietin reseptörü, Klotho ile indüklenen sitoproteksiyonun aşağı akış efektörüdür. Böbrek İnt. 2013, 84, 468-481.

18. Şi, M.; Flores, B.; Gillings, N.; Bian, A.; Cho, HJ; Yan, S.; Liu, Y.; Levine, B.; Moe, OW; Hu, MC alphaKlotho, otofajinin aktivasyonu yoluyla AKI'nin CKD'ye ilerlemesini azaltır. J. Am. Soc. Nefrol. 2016, 27, 2331–2345.

19. Ding, Y.; Kim, S.; Lee, SY; Koo, JK; Wang, Z.; Choi, ME Otofajisi, TGF-beta ekspresyonunu düzenler ve baskılarböbrekTek taraflı üreter obstrüksiyonunun neden olduğu fibrozis. J. Am. Soc. Nefrol. 2014, 25, 2835–2846.

20. Moustakas, A.; Souchelnytskyi, S.; Heldin, TGF-beta sinyal iletiminde CH Smad düzenlemesi. J. Hücre Bilimi. 2001, 114, 4359-4369.