Siklo-oksijenaz(COX-2) ve Hipoksiye Bağlı Hastalık Arasındaki İlişki

daha fazla bilgi için:ali.ma@wecistanche.com

Hücre içi prostaglandin E2, hipoksiye bağlı proksimal tübüler hücre ölümüne katkıda bulunur

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Proksimal tübüler hücreler (PTC), hipoksi ile indüklenen apoptoza karşı özellikle hassastır.böbrek hastalığı. Burada, hipoksi altında PTC ölümünün, hipoksi nedeniyle insan proksimal tübüler HK-2hücrelerinde doğrulanan siklo-oksijenaz (COX-2)-bağımlı prostaglandin E(PGE,) üretiminin aracılık ettiğini varsaydık. (yüzde 1 O,) kaynaklı apoptoz (i) bir COX-2(siklo-oksijenaz) inhibitörü ve prostaglandin (EP)reseptörlerinin antagonistleri tarafından ve (ii) hipoksi ile indüklenebilir faktöre bağlı olarak hücre içi PGE'de (iPGE) bir artışla ilişkilendirildi-1 -COX'in transkripsiyonel yukarı regülasyonu{{3 }}(döngü-oksijenaz). Apoptoz, iPGE'nin hipoksi kaynaklı apoptoza katkıda bulunduğunu belirten prostaglandin alım taşıyıcısı PGT'nin inhibitörleri tarafından da önlendi (aksine, hipoksi/reoksijenasyon kaynaklı PTC ölümü yalnızca hücre dışı PGE'ye bağlıydı). Bu nedenle, iPGE, hipoksiye bağlı tübüler hasarın patogenezinde yeni bir aktördür ve PGT, böbrek hastalıklarında hipoksiye bağlı lezyonların önlenmesi için yeni bir terapötik hedef olabilir.

Tübüler hipoksinin hem akut hem de kronik hastalık için ilgili bir faktör olduğu iyi bilinmektedir.böbrek hastalığı'2 Proksimal tübüler hücreler (PTC), enerji gerektiren yeniden emilim aktiviteleri nedeniyle oksijen tüketimi açısından oldukça aktiftir ve sonuç olarak hipoksiye karşı savunmasızdırlar. Apoptozun, hipoksiye maruz kalan kültürlenmiş PTC'de ilgili bir rol oynadığı gösterilmiştir, ancak apoptotik makinenin aktivasyonundan sorumlu sinyal yolları araştırılmamıştır. Biz ve diğerleri, vücuttaki sayısız fizyolojik ve patolojik sürecin önemli bir lipid aracısı olan prostaglandin E'nin (PGE) olduğunu bulduk.böbrek, sisplatin7, albümin8 veya leptin ve gentamisin ile tedavi üzerine PTC apoptozuna yol açan sinyalleşmede ilgili bir rol oynar. Tüm durumlarda, PGE'deki artışın, siklo-oksijenazın gelişmiş ifadesine bağlı olduğu bulundu-2(COX-2)(siklo-oksijenaz), COX-1l ​​ile birlikte prostaglandinlerin sentezinde hız sınırlayıcı adım olan indüklenebilir bir enzimdir. insandaböbrek, bazal COX-2(siklo-oksijenaz)ifade, COX-1'unkinden daha az yoğundur. COX-2(siklo-oksijenaz)podositlerde ve Henle kulpunun bölümlerinde ve fizyolojik koşullar altında renal vaskülatürde tanımlanmıştır10. Bununla birlikte, patolojik durumlarda, COX-2 immünreaktivitesi, hücre içindeki birçok hücre tipinde bulunabilir.böbrekPTC dahil ve muhtemelen böbrek hasarına katkıda bulunur. İlginç bir şekilde, hipoksi, COX ifadesini artırır-2(siklo-oksijenaz)ve/veya birçok hücre tipinde PGE,12-i7 üretimi. Aslında, hipoksinin PGE'deki hücre içi içeriği ve bunun hücre dışı ortama salınımını arttırdığını daha önce bulduk. Bu nedenle, PGE'nin hipoksinin PTC üzerindeki apoptotik etkisine aracılık etmesi teorik olarak mümkündür.

PGE'ye bağımlı apoptoz üzerine yapılan çoğu çalışma, esasen hücre dışı PGE'yi içeren mekanizmalara odaklanmıştır, çünkü PGE'nin biyolojik etkilerini, plazma membranını kapsayan G-proteinine bağlı PGE, reseptörlerinin (E serisi prostaglandin reseptörleri) aktivasyonu yoluyla uyguladığı yaygın olarak kabul edilmektedir. EP1-4)1. Bununla birlikte, bazı modellerde, hücre içi PGE,(iPGE,) apoptotik hücre ölümüyle ilgilidir720-22. Bu, apoptozu indüklemek için PGE'nin tekrar hücre içi ortama ulaşması ve hücrenin içinde yer alan EP reseptörlerinin bir alt grubunu (iEP reseptörleri) aktive etmesi gerektiği anlamına gelir. PGE'yi yakalama görevi esas olarak prostaglandin alım taşıyıcısı (PGT)23-26 tarafından yapıldığından, PGT inhibisyonu, iPGE aracılı apoptotik hücre ölümünün önlenmesi ile sonuçlanır7.

Bu arka planı dikkate alarak, mevcut çalışmada bir COX-2 olup olmadığını inceledik.(siklo-oksijenaz)iPGE'de bağımlı artış, seviyeler PTC'de hipoksi ile indüklenen apoptoza aracılık eder.

Böbrek hastalığı için organik Cistanche için tıklayın

yöntemler

Reaktifler.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, kristal violet, tripan mavisi solüsyonları, Bromosulfophthalein (BRS), 3-(5'-Hydroxymethyl2'-furyl)-1-benzyl indazol (YC1), ve aktinomisin D, Sigma'dan (St. Louis, MO, ABD) satın alındı. Z-VAD-FMK ve selekoksib sırasıyla Calbiochem'den (Darmstadt, Almanya) ve Cayman Chemical'dan (Ann Arbor, MI, ABD) alındı. TriReagent, Vitro(Madrid, İspanya)'dan satın alındı ​​ve PVDF membranları ve Western blot luminol reaktifi, Santa Cruz Biotechnology'den (Santa Cruz, CA. USA) satın alındı. ProLong Gold solmaya karşı reaktif, 4,6-diamidino{{14 ile }}fenil indol (DAPI), anneksin-V-FITC(floresein izotiyosiyanat)/propidyum iyodür (PI) apoptoz tespit kiti ve 2',7'-diklorofloresan diasetat(DCFH-DA)probu Invitrogen(Carlsbad, CA, ABD) ve Moleküler Sondalar (Oregon, ABD), sırasıyla. Antikorlar şu kaynaklardan elde edildi: anti-PGE ve anti-COX-2(siklo-oksijenaz)antikorlar, Abcam'dan (Cambridge, UK); anti-Bax ve anti-Bcl-2, Santa Cruz Technologies'dendi (Santa Cruz, CA.USA); anti-HIF-la antikoru ve -rabbit-Alexa-Fluor 488, sırasıyla BD Biosciences (Palo Alto, CA, ABD) ve Invitrogen'den (Carlsbad, CA, ABD); anti- -aktin ve tavşan anti-fare IgG peroksidaz konjugatı Sigma'dan (St.Louis, MO, ABD) satın alındı.

Hücre kültürü ve deneysel koşullar.

İnsan proksimal tübüler HK-2 hücreleri, American Type Culture Collection'dan (ATCC) (Rockville, MD, ABD) satın alındı. Hücreler, yüzde 10 fetal sığır ile desteklenmiş 37 derece Cin DMEM/F12'de yüzde 5 CO içinde tutuldu serum(FBS), yüzde 1 penisilin/streptomisin/amfoterisin B ve yüzde 1 glutamin(Invitrogen. Carlsbad, CA, ABD) ve yüzde 1 insülin-transferrin-selenyum(ThermoFisher. Grand Island, NY, ABD). Tüm deneylerde, hücreler yüzde 70-90 izdihamda kaplandı ve tamamen bağlandıklarında hipoksik (yüzde 1) veya normoksik koşullar (yüzde 21 oksijen) altında kültürlendiler.hipoksideneyler bir In vivo200'de yapıldıhipoksiiş istasyonu(Ruskin Technology, West Yorkshire, Birleşik Krallık). İçinhipoksi/reoksijenasyon deneyleri, hücrelerhipoksi24 saat süreyle ve daha sonra hücreler, normoksik koşullarda 3 saate kadar (reoksijenasyon süresi) inkübe edildi.

iPGE'nin immünofloresan analizi ve COX'in Western blot analizi-2(siklo-oksijenaz)ve HIF-1 .

İmmünofloresan analizi ve Western blot analizi için hücreler sırasıyla cam lameller (4x104 hücre/cam lamel) veya altı oyuklu plakalar (15x104hücre/çukur) üzerine bölünmüş ve "Sonuçlar" bölümünde açıklandığı gibi inkübe edilmiştir. Ardından, immünofloresan ve immünoblotlama analizi, esasen daha önce tarif edildiği gibi yapıldı. Anti-vücut çalışma dilüsyonları: PGE için 1/50, COX için 1/1000-2(siklo-oksijenaz)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 ve -aktin için 1/5000. İmmünofloresan tespiti, Biyomühendislik, Biyomateryaller ve Nanotıp (CIBER-BBN) Biyomedikal Araştırma Ağı Merkezi'nin Konfokal Mikroskopi Servisi (ICTS 'NANBIOSIS'U17) aracılığıyla bir Leica SP5 konfokal mikroskobu (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) kullanılarak yapıldı. Alcal Üniversitesi, Madrid, İspanya)

Geçici transfeksiyon.

siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), vahşi tip insan 15-hidroksi-prostaglandin dehidrojenazın (p15-PGDH) cDNA'sını içeren memeli ifade vektörü pcDNA3 veya insan COX'i için lusiferaz raportör plazmit yapıları-2(siklo-oksijenaz)phpES2-Luc, insanhipoksiyanıt elemanı (HRE)p9HIF1-Luc ve R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) ve lusiferaz aktivitesinin belirlenmesi, başka bir yerde27,28 açıklandığı gibi yapıldı.

Hücre sayısı ve hücre/çekirdek morfolojisi.

Yapışan hücrelerin sayısı, modifiye edilmiş bir kristal menekşe boyama yöntemiyle spektrofotometrik olarak belirlendi2. Apoptoz kanıtını saptamak için, faz kontrast mikroskobu kullanılarak hücre morfolojisi gözlemlendi. Hücre çekirdekleri, daha önce tarif edildiği gibi DAPI ile DNA boyamasından sonra görselleştirildi0, İncelenen tipik apoptotik morfoloji, hücresel büzülme, nükleer yoğunlaşma ve parçalanma ve apoptotik cisimlerin oluşumunu içeriyordu. Kantifikasyon için, apoptoz benzeri görünüme sahip çekirdeklerin yüzdesini tahmin etmek için her deneysel koşulda kör bir şekilde altı alan incelendi.

Akış sitometrisi apoptoz tahlili ve tripan mavisi boya dışlama testi ile hücre canlılığı tahlili.

Plakaya yapışık hücreler tripsinizasyon ile ayrıldı ve daha önce kültür ortamından geri kazanılan ayrılmış hücrelerle birlikte tahlil için kullanıldı.

Annexin-V-FITC/PI apoptoz saptama kiti, daha önce açıklandığı gibi apoptotik ve nekrotik HK-2 hücrelerinin akış sitometrisi saptamasına izin verdi7.Erken ve geç apoptotik hücreler sırasıyla annexin V boyamasına ve hem anneksin hem de annexin V'ye pozitifti boyama. Nekrotik hücreler sadece PI'ye pozitifti ve canlı HK-2 hücreleri hiç boyanma göstermedi.

Hücre canlılığını değerlendirmek için tripan mavisi boya dışlama testi kullanıldı. Canlı hücreler (beyaz) ve ölü hücreler (mavi) bir ışık mikroskobu ve bir hemositometre kullanılarak sayıldı.

İstatistiksel analiz.

Her bir deney en az üç kere tekrar edildi. Sonuçlar ortalama±SEM olarak ifade edilir. Tek yönlü bir varyans analizine (ANOVA) ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni testine tabi tutuldular. Önem düzeyi P Küçük veya 0.05'e eşit olarak ayarlandı.

Sonuçlar

Hipoksi, proksimal tübüler HK-2 hücre ölümüne neden olur.

hipoksikristal menekşe deneyi ile değerlendirildiği gibi HK-2 hücrelerinin sayısını azalttı(Şekil la) ve ayrıca hücre yuvarlanmasını ve plakadan ayrılmasını sağladı(Şekil lb, üst panel). Beklenildiği gibi,hipoksibelirgin nükleer yoğunlaşma, parçalanma ve apoptotik benzeri cisimlerin oluşumu ile hücre büzülmesi gibi apoptozun açık morfolojik özelliklerine sahip bir hücre ölümü modelini tetikledi (Şekil lb'de DAPI ile nükleer boyamaya bakın, alt panel, sol).hipoksiindüklenen apoptoz, akış sitometrisi ile değerlendirildiği gibi anneksin V-FITC boyamasının artması ve pan-kaspaz inhibitörü Z-VAD-FMK ile önlenmesiyle daha da doğrulandı (Şekil lc).hipoksiayrıca canlı hücre sayısında bir azalma saptadı, ancak nekrotik hücre sayısında istatistiksel olarak anlamlı değişikliklere neden olmadı (Şekil lc, ek).

Şekil 1. Hipoksi, proksimal tübüler HK-2 hücre ölümünü indükler.(a) Azaltılmış hücre sayısı (kristal menekşe tahlili). (b) Apoptozun morfolojik özellikleri. Temsili faz kontrastlı fotomikrograflar(üst panel, orijinal büyütme, 10×)DAPI boyama fotomikrografları (alt panel, orijinal büyütme,40×). (c) Apoptozda artış (akış sitometrisi çalışmaları). Anneksin V artı hücreler, Anneksin V artı /propidyum iyodür-hücrelerini (yani, korunmuş plazma zarı bütünlüğüne sahip erken apoptotik hücreler) ve anneksin V artı /propidyum iyodür artı hücrelerini (yani geç apoptotik hücreler) içerir. Ek: Hücre popülasyonlarının türleri(Annexin V-/ propidium iyodür artı hücreler nekrotik hücrelerdir ve annexin V-/ propidium iyodür-canlı hücrelerdir). Sonuçlar, toplam olay sayısına göre yüzde olarak ifade edilir. Genel bilgi:(1) Hücreler, "Yöntemler" bölümünde belirtildiği gibi normoksik (yüzde 21 O2) veya hipoksik （ yüzde 1 O, ） koşullarında 24 saat süreyle inkübe edildi. pan-kaspaz inhibitörü Z-VAD-FMK （25 μM） maruz kalmaya başlamadan 1 saat önce eklendihipoksi. (2) Mikrofotoğraflar, üç bağımsız deneyin temsili örnekleridir. Grafiklerdeki çubuklar ve hata çubukları: Her çubuk, 3 farklı deneyin ortalama±SEM'ini temsil eder *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hipoksi;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hipoksiartı ZVAD.

COX-2(siklo-oksijenaz)/iPGE,/EP reseptör yolu, hipoksi tarafından indüklenen proksimal tübüler HK-2 hücre ölümüne aracılık eder.

COX'in rolünü değerlendirmek için-2(siklo-oksijenaz)/iPGE2/EP reseptör yoluhipoksiindüklenmiş HK-2 hücre ölümü, ilk önce hücreleri bir COX olan selekoksib ile önceden inkübe ettik-2(siklo-oksijenaz)inhibitör1; EP1, EP2 ve EP3 reseptörlerinin bir antagonisti olan AH6809 veya EP4 reseptörünün bir antagonisti olan GW627368X; veya her ikisinde de bromokresol yeşili veya bromosul-foftale ile PGT435.PGT inhibitörleri de siRNA ile transfeksiyon yoluyla düşürüldü.

Şekil 2. COX-2(siklo-oksijenaz)/iPGE,/EP reseptör yolu, hipoksi ile indüklenen proksimal tübüler HK-2 hücre ölümüne aracılık eder.(a) Yolun inhibitörleri tarafından hücre ölümünün önlenmesi. Üst panel; Çubuklar, toplam hücre ölümünün yüzdesini (solda) veya apoptotik anneksin V artı hücrelerin yüzdesini (sağda) gösterir. maruz kalmadan öncehipoksi, hücreler 1 saat süreyle 3 μM selekoksib（COX-2 ile önceden inkübe edildi(siklo-oksijenaz)inhibitör）;10 μuM AH6809, （EP1-3 reseptör antagonisti）, 10 μM GW627368X（EP4 reseptör antagonisti）; veya 50 μM bromokresol yeşil （BG） veya 25 μM bromosülfofthalein(BrS), iki PGT inhibitörü ile. Alt panel: Sol: siRNA (tripan mavisi dalış dışlama testi) ile transfeksiyon yoluyla PGT'yi devirerek hücre ölümünün önlenmesi. Ek: PGT'nin yıkılmasının etkinliği (Western blot analizi) Sağ: Bromokresol yeşilinin (BG) önleyici etkisinin konsantrasyon bağımlılığı. (b)Prostaglandin inaktive edici enzim 15-hidroksi-prostaglandin dehidrogenaz(15-PGDH) cDNA(tripan mavi boya dışlama testi) içeren bir memeli ekspresyon vektörü ile transfeksiyon yoluyla hücre ölümünün önlenmesi. 11}}PGDH(Western blot analizi) transfekte edilmiş hücrelerde. (c)hipoksiiPGE'de PGT'ye duyarlı bir artışa neden olur,Sol: PGE, tek başına veya DAPI ile nükleer boyama ile birleştirilmiş bağımlı immünofloresan gösterilir (orijinal büyütme,40×) Sağ: Sol panelde Image J yazılımı kullanılarak sunulan görüntülere kantitatif yaklaşım. (d) EGFR aktivasyonu AG1478 inhibitörü, HK-2 hücre ölümünü EGFR engellemez. Hücreler, maruz bırakılmadan önce 1 μM AG1478 ile 1 saat önceden inkübe edildi.hipoksi. （e） PGT inhibitörü BG, altındaki HK-2 hücrelerinde Bax ve Bcl-2 ifadesini değiştirmez.hipoksi(Western leke analizi). (f) Önlenmesihipoksi/ yolağın inhibitörleri tarafından reoksijenasyon kaynaklı hücre ölümü (tripan mavi boya dışlama testi). Hücreler, yolun inhibitörleri ile önceden inkübe edildi vehipoksi(a)'daki gibi. Daha sonra hücreler, 3 saat boyunca normoksiye maruz bırakıldı. Genel bilgi:(1) Hücreler, "Yöntemler" bölümünde belirtildiği gibi normoksik (yüzde 21 O) veya hipoksik (yüzde 1 O,) koşullarda 24 saat süreyle inkübe edildi. (2) Mikrofotoğraflar, üç bağımsız deneyin temsili örnekleridir. (3) İnhibitörlerin çözücüleri (luL/mL ortamı)hipoksihücre ölümü üzerine (sonuçlar gösterilmemiştir). (4) Western blot analizi: Eşit protein, bir anti- -aktin veya bir anti-GAPDH antikoru ile sondalama yapılarak doğrulandı. (5)Grafiklerdeki çubuklar ve hata çubuğu: Her çubuk, 3 farklı deneyin ortalama±SEM'ini temsil eder.*P<0.01><0.01>hipoksiveyahipoksi/reoksijenasyon.

Şekil 2a'da gösterildiği gibi,hipoksi-indüklenen proksimal tübüler hücre ölümü tüm durumlarda önlendi. Apoptozun selekoksib tarafından inhibisyonu, COX-2(siklo-oksijenaz)ilgili bir rol oynarhipoksi-indüklenmiş apoptotik hücre ölümü (Şekil 2a, üst panel, sağ). Daha spesifik olarak, apoptozun EP reseptörlerinin antagonizması ile önlenmiş olması, apoptoza COX'in aracılık ettiğini gösterir-2(siklo-oksijenaz)PGE'nin -bağımlı üretimi. Öte yandan, iPGE'nin katkıda bulunması muhtemeldir.hipoksi(i) PGT'nin inhibisyonu (Şekil 2a) veya (i) iPGE2'yi inaktive eden 15-PGDH'nin (Şekil 2b) aşırı ekspresyonu ile önlendiği için HK-2 hücre ölümü ile indüklenmiştir. oksidasyon25(not olarak, transfeksiyon prosedürünün kendisi HK-2 hücrelerininhipoksi: hücre ölümü, transfekte edilmemiş hücrelerde yüzde 15-20 ile karşılaştırıldığında, kontrol koşullarında transfeksiyon için yüzde 45-55 idi). iPGE'nin katkısına daha fazla destek,hipoksiindüklenen HK-2 hücre ölümü, önceki bulgularımızdır.hipoksiiPGE,1'in hücre içeriğinde bir artış olduğunu ve bu artışın PGT inhibitörleri tarafından önlendiğini belirler (Şekil 2c).

MAPK sinyal yolakları apoptozu indükleyebilir, çünkü iEP reseptörleri epidermal büyüme faktörü reseptörünü (EGFR) 36, MAP kinazları ERK1/2 ve p38'in HK-2 hücrelerinde0 aktivasyonuna yol açan transaktive ettiğinden, önceden olup olmadığını sorduk. EGFR aktivasyonu AG1478 inhibitörü ile HK-2 hücrelerinin inkübasyonu önlendihipoksi-indüklenen hücre ölümü. Negatif sonuçlar bulduk(Şekil 2d) ve bu nedenle, EGFR'nin transaktivasyonunun HK-2 hücre ölümüne aracılık etmesi olası değildir.hipoksi.

Birkaç deneysel modelde, mitokondriyal kaynaklı ATP'nin indirgenmesi sırasındahipoksiproapoptotik protein Bax ila anti-apoptotik protein Bcl-2 ekspresyon oranında bir artışa neden olur, bu da sitozole sitokrom C salınımına, kaspaz 9'un aktivasyonuna ve ardından aşağı akış, efektörün bölünmesine ve aktivasyonuna yol açar. kaspazlar37,38. Ancak, aşağıdaki HK-2 hücrelerinde PGT inhibitörü BG ile ön inkübasyonhipoksiHK-2 hücresinde bu proteinlerin rolünü desteklemeyen Bc-2 ve Bax(Şekil 2e) ekspresyonu arasındaki dengede anti-apoptotik bir kayma ile uyumlu değişikliklerle sonuçlanmadı. altında ölümhipoksi.

Hipoksik maruziyeti takiben, reoksijenasyon epizodları (iskemi/reperfüzyon hasarı) ek hücre hasarını indükleyebilir. Reoksijenasyon hasarının "paradoksu", hücrelerin enzim aktivitelerinde, mitokondriyal fonksiyonda, hücre iskelet yapısında, membran taşınmasında ve antioksidan savunmalarında spesifik değişikliklere maruz kaldıkları dikkate alınarak anlaşılabilir.hipoksi, daha sonra toplu olarak reoksijenasyon hasarına zemin hazırlar39. Reoksijenasyon, iskemik inme, böbrek nakli, dolaşım yetmezliği veya böbrek ve kardiyovasküler cerrahi sırasında akut böbrek hasarına katkıda bulunur. Bu bağlamda, inhibisyonunun potansiyel terapötik değerihipoksi/COX'e müdahale yoluyla reoksijenasyon kaynaklı proksimal tübüler hücre ölümü-2(siklo-oksijenaz)/iPGE,/iEP reseptör yolu belirgindir. Bu nedenle, iPGE'nin özellikle aracılık edip etmediğini sorduk.hipoksiindüklenen hücre ölümü veya ayrıca aracılık ederhipoksi/reoksijenasyon kaynaklı hücre ölümü(in vivo renal iskemi/reperfüzyon hasarını taklit eden bir in vitro model). Şekil 2f'de gösterildiği gibi, hücre ölümü (tripan mavisi dalış dışlama testi ile değerlendirildiği gibi) COX tarafından önlenmiştir-2(siklo-oksijenaz)inhibitör selekoksib ve ayrıca EP reseptör antagonistleri AH6809 veya GW627368X tarafından. Şekil 2a'dakiyle aynı, bu sonuçlar COX-2'ün şu konularda ilgili bir rol oynadığını gösteriyor:hipoksi/reoksijenasyon kaynaklı hücre ölümü ve daha spesifik olarak, hücre ölümüne COX aracılık eder-2(siklo-oksijenaz)EP reseptörlerinin antagonizması ile önlendiği için PGE'nin bağımlı üretimi. Bununla birlikte, hücre ölümü, PGT inhibitörleri bromokresol yeşili veya bro-musülfoftalein tarafından önlenmediğinden (Şekil 2f ve Ek Şekil 2d), daha olasıdır.hipoksi/reoksijenasyon ile indüklenen HK-2 hücre ölümüne özel olarak hücre dışı PGE aracılık eder.

COX'in HIF-1 -bağımlı transkripsiyonel düzenlemesi-2(siklo-oksijenaz)gen ifadesi katkıda bulunurhipoksiproksimal tübüler HK-2 hücrelerinde iPGE'de indüklenen artış. PGE, biyosentez, araşidonik asidin membran gliserofosfolipidlerinden fosfolipaz A tarafından salınmasını, ardından araşidonik asidin COX izoenzimleri tarafından prostaglandin H'ye dönüştürülmesini ve son olarak, prosta bezinin H'deki prosta bezinin PGE'ye, prostaglandin E sentazları tarafından izomerizasyonu ile gerçekleşir. örneğin mikrozomal PGE sentaz-1 (mPGES-1)19. bunu buldukhipoksiHK-2 hücrelerinde indüklenen apoptoza büyük olasılıkla bir COX-2 aracılık eder(siklo-oksijenaz)PGE üretiminde -bağımlı artış,(Şekil 2). Verilen COX-2(siklo-oksijenaz)ifadesi tarafından indüklenebilen bir enzimdir.hipoksiolduğunu varsaydık, birhipoksiPGE'de indüklenen artış, HK-2 hücrelerindeki üretim, COX ifadesindeki bir artışın sonucu olabilir-2(siklo-oksijenaz). Hipotezimizi doğrulamak için, (i)hipoksiCOX-2 ifadesi üzerine(siklo-oksijenaz)protein ve mRNA ve (ii) COX'in etkisi-2(siklo-oksijenaz)inhibitör selekoksibhipoksiiPGE'de indüklenen artış, Sonuçlarımız göstermiştir kihipoksiCOX'in geçici bir şekilde transkripsiyonel yukarı regülasyonu ile belirlenir-2(siklo-oksijenaz)ifade(Şekil 3a,b)ve bu COX-2(siklo-oksijenaz)inhibisyon, altındaki HK-2 hücrelerinde iPGE'deki artışı köreltti.hipoksi(Şek.3c). İlginçtir,hipoksiayrıca mPGES-1 protein ifadesinin geçici yukarı regülasyonunu belirledi (Şekil 3a, ek), ancak mPGES-1 mRNA ifadesini etkilemedi (Şekil 3b. ek). Bu sonuçlar, COX-2 ifadesinin arttığını gösterdi.(siklo-oksijenaz)ve mPGES-1 şunlardan sorumludur:hipoksiiPGE'de indüklenen artış.

Şekil 3. COX-2'un HIF-la'ya bağımlı transkripsiyonel düzenlemesi(siklo-oksijenaz)gen ekspresyonu, proksimal tübüler HK-2 hücrelerinde iPGE'de hipoksi ile indüklenen artışa katkıda bulunur.(a)COX ifadesi-2(siklo-oksijenaz)protein geçici olarak artarhipoksi(Western leke analizi). Ek: İfade mPGES-1 proteini ayrıca geçici olarak yukarı regüle edilir.hipoksi. (b)İfade COX-2(siklo-oksijenaz)mRNA geçici olarak artarhipoksi. Ek: mPGES-1 mRNA'nın ifadesi şunlardan etkilenmezhipoksi. (c)Bir COX olan selekoksib ile önleme-2(siklo-oksijenaz)tarafından indüklenen iPGE'deki artışın inhibitörühipoksi. Hücreler 1 saat 3 μM selekoksib ile ön inkübe edildi. Sol∶PGE'ye bağlı, tek başına veya DAPI ile nükleer boyama ile birleştirilmiş immünofloresan gösterilmiştir (orijinal büyütme, 40x). Sağ: Sol panelde sunulan görüntülere Image J yazılımı kullanılarak nicel yaklaşım. (d) Transkripsiyonel mekanizmaların katkısı. Sol: Transkripsiyonel inhibitör aktinomisin D(Act. D), birhipoksiCOX'de tetiklenen artış-2(siklo-oksijenaz)protein ekspresyonu(Western blot analizi). Hücreler, 1 ug/ml Act ile 1 saat süreyle ön işleme tabi tutuldu. D maruz kalmadan öncehipoksi3 saat için. Sağ: COX etkinliğinde artış-2(siklo-oksijenaz)muhabir yapısı. (e) HIF-la YC-1 inhibitörü şunları önler:hipoksiindüklenmiş transkripsiyonel COX-2(siklo-oksijenaz)yukarı düzenleme. Hücreler, 0.5 uM YC-1 ile 1 saat süreyle ön inkübe edildi. Sol: COX'in Önlenmesi-2(siklo-oksijenaz)yukarı düzenleme. Hücreler maruz kaldıhipoksi8 saat için. Merkez: Bir COX etkinliğindeki artışın önlenmesi-2(siklo-oksijenaz)muhabir yapısı. Sağ: İHE tarafından yönlendirilen bir raportör yapısının faaliyetinin engellenmesi. Hücreler maruz kaldıhipoksi8 saat için.(f) HIF-la inhibitörü YC-1 apoptotik hücre ölümünü arttırır(akış sitometrisi çalışmaları). maruz kalmadan öncehipoksi, hücreler 0,5 uM YC-1 ile 1 saat önceden inkübe edildi. Inset∶ YC-1hipoksiHIF-1bir ifadede indüklenen artış (Western blot analizi). Genel bilgi:(1)Hücreler, "Yöntemler" bölümünde belirtildiği gibi normoksik (yüzde 21 O) veya hipoksik (yüzde 1) koşullarda 24 saat süreyle inkübe edildi. (2) Mikrofotoğraflar, üç bağımsız deneyin temsili örnekleridir. (3)Western blot analizi: Eşit protein, bir anti- -aktin antikoru ile problanarak doğrulandı (4) Grafiklerdeki çubuklar ve hata çubukları: Her çubuk, 3 farklı deneyin ortalama±SEM'ini temsil eder *P<0.01 vs.="" other="">

COX artışına transkripsiyonel mekanizmaların katkısını daha fazla incelemek için-2(siklo-oksijenaz)altında protein ifadesihipoksi, COX ifadesi-2(siklo-oksijenaz)maruz bırakılmadan önce transkripsiyon inhibitörü aktinomisin D ile önceden inkübe edilen HK-2 hücrelerinde değerlendirildi.hipoksi5 saat için. Şekil 3d'de gösterildiği gibi,hipoksiCOX'de tetiklenen artış-2(siklo-oksijenaz)protein ekspresyonu aktinomisin D tarafından engellendi. Ayrıca,hipoksiayrıca bir COX-2 etkinliğinde bir artış belirledi(siklo-oksijenaz)daha önce HK-2 hücrelerinde transfekte edilmiş promotör yapısı (sağdaki Şekil 3d). Birlikte ele alındığında, Şekil 3d'de gösterilen sonuçlar, transkripsiyonel mekanizmaların birhipoksiCOX'de tetiklenen artış-2(siklo-oksijenaz)protein ifadesi. Yine de, COX-2 promotörünün aktivasyon zamanlaması ile maksimum COX-2 zamanlaması arasında bir tutarsızlık vardı.(siklo-oksijenaz)mRNA ifadesi: COX'teki geçici artış-2(siklo-oksijenaz)mRNA ekspresyonu 2 saat sonra maksimumdu (Şekil 3b), COX-2 promotörü 3 saat sonra aktive edildi (Şekil 3d), bu muhtemelen COX artışına post-transkripsiyonel mekanizmaların katkısını yansıtır{{6 }}(siklo-oksijenaz)ifade4. Buna göre, COX-2(siklo-oksijenaz)mRNA stabilize edilirhipoksi, bu da artan COX seviyelerine neden olur-2(siklo-oksijenaz)COX'in artan aktivitesinin (o anda) herhangi bir katkısı olmaksızın mRNA ifadesi-2(siklo-oksijenaz)destekçi. Bununla birlikte, promotörün aktivasyonu ile ölçülebilir substratın birikmesi arasındaki bir zaman gecikmesinin, COX-2 promotörünün aktivasyon zamanlaması ile maksimum COX{{1 zamanlaması arasındaki tutarsızlığa da katkıda bulunması da mümkündür. }}(siklo-oksijenaz)mRNA ifadesi.

HIF-1, oksijene bağlı alt birimden ve yapısal olarak ifade edilen alt birimden oluşan heterodimerik bir transkripsiyon faktörüdür. Altındahipoksi, HIF-l birikir ve çekirdeğe girer, burada HIF-1 ile dimerize edildikten sonra HIF-1 transkripsiyon faktörünü üretir. HIF-1 daha sonra hedef genlerinin ekspresyonunu,hipoksi- Duyarlı unsurlar (HRE'ler) kendi düzenleyici bölgelerinde bulunur ve daha sonra savaşmak için hücresel uyarlanabilir tepkileri düzenlerhipoksi 3. VerilenhipoksiCOX'i etkinleştirebilir-2(siklo-oksijenaz)COX-2 promotör sekansında2 bulunan fonksiyonel bir HRE yoluyla HIF-1-bağımlı bir şekilde ekspresyonun 2, HIF-1'in rolünü birhipoksiCOX'de tetiklenen artış-2(siklo-oksijenaz)ifade. HK-2 hücrelerinde transfekte edilmiş bir COX-2 promotör yapısının aktivitesine de baktık. Şekil 3e'de gösterildiği gibi, körelmiş HIF-1bir YC-1 inhibitörü ile ön inkübasyonhipoksiHIF-la ifadesinde ve bir HRE raportör yapısının aktivitesinde indüklenen artış, her iki COX ifadesindeki artışın önlenmesiyle sonuçlandı-2(siklo-oksijenaz)ve COX-2 etkinliği(siklo-oksijenaz)HK-2'deki promotör yapısı,hipoksi. Özet olarak, Şekil 3a-e'de gösterilen sonuçlar, HIF-1 -COX'un transkripsiyonel yukarı regülasyonu-2 fikrini desteklemektedir.(siklo-oksijenaz)için sorumludurhipoksiiPGE2'de indüklenen artış.

HIF-1a'nın etkinleştirilmesinin sonuçlarıhipoksiindüklenen apoptoz tartışmalıdır (muhtemelen bağlama bağlı olabileceğinden), deneysel sistemimizde HIF-1a'nın rolünü (önceden) analiz ettik. Bu müdahaleyi daha önce COX-2'da bulduğumuz için(siklo-oksijenaz)/iPGE, EP reseptör yolu tarafından tetiklenen HIF-la ekspresyonundaki artışı inhibe eder.hipoksi8,56 HIF-la'nın inhibisyonunun önlenmesiyle sonuçlanıp sonuçlanmadığını sorduk.hipoksiindüklenen HK-2 hücre apoptozu. Şekil 3f'de gösterildiği gibi, bir HIF-1 inhibitörü olan YC-1 ile ön inkübasyon aslında arttıhipoksi-indüklenen apoptoz. Bu nedenle, HlF-la'nın

Tartışma

Dokuhipoksihem kronik böbrek hastalığının hem de akut böbrek hasarının patofizyolojisinde kritik öneme sahip olduğu düşünülür ve böbrek tübüllerinin en duyarlı kısmı PTC'dir.hipoksi. Burada, PGE'nin verdiği zarardaki rolünü inceledik.hipoksiinsan PTC'sine ve artan iPGE üretiminin, COX'in HIF-la'ya bağlı yukarı regülasyonundan kaynaklandığını buldu-2(siklo-oksijenaz)gen ifadesi ve mPGES-1 ifadesinin artması,hipoksiHK-2 hücrelerinde indüklenen apoptotik hücre ölümü. Tübüler hipoksinin hem akut hem de kronik böbrek hastalığı-2 için ilgili bir faktör olduğu göz önüne alındığında, bu sonuçlar böbrek hastalıklarında yeni bir terapötik hedef olarak prostaglandin taşıyıcı PGT'ye işaret etmektedir.

hipoksisadece iPGE'yi arttırmakla kalmaz, aynı zamanda hücre dışı ortama8 salınımını da arttırır, böylece salgılanan (hücre dışı) PGE de rol oynayabilir.hipoksiindüklenen apoptoz (örneğin, hücre zarında bulunan EP reseptörlerinin kanonik aktivasyonu yoluyla apoptotik basamakların tetiklenmesi). Önceki iki çalışma, hücre ölümünün altında olduğunu göstermiştir.hipoksiayrıca COX-2'dan kaynaklanıyordu(siklo-oksijenaz)-bağımlı PGE üretimi,1345. Öte yandan, belirli hücre tiplerinde (fibroblastlar, mikroglia, nöronlar ve akut lenfoblastik lösemi hücre hatları), PGE.'nin neden olduğu apoptoza, EP-reseptörlerinin PGE'ye bağlı aktivasyonu aracılık eder46-48. burada bulduk kihipoksi-indüklenmiş HK-2 hücre apoptozu, EP reseptörlerinin antagonizmi ile de önlendi (Şekil 2a, üst panel, sağ). Ancak EP reseptörleri klasik olarak plazma membran reseptörleri olarak tanımlandığından—böylece iPGE için erişilemezler2-hipoksik HK-2 hücrelerinde iPGE'nin apoptotik etkisine aracılık eden EP reseptörlerinin bir hücre içi yerleşimli alt küme (yani iEP reseptörleri).

iPGE2'nin rolünün aksinehipoksiHK-2 hücrelerinde indüklenmiş apoptoz, sadece hücre dışı PGE'nin aracılık ettiğini buldukhipoksi/reoksijenasyon kaynaklı HK-2 hücre ölümü, çünkü PGT inhibitörleri tarafından engellenmemiştir(Şekil 2f). Her ne kadar hücresel hasarın patolojik mekanizmaları daha sonrahipoksi/reoksijenasyon tam olarak anlaşılmadığından, hücre ölümünün büyük ölçüde aşırı reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi yoluyla gerçekleştiği kabul edilmektedir. Bu özellikle HK-2 hücreleri49,50 için geçerlidir. Ancak her ne kadarhipoksiROS üretimini de artırabilir, bildiğimiz kadarıyla ROS'un ilgili bir rol oynadığına dair bir kanıt yoktur.hipoksi-indüklenmiş HK-2 hücrelerinin ölümü. Bu, HK-2 hücrelerinde hipoksi ve hipoksi/reoksijenasyonun ölümcül etkilerine farklı mekanizmalar tarafından aracılık edildiğini düşündürür, bu da BG ve BS'nin neden BS'ye karşı koruyucu olduğunu açıklayabilir.hipoksiama karşı değilhipoksi/reoksijenasyon. Sonuç olarak, PGT'nin inhibisyonu, PTC'de hipoksi ile indüklenen hücre hasarına karşı terapötik faydalar sağlayabilir, ancak PGT'nin zararlı etkisine karşı değil.hipoksi/reoksijenasyon.

COX'in HIF-1 -bağımlı yukarı regülasyonu-2(siklo-oksijenaz)için kritik bir olaydı.hipoksiindüklenmiş HK-2 hücre apoptozu (Şekil 3e). Bununla birlikte, HIF inhibitörü YC-1'nin apoptotik hücre ölümünü (Şekil 3f) arttırdığına dair gözlemimiz şaşırtıcıdır, ancak önceki raporlar zaten benzer sonuçlar göstermiştir1. Olası bir açıklama, HIF-la'nın yalnızca COX'in proapoptotik yukarı regülasyonuna aracılık etmediği bir varsayımsal senaryodur-2(siklo-oksijenaz)ama aynı zamanda koruyucu moleküllerin yukarı regülasyonu. Gerçekten de, HIF-1-koruyucu moleküllerin ekspresyonunuhipoksiörneğin uzun kodlamayan RNA DARS-AS1've microRNA-2103 gibi, özellikle HK-2 hücrelerinde bulunmuştur. Bununla birlikte, bu kanıtlar varsayımsal senaryomuzu desteklese de, bunu doğrulamak için özel deneyler yapılmalıdır.

Böbrek hücrelerinin tepkisinin araştırılmasıhipoksiböbrek patolojisi anlayışımızı geliştirebilir. Pro-apoptotik protein Bax'in anti-apoptotik protein Bcl-2 ekspresyon oranındaki artışın rolünü, her ne kadar ön bir şekilde olsa da, inceledik.hipoksiHK-2 hücrelerinde indüklenen apoptoz. Sonuçlarımız, PGL'nin inhibisyonunun, Bcl-2 ve Bax(Fig.2e) ekspresyonu arasındaki dengede anti-apoptotik bir kayma ile uyumlu değişikliklerle sonuçlanmadığını gösterdi; bu, bu proteinlerin vücuttaki rolünü desteklemez. altında iPGE'ye bağlı HK-2 hücre ölümühipoksi. Bildiğimiz kadarıyla, PTC'de hipoksi ile indüklenen apoptozda Bcl{{0}}/Bax ekseninin etkisi hakkında sadece iki çalışma var ve her ikisi de anoksik" veya neredeyse anoksik O, konsantrasyonları5 içeriyor. PTC yüzde 0,2 O'ye maruz bırakıldığında, Bax ifadesi değişmeden kaldı ve apoptoz, azalmış Bcl-2 ifade derecesine bağlandı.Ancak, Bcl-2 ifadesi, yüzde 1 O'dan etkilenmedi, buna rağmen Sonuçlarımızla örtüşen apoptozun varlığı Bu nedenle, Bcl-2 veya Bax ekspresyonunda kantitatif değişiklikleri içermesi gerekmeyen diğer mekanizmalar dikkate alınmalıdır: örneğin, kültürlenmiş glioma hücrelerinde apoptozun iPGE2 tarafından uyarılması yalnızca gerektirir Bax'ın mitokondriye translokasyonunu tetikleyen Bax ile fiziksel ilişkisi202. Bu nedenle, iPGE'nin HK-2 hücre apoptozuna katkıda bulunduğu mekanizma daha fazla çalışmayı hak ediyor.

Grubumuz bir COX-2(siklo-oksijenaz)iPGE'deki bağımlı artış, sisplatin'e maruz kalan HK-2 hücrelerinde apoptotik ölüme aracılık eder, apoptotik cisimler7" vehipoksi(şimdiki sonuçlarımız). PGE, sentezlendikten sonra hızla hücre dışına salındığından2, PGl tarafından içeriye taşınması, HK-2 hücrelerinde iPGE ile indüklenen apoptozda kritik bir rol oynar. Bu nedenle, bu PTC hasarına iPGE aracılık ettiğinde, PGT inhibitörleriyle tedavi, sisplatin kaynaklı PTC hasarının önlenmesi, apoptotik cisimler yoluyla tübüler hasarın yayılmasının inhibisyonu veya sınırlandırılması gibi potansiyel uygulamalarla faydalı bir terapötik yaklaşım olabilir. zararlı etkisihipoksiPTC'de.