Çin Bitki Tıbbı Cistanche'nin Erken Embriyo-Fetal Gelişim Üzerindeki Etkisi
Mar 08, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
Li Yufang 1, Xu Qinwei 2, Zhang Li 2, Zhang Wenchang 2, Feng Shutang 3*
[Soyut]domuz kullanembriyolarAraştırma ve karşılaştırma için in vitro fertilizasyondan. ekleme etkisiÇinceilaçiçindekilercistancheve Astragalus'un gelişimineerken embriyolarOrta NCSU'da{{0}} kanıtlandı. Deney şunu kanıtladı: (1) Yüzde 0,10'luk hacim oranıcistancheve kültür suyuna yüzde 0.10 Astragalus eklendi vecistancheekleme grubu Blastosist oranı (yüzde 15,76), boş gruptan (yüzde 9,26) önemli ölçüde yüksekti (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0.05), belirtencistancheçöl çiçeğiönemli ölçüde teşvik edebilirerken embriyonikgelişim. (2) konsantrasyonu (V/V) olduğundacistanche{{0}}.0Yüzde 5 ve yüzde 0,10, blastosist oranı (yüzde 17,02 ve yüzde 16,75) boş gruptan (0) (P) önemli ölçüde yüksektir<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">Çinceilaçcistanche2-hücre aşamasında kültür ortamında, blastosist gelişme oranı (yüzde 13,81), 4-hücre aşamasındakinden (yüzde 7,53) önemli ölçüde yüksekti (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">cistanchebefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).
İn vivo ve in vitro gelişim ortamındaki farklılıklar nedeniyle,embriyolarerken domuzun in vitro kültürü sırasında serbest radikaller tarafından zarar görecektir.embriyolarhücre metabolizması bozukluklarına veya DNA, RNA ve proteinlerde hasara neden olur [1]. Dondurulmuş sperma ile in vitro fertilizasyonun gelişme hızını daha da artırmak için, bu deney belirli bir konsantrasyondacistancheve Astragalus geliştirmek içinembriyoin vitro geliştirme ortamı.
1. Malzeme ve yöntemler
1. 1 Kültür koşulları:
Domuz oositlerinin in vitro olgunlaşması, in vitro fertilizasyon ve erken embriyoların in vitro kültürü, tümü yüzde 5 CO2 ve maksimum 39 derece doymuş nem içeren bir inkübatörde gerçekleştirildi.
1.2 Reaktifler ve kültür ortamı:
Oosit olgunlaşma bazal sıvısı NCSU{{0}}, oosit yıkama sıvısı PVA-TL-HEPES sıvısı, dölleme sıvısı yüzde 0.1 BSA içeren Tris tamponu (mTBM) ve sperm yıkama sıvısı yüzde 0,1 BSA'lı Dubecco'dur. Fosfat tamponlu salin (DPBS), sperm eritme sıvısı BTS, kümülüs sıvısı 1 mg/mL hiyalüronidaz PBS, oosit operasyon sıvısı HEPES tamponlu NCSU-23 ve erken embriyo temel kültür sıvısı 0 ile destekleniyor Yüzde 0,4 BSA NCSU-23, (V/V) 00,05 oranında ~yüzde 0,15 Cistanche ekleyin, meni eritmek için BTS kullanın. Kullanmadan önce, yüzde 5 CO2 hava ve maksimum 39 derece doymuş nem içeren bir inkübatörde 4 saatten fazla ön ısıtma yapın ve dengeleyin [2].
1.3 Çin tıbbı Cistanche'nin kaynatma yöntemi:
Cistanche solüsyonu: 5 g alın ve 100 ml'lik bir behere koyun, ultra saf su ekleyin ve ultra saf suya daldırın, yüksek ateşte kaynatın ve 20 dakika kaynatın, sonra toplayın çorba; yukarıdaki işlemi tekrarlayın, arka arkaya 3 kez toplayın, 100 mL'ye sabit hacim, 0,22 μm filtre yedeği. Astragalus solüsyonu: 5 g alın ve 100 ml'lik bir behere koyun, ultra saf su ekleyin ve daldırın, yüksek ateşte kaynatın ve 20 dakika kaynatın, ardından şifalı çorbayı toplayın; yukarıdaki işlemi tekrarlayın, arka arkaya 3 kez toplayın, hacmi 100 mL'ye ayarlayın, 0,22 μm yedek filtreleyin.
Çin tıbbıBitkisel:cistanche
1.4 Domuz oositlerinin in vitro olgunlaşması:
Domuzların yumurtalıkları, Pekin Pengcheng Gıda Mezbahasından toplandı, yaklaşık 38 derecede antibiyotik içeren yüzde 0.9 normal tuzlu suya yerleştirildi, 4 saat içinde laboratuvara geri taşındı ve üç kez normal tuzlu su ile yıkandı. Yumurtalık yüzeyinde 2-6 mm çapında folikülleri olan oositleri çıkarmak için 12-ölçer iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanın. TL-HEPES solüsyonunda 3~4 kez ve 4 saatten fazla bir karbon dioksit inkübatöründe dengelenmiş NCSU-23'da 3~4 kez yıkayın. 20~30 oositi grup olarak 100 μL'ye aktarın, yaklaşık 22 saat boyunca yüzde 10 PFF, 10 IU/mL HCG, 10 IU/mL PMSG, 10 ng/mL EGF NCSU-23 damlacıkları ve kültürü ekleyin, yüzde 10 PFF, 10 ng/mL EGF ile orta ila NCSU-23 damlacıkları ve 44~46 saat boyunca kültüre devam edin[3].
1.5 Sperm kapasitesi ve tüp bebek tedavisi:
Kafein ve BSA içermeyen mTBM solüsyonunu hazırlayın ve pH değerini 7,2~7,8 aralığında ayarlayarak, yüzde 5 CO2 ve maksimum doymuş nemi 39 derece olan bir inkübatörde 48 saat dengeleyin; kullanmadan 44 saat önce kafein ve BSA ekleyin ve dengelemeye devam edin. Semen kalite açısından test edildi ve 10 mL 900 r/dk'da 3 dakika santrifüjlendi, süspansiyon için yüzde 0.1 BSA içeren 10 mL DPBS solüsyonu eklendi ve 900'de santrifüjlendi. 3 dakika için dev/dak [3]; 1 mL TBM solüsyonu süspanse edildikten sonra 60 derece eğildi Yukarı akış enerji toplama işlemi 1 saat boyunca yüzde 5 CO2 havası ve maksimum 39 derece doymuş nem içeren bir inkübatörde gerçekleştirilir[3~5]. 44~46'ya olgunlaşan oosit-kümülüs hücre kompleksi, yüzde 0.1 hiyalüronidaz içeren oosit yıkama solüsyonuna yerleştirilir ve kümülüs hücreleri pipetleme ile çıkarılır ve ardından oositler açığa çıkarılır. Dengeli TBM'de 3 kez yıkayın ve son olarak her 10-15 parçayı 50 μL TBM'lik bir gruba koyun ve spermi bekleyin [6, 7]. Kapasitasyondan 50 μL yukarı akış menisini TBM içeren oositlerin bir damlacığına enjekte edin ve yüzde 5 CO2 ve maksimum doymuş nemi 39 derece olan bir kuluçka makinesinde 6 saat boyunca dölleme gerçekleştirin.
1.6 Döllenmiş yumurtaların erken gelişimi ve tespiti:
6 saatlik döllenmeden sonra, oositler, embriyo kültürü sıvısında yüzde 0.4 BSA içeren HEPES veya NCSU- 23 ile tamponlanmış NCSU-23 ile tedavi edildi. 23 3 kez durulayın, ortamı dengeli bir 0,4 yüzde BSA NCSU-23 damlacık olarak değiştirin ve 8 günden fazla inkübe edin. Varsayımsal döllenmiş yumurtaların bölünme oranını 2. günde, morula oranını (artı blastokist oranını) 6. günde ve blastosist oranını 8. günde kontrol edin [8]. Hepsi vücut aynası altında incelendi ve kaydedildi.
1.7 Deneysel tasarım:
1.7.1 Geleneksel Çin tıbbı bileşenleri Cistanche'nin erken embriyo gelişimi üzerindeki etkisi.
Wuzhishan domuz[8] Kapasitasyondan, in vitro fertilizasyondan sonra, döllenme tamamlanır ve bölünme gerçekleştikten sonra, embriyolar, yüzde 0.1'e (V/V) eklenene kadar değiştirilir. Cistanche, 0%0,1 astragalus ve NCSU-23 (0%4,4 BSA), hiçbir önemli bileşen (boş grup) ile döllenmiş yumurtaların ve erken embriyoların gelişimini gözlemlemek için yetiştirildi. ve iki geleneksel Çin tıbbı bileşeninin erken in vitro embriyo gelişimi Etkisi üzerindeki etkilerini değerlendirin.
1.7.2 Cistanche konsantrasyonunun embriyoların erken gelişimi üzerindeki etkisi.
Wuzhishan domuz sperması kapasiteye sahiptir ve in vitro fertilizasyona tabi tutulur. Döllenme tamamlandıktan sonra sıvı yüzde {{0}} (boş grup), 0 olarak değiştirilir.0Yüzde 5, 0,1 ve sırasıyla yüzde 0.1. Yüzde 15 Cistanche NCSU-23'da (yüzde 0,4 BSA), döllenmiş yumurtaların gelişimini gözlemleyin ve Çin tıbbı bileşeni Cistanche'nin farklı konsantrasyonlarının erken in vitro embriyo gelişimi üzerindeki etkisini değerlendirin.
1.7.3 Cistanche ekleme süresinin erken embriyo gelişimine etkisi.
Wuzhishan domuz sperması kapasitördür ve in vitro fertilizasyona uğrar. Döllenmenin sona ermesinden sonra, döllenmiş yumurta {{0}}hücre aşamasına bölünür ve döllenmiş yumurta 4-hücre aşamasına bölünür, sıvı değiştirilir ve ayrı olarak eklenir. 0%0,1 Cistanche NCSU-23 (yüzde 0,4 BSA), döllenmiş yumurtaların gelişimini gözlemleyin ve cistanche eklemenin farklı aşamalarda erken in vitro embriyo gelişimi üzerindeki etkisini değerlendirin.
1.8 İstatistiksel analiz:
SPSS13.0 ki-kare (χ2) testi ve tek yönlü varyans analizini kullanın.
2. Analizde sonuç
2. 1 Geleneksel Çin tıbbı bileşenlerinin erken embriyonik gelişim üzerindeki etkisi
As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>0.05). İki grubun blastosist oranı boş gruba göre daha yüksekti ve Cistanche grubunun blastokist oranı boş gruptan farklıydı. Önemli (P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">
2.2 Çin tıbbı bileşeni Cistanche konsantrasyonunun erken embriyonik gelişim üzerindeki etkisi
Tablo 2'de gösterildiği gibi, 0 hacim konsantrasyonunda Cistanche eklenmesi.0Embriyo kültür sıvısında yüzde 5 ila yüzde 0,10 WZSP dondurulmuş sperm sıvısı in vitro fertilizasyon embriyoları üzerinde daha iyi bir teşvik edici etkiye sahiptir. , ve blastosistlerin gelişme hızı boş grubunkinden önemli ölçüde farklıdır (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">
2.3 Çin tıbbı bileşeni Cistanche'nin bir dönem eklenmesinin erken embriyonik gelişim üzerindeki etkisi
As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>0.05). Bununla birlikte, 4 hücrenin eklenmesiyle karşılaştırıldığında önemli bir fark vardı (P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">
3. Tartışma
Normal gelişen ile karşılaştırıldığındaembriyolarin vivo, döllenmiş IVF'nin gelişim ortamıembriyolarönemli ölçüde farklıdır. sürecindeembriyobüyüme ve bölünme, büyük miktarda No., serbest radikaller ve embriyo büyümesi için elverişsiz olan bazı toksik maddeler üretilir. Vücutta normal gelişen embriyolar, iç ortam metabolizması yoluyla bu olumsuz faktörleri ortadan kaldırabilir; bu olumsuz faktörler, tüp bebek uygulamasının embriyo büyüme ortamında her zaman birikecektir. GelenekselÇinceilaçbileşencistanchedonmuş sperma ile tüp bebek gelişimi oranını daha da artırmak için konsantrasyonu azaltma ve belirli serbest radikalleri ortadan kaldırma işlevine sahip olabilir. Deney, belirli bir konsantrasyon ekleyerek araştırdıcistancheve Astragalus. Sonuçlar, Astragalus'un in vitro kültür ortamının iyileştirilmesi üzerinde etkili bir etkisinin olmadığını doğruladı. Uygun bir konsantrasyoncistancheüzerinde belirli bir teşvik edici etkiye sahiptir.erken embriyogelişme, ancak konsantrasyoncistanchebelirli bir konsantrasyonu aşarsa, aynı zamanda üzerinde engelleyici bir etkiye sahiptir.embriyogelişim.
farklı etkilerini daha da araştırdık.cistanche, gelenekselÇinceilaçbileşen, çeşitli aşamalarda ve deney bulunduerken embriyolarsonraki aşamada daha yüksek bir gelişme oranına sahipcistanche2-hücre aşamasında eklenir. Muhtemel sebep, alıcının dış ortamından kaynaklanmaktadır. Nitrik oksit (NO), çok çeşitli biyolojik aktivitelere sahip bir sinyal molekülü ve sitotoksik faktördür. NO'nun etkisierken embriyogelişme geriye doğru izlenmelidir.erken embriyonikmemeli embriyo kültüründe 2-hücre bloğunun (2-hücre bloğu) nedenlerinden birinin neden olabileceği gelişme aşaması ve domuzların in vitro bloğu 4-hücre aşamasında [ 9]. geleneksel eklenmesiÇinceilaçbileşenler, NO'nun serbest radikalini bir dereceye kadar ortadan kaldırabilir ve olumsuz faktörleri hafifletebilir.embriyobüyüme [10].
cistanche
Referanslar
[1] Comport M. Üç serbest radikal kaynaklı hücre infury modeli[J]. Chem Biol Interact, 1989, 72( 1/2) :1- 56.
[2] Pan Dengke. Klonlanmış domuz somatik hücre gelişimini etkileyen faktörlerin araştırılmasıembriyolar[D]. Pekin: Çin Tarım Üniversitesi, 2005.
[3] Zhang Yunhai. Klonlanmış domuz üretimi üzerine araştırmaembriyolarsomatik hücre nükleer transfer teknolojisini [D] kullanarak. Pekin: Çin Tarım Üniversitesi, 2005.
[4] Lu Shengsheng, Zhang Yanling, Shi Deshun, et al. Olgunlaşma sırasında sığır serumu ve domuz foliküler sıvısının eklenmesinin domuz oositlerinin nükleer olgunlaşması üzerindeki etkileri veerken embriyonikin vitro fertilizasyondan sonra gelişme [J]. Heilongjiang Hayvancılık ve Veterinerlik Tıbbı, 2002, (8):1- 3.
