Soyut:KullanmaCistanche DeserticolaTest materyalleri olarak iki konakçı bitkinin (haloksilon ammodendron ve atriplex canescens) parazitlenmesi, bu çalışma, fenol-sülfürik asit yöntemini kullanarak farklı konakçılardan C. deserticola'daki polisakkarit içeriğini belirledi. Haloksilon-cistanche veAtriplex-cistanche dernekleriIllumina novaseq 6000 sekanslama platformu kullanılarak gerçekleştirildi. Araştırma, farklı konakçılardan C. deserticola'daki transkriptom farklılıklarını araştırmaya, polisakkarit metabolizmasında yer alan anahtar enzimatik genlerin taranmasına ve qRT-PCR doğrulaması yoluyla seçilen genlerin doğrulanmasına odaklandı. Bu çalışma, yeni konakçı bitkilerinin keşfedilmesi ve C. deserticola'nın genetik iyileştirilmesi için teorik bir temel sağlamayı amaçlamaktadır. Sonuç, atriplex quadriptera-c.deserticola'da bulunan polisakkarit içeriğinin haloksilon ammodendron-c'de mevcut olandan daha üstün olduğunu göstermiştir. Deserticola. Transkriptomun karşılaştırmalı analizi yoluyla, 14089 farklı şekilde eksprese edilen genler (DEG'ler) atriplex quadriptera-C'nin etli saplarından tarandı. Deserticola ve haloksilon Ammodendron-C. Deserticola. KEGG zenginleştirme analizinin sonuçları, bu DEG'lerin karbonhidrat metabolizması, galaktoz metabolizması, amino asit metabolizması ve yağ asidi metabolizması ile ilgili yollarda en belirgin şekilde zenginleştirildiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, polisakkarit metabolizması ile ilişkili dört yoldan toplam 26 derece elde edildi, bunlar arasında haloksilon ammodendron -C'de fruktosidaz geni ve -galaktosidaz genin ekspresyon seviyeleri. Deserticola, Atriplex Quadriptera-C'den önemli ölçüde daha yüksekti. Deserticola. Atriplex Quadriptera-C'de UDP-glikoz dehidrojenaz geni ve mannoz -1- fosfat guanilat transferaz genin ekspresyon seviyeleri. Deserticola, haloksilon ammodendron-C'den önemli ölçüde daha yüksekti. C. deserticola'da polisakkarit metabolizması farkını düzenlemek için anahtar enzim genleri olabilen Deserticola.

Anahtar Kelimeler Cistanche Deserticola; transkriptom dizisi; ana bilgisayarlar; Polisakkarit metabolizmasının farkı

Cistanche Deserticola

 

Cistanche Deserticola YC MA, öncelikle dağıtıldıGansu, Sincan, Ningxia ve İç Moğolistan, yakın zamanda bulunan geleneksel bir Çin tıbbi bitkisidir."Tıbbi ve Gıda Homolog"katalog. Çeşitli sağlık yararları vardır, örneğinBöbrek Yang'ı tonlamak, özü besleyen öz ve kan ve bağırsak hareketlerini teşvik etmek, yaygın olarak uygulanmasını sağlamakTıp, sağlık ve gıda endüstrisi[1]. Çünküheterotrofik doğa, Cistanche Deserticolafarklı konakçı bitkileri parazitleştirir,Haloksilon ammodendronve yeni tanıtılanyarı yırtıcı çalıAtriplex cancescens(Pursh) Nutt.Birincil ev sahipleri.

Polisakkaritler, değerlendirmede anahtar aktif maddelerdirCistanche Deserticolakalite. Farklı ana bilgisayar koşulları altında,Birikim ve metabolik kompozisyonile ilgiliTirbahiPolisakkaritler önemli ölçüde değişir [2]. Tıbbi araştırmalar bunu gösterdiTirbahiPolisakkaritlerAntioksidan, nöroprotektif, bağışıklık düzenleme ve hafızayı artıranetkin bir şekilde hafifleten farmakolojik etkilerAlzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve karaciğer depresyonuna bağlı dalak eksikliği[3]. Modern ilerlemelerleEkstraksiyon teknikleri ve çok spektrumlu analiz teknolojileri,İçerik, kompozisyon ve yapısal özelliklerile ilgiliTirbahiPolisakkaritler yavaş yavaş açıklanıyor ve uygulamalarını genişletiyor.

Açısındanmoleküler biyoloji araştırmasıAçıkTirbahitürler, transkriptom dizileme çalışmaları esas olarak odaklanmıştırCistanche tubulosaVeHaloksilonTirbahikarmaşık sistemler.Örneğin,Hou ve ark.[4] gerçekleştirildiTam uzunlukta transkriptom dizileme ve gen ekspresyonu profili oluşturmaile ilgiliCistanche tubulosakullanmaPacbio ve BGISEQ -500 RNA-seq Technologies, tanımlama237.772 benzersiz transkriptve yer alan anahtar enzim genlerinin taranmasıFeniletanoid glikozit biyosentezi. Benzer şekilde,Feng ve ark.[5] yürütülmüşTranskriptomik ve metabolomik analizlerHaustoria ve bitişik dokularınHaloksilon kökleri veTirbahietli saplar, konağın birikiminde rolünü açıklamakTirbahiMetabolitler. Çalışmaları olduğunu vurguladıAna bilgisayar tesisi sadece verimini etkilemekle kalmaz.Tirbahiaynı zamanda kalitesi. Ancak, araştırmaTirbahiFarklı konakçı bitkilerin parazitlenmesi sınırlı kalır.

Atriplex cancescens, a köklü ve son derece strese dayanıklı bitki, gelenekselden farklıHaloksilon Konakçıve kökenliOrta Amerika Birleşik Devletleri'nin yarı kurak platoları. Son yıllarda tanıtıldı ve biriçin yeni ev sahibiCistanche DeserticolayetiştirmeiçindeKuzeybatı Çin. Bir Qing ve ark.[6] analiz etti ve karşılaştırıldıpolisakkarit birikimiTirbahihaloksilon ve atriplex cancarcens parazitasyonuAynı üretim alanında, bulmaPolisakkarit içeriğinde önemli farklılıklariki ana bilgisayar koşulu arasında.

Böylece, bu çalışmaetli saplarını sıralamakCistanche Deserticolahaloksilon ve atriplex cancarcens parazitasyonu, analiz etmekPolisakkarit biyosentezinde yer alan anahtar enzim genlerinin diferansiyel ekspresyonu. Bulgular birDaha fazla araştırma için teorik temelTirbahiPolisakkarit biyosentez mekanizmaları, atripleks ile ilgili transkriptomik çalışmalarTirbahiSistemler ve yüksek kalitede yeniliği teşvik edinTirbahiGermplazm kaynakları.

 

Materyaller ve Yöntemler

1.1 Deneysel Malzemeler

Cistanche DeserticolaParazitleştirici örneklerHaloksilon ammodendronVeAtriplex cancescenstoplanmışTirbahiyetiştirme tabanıXiquan Town, Jingtai İlçesi, Gansu Eyaleti(enlem36 derece 5 'n, boylam103 derece 42 'e). İkisi birdenHaloksilonVeAtriplex cancescensaynı ortamda yetiştirildi. Numuneler olarak kategorize edildiHaloksilonTirbahi(Örnek A)VeAtripleks-Tirbahi(Örnek h),her kategori için üç kopya ile (kopya başına beş bitki). Örnekleme yapıldıNisan 2024ve numuneler olarak tanımlandıCistanche Deserticolaetli ampullerProfesör Guo YehongondanTarım Koleji, Gansu Tarım Üniversitesi.

Takip edenŞangay OE Biotech Co., Ltd.,TirbahiEtli gövdeler ultra saf su ile durulandı ve filtre kağıdı kullanılarak fazla nem çıkarıldı. İnce dilimler alındıüst, orta ve altHer kökten iyice karıştırılır ve kriyojenik şişelere yerleştirilir. ÖrneklerSıvı azot içinde hızla donmuşiçin2 saatBir aktarılmadan önce-80 derece dondurucudepolama için [7].

1.2 Deneysel Yöntemler

1.2.1 Standart eğrinin oluşturulması ve polisakkarit içeriğinin belirlenmesi

A 10 mgörnekD-glikoz standardıdoğru bir şekilde tartıldı ve çözüldü100 mL hacimsel şişehazırlamak için damıtılmış su ile100 ug · ml⁻⁻ stok çözümü. Kalibrasyon çözümleri{0}}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 7, 0. 8 ve 0.9 ml.stok çözümünün10 mL Stoppered Test Tüplerisu ile seyreltilmiş1. 0 mlve sonra karışık1. 0 ml% 6 fenol çözeltisiVe5 mL konsantre sülfürik asit. Vortekslemeden sonra, çözeltiler kaynar bir su banyosunda ısıtıldı20 dakikadaha sonra bir buz suyu banyosunda soğutuldu10 dakika. A boş kontrolkullanılarak hazırlandı1. 0 ml damıtılmış suglikoz çözeltisi yerine. Absorbans şu adreste ölçüldü482 nmbirUV-Vis spektrofotometreve birstandart eğriile üretildiyatay eksen olarak konsantrasyon (x)Vedikey eksen olarak absorbans (y).

Değiştirilmiş bir yaklaşımı takip etmekLi Jie ve ark. [8], 0. 2 g kurutulmuşTirbahitozdoğru bir şekilde tartıldı ve bir20 ml Stoppered Test Tüpü. 10 ml% 80 etanoleklendi ve karışım tabi tutuldu30 dakika boyunca 80 derece (100 W, 40 kHz) ultrasonik ekstraksiyon. Ekstrakt sıcakken süzüldü ve prosedür bir kez tekrarlandı. Kalıntıyı kurutduktan sonra,10 ml damıtılmış suilave edildi ve ultrasonik ekstraksiyon iki kez tekrarlandı. Filtratlar birleştirildi ve seyreltildi20 mldamıtılmış su ile.1. 0 ml Bu çözümündaha fazla seyreltildi10 mldamıtılmış su ile.

A 1. 0 ml alikothazırlıklıTirbahiÖrnek çözeltisi, glikoz standardı ile aynı prosedür kullanılarak analiz edildi. Absorbans482 nmölçüldü ve polisakkarit içeriğiTirbahiFarklı konakçı bitkilerden hesaplandı.

1.2.2 RNA ekstraksiyonu, cDNA kütüphanesi yapısı ve sekanslama

Toplam RNA çıkarıldıCistanche DeserticolaParazitleştirici örneklerHaloksilon ammodendronVeAtriplex cancescenskullanmaTiangen DP441 RNA Kiti (Çin), takip edenTrizol Reaktif Protokolü. RNA saflığı birNanodrop 2000 Spektrofotometre (Thermo Scientific, ABD), RNA konsantrasyonu ve bütünlüğü birAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, ABD).

Transkriptom kütüphaneleri,VAHTS Universal V6 RNA-seq Kütüphane Hazırlık Kiti. Kalite kontrolünden sonraAgilent 2100 Bioanalyzer, kütüphanelerIllumina novaseq 6000 platformu, üretme150 bp eşleştirilmiş okuma.

1.3 Veri Analizi

1.3.1 Transkriptom düzeneği ve fonksiyonel ek açıklama

Ham okurFastq formatıkullanılarak işlendiTrimmomatikKaldırmak içinPloy-N okumaları ve düşük kaliteli okumalarsonuçtaTemiz okumalar. Adaptör dizileri ve düşük kaliteli bölgeler kaldırıldı ve temiz okumalarbiber(ifade edilen dizi etiketleri)Trinity yazılımı. Her kümeden en uzun transkript birunigeneDaha fazla analiz için.

Unigenlerin fonksiyonel ek açıklaması, bunları karşılaştırılarak gerçekleştirildi.NCBI Yedek Olmayan (NR) Protein Veritabanı, İsviçre-Prot ve Genlerin Evrimsel Şecere: Denetimsiz Ortolog Gruplar (Eggnog) VeritabanıkullanmaElmas yazılımı (e-değeri <1e -5). Ökaryotik Ortolog Grupları (KOG) ek açıklamahomolog genleri tanımlamak için yapıldı. Ayrıca, unigenes eşleştirildiKyoto Genler ve Genomların Ansiklopedisi (KEGG) YollarıMetabolik yol ek açıklaması için.Gen ontolojisi (Go) sınıflandırması ve fonksiyonel ek açıklamaİsviçre-PROT veritabanından eşlemeler kullanılarak gerçekleştirildi.

1.3.2 Gene ekspresyon analizi ve farklı ifade edilen unigenlerin (DEG'ler) tanımlanması

Gen ekspresyon seviyeleri kullanılarak ölçüldüBowtie2Temiz okumaları unigenlere hizalamak için. İfade değerleri olarak hesaplandıMilyon haritalanan okumalar başına transkript kilobaz başına fragmanlar (fpkm)kullanmaExpress yazılımı. Diferansiyel ifade analizi kullanılarak yapıldıDESEQ2 yazılımı, ileNegatif binom dağılımı (NB) testleriÖnem testi için kullanılır. Farklı şekilde ifade edilen genler (DEG'ler)q-değeri <0. 05VeKat değişimi (FC)> 2.

1.3.3 Farklı ifade edilen genlerin QRT-PCR validasyonu

İçinde yer alan anahtar enzim genleripolisakkarit biyosenteziileÖnemli diferansiyel ifadeiçin seçildiNicel gerçek zamanlı PCR (QRT-PCR) doğrulama. RNA örnekleri kalite kontrol edildi ve ters transkripsiyondan önce OD değerleri ölçüldü. CDNA sentezi,QPCR kiti için hepsi birinci iplikçik cDNA sentezi SuperMix transscript. Sentezlenen cDNA seyreltildi10- katve QRT-PCR birfloresan qpcr sistemifarklı bisiklet koşulları altında.ACTB (beta-aktin) dahili referans geni olarak kullanıldıve nispi gen ekspresyon seviyeleri2⁻ΔCt Yöntemi.

 

Tablo 1 Astar dizileri

Gen kimliği	Gen adı	İleri astar (5 '-3')	Ters primer (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ I 1_2	Gmpp	GATAGTGGCTACAACATCCACTT	CCTCCTCTTCGTCGTAGGATTC
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ I 17_2	PFP	Tatatgggaccatggaaccaa	Gaccataggccgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ I 4_1	Ugdh	AAAGATCTTCCAGTTCGTAAGC	ACCAATTCGTTGATGCTACC
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ I 6_1	lacz	GTCTCCTTTTTATTCGTGAGGAT	GTCGATGGTGTGAAGCAGAT
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ I 1_1	saca	TTACGAGGATAGTGAGGTGCTA	Aatggaagatgaggggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ I 4_2	lacz	GGCACAGTCAAGGAGTACGATG	Cactggcatcgacgaggaaag
-	ACTB	Caatggatgatgatcgccggt	Cactggcatcgacgaggaaag

 

 

1.4 Veri Analizi

Hiyerarşik kümeleme analizifarklı şekilde ifade edilen genler (DEG'ler)kullanılarak yapıldıR (v3.2.0)Gruplar ve numuneler arasında gen ekspresyon paternlerini görselleştirmek. Go (Gen Ontolojisi) Zenginleştirme Analizi veKEGG (Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi) Yol zenginleştirme analizikullanılarak yürütüldüR,hipergeometrik dağılım. Önemli ölçüde zenginleştirilmiş fonksiyonel terimler kullanılarak gösterildiÇubuk çizelgeleri, kabarcık grafikleri ve zenginleştirme çemberi parselleri.

2 Sonuç ve Analiz

2.1 Polisakkarit içeriği belirleme sonuçları

Absorbans ölçümlerinden elde edilen doğrusal regresyon denklemi:

y {0}}. 0 154x - 0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. 0154x - 0}}. 1636 \ \ {{{{ (R^2=0. 9963) y =0. 0154x - 0.1636 (r 2=0. 9963)

doğrusal bir aralıkla20-90 ug · ml⁻⁻. Hassasiyet, tekrarlanabilirlik, stabilite ve örnek iyileşme oranı{0}}.%38, 0. 86%,%0.53 ve%99.67, sırasıyla.

Ölçülenpolisakkarit içeriğiiçindeCistanche DeserticolaFarklı konakçı bitkilerden örnekler:

HaloksilonTirbahi: 6.51%

Atripleks-Tirbahi: 11.83%

2.2 Transkriptom Dizileme ve Veri Birleştirme

Transkriptom dizilimiAltı Örnektoplam üretti41.77 g temiz veri. Örnek başına geçerli veriler arasında değişiyordu6.89 g ila 7.04 g, ileQ30 baz yüzdeleri% 95.38 ile% 95.91 arasındave birOrtalama GC içeriği% 45.13.

Toplam61.423 unigentoplam uzunluğunda monte edildi65.962.858 bpveortalama 1.073.91 bp uzunluğu.

2.3 Gen fonksiyonel ek açıklaması

Toplam61.423 unigensıralamasından elde edildiCistanche Deserticolaİki farklı konakçı bitkiyi parazitleyen örnekler. Ek açıklama sonuçları aşağıdaki gibidir:

30.689 UNIGEN (%49.96)açıklamada açıklandıNR (Yedekli Olmayan) Protein Veritabanı.

18.698 unigen (%30.44)açıklamada açıklandıİsviçre-Prot Veritabanı.

3.998 unigen (%6.51)açıklamada açıklandıKegg Veritabanı.

17.188 unigen (%27.98)açıklamada açıklandıKog (ökaryotik ortolog gruplar) veritabanı.

25.280 unigen (%41.16)açıklamada açıklandıEggnog (Genlerin Evrimsel Şecere: Denetimsiz Ortolog Gruplar) Veritabanı.

16.210 unigen (%26.39)açıklamada açıklandıGo (Gen Ontology) Veritabanı.

16.153 unigen (%26.30)açıklamada açıklandıPFAM (Protein Aileleri) Veritabanı.

Bunlar arasında,21.650 unigendaha uzundu1 kb.

Homoloji analiziNR Veritabanıen yakından ilişkili en iyi üç türün şunlar olduğunu ortaya çıkardı:

Paulownia Fortunei (%30.23)

Phtheirospermum japonicum (%14.15)

Chenopodium Quinoa (%7.1)

 

 

Tablo 2 Ek açıklama bilgileriCistanche DeserticolaGen işlevi

Veritabanı	Ek açıklama gen numarası	Oran (%)
NR	30,689	49.96
İsviçre	18,698	30.44
Kegg	3,998	6.51
Kog	17,188	27.98
Eggnog	25,280	41.16
GİTMEK	16,210	26.39

 

 

2.4 Go ve Kegg Fonksiyonel Ek Açıklama ve Sınıflandırma

.Go (Gen Ontology) Veritabanıiçinde tanımlanan unigenes'e daha fazla açıklama açıklaması yapmak için kullanıldıNR Veritabanı, toplamda16.210 unigen. Bu unigenesÜç ana fonksiyonel grup:

Biyolojik Süreç (BP)

Moleküler Fonksiyon (MF)

Hücresel Bileşen (CC)

İçindeBiyolojik Süreç (BP) kategorisi, en bol unigene kümeleri şunlardı:

"Hücresel Süreç" (11.023 unigen)

"Metabolik Süreç" (9,117 unigen)

İçinHücresel Bileşen (CC) kategorisi, 17 Alt Kategorien azından her bir alt kategori ile tanımlandı30 unigen. En büyük kümeler şunlardı:

"Hücre" (13.947 unigen)

"Hücre kısmı" (13.918 unigen)

İçindeMoleküler Fonksiyon (MF) kategorisi, en zenginleştirilmiş fonksiyonel gruplar şunlardı:

"Bağlayıcı" (10.039 unigen)

"Katalitik Aktivite" (8.490 unigen)

Şekil 2, unigenlerin fonksiyonel ek açıklaması ve sınıflandırması

 

KEGG fonksiyonel ek açıklama ve sınıflandırma

Sırasındatranskriptom dizisi, toplam3.998 unigenaçıklamada açıklandıKegg (Kyoto Genler ve Genomes Ansiklopedisi) Veritabanı. Bu unigenesAltı Birincil Kategori, ilgili unigene sayıları ve oranları aşağıdaki gibi:

Hücresel süreçler: 326 UNIGEN (8.15%)

Çevresel Bilgi İşleme: 299 Unigenes (7.47%)

Genetik bilgi işleme: 1.771 unigen (44.30%)

İnsan hastalıkları: 14 unigen (0.35%)

Metabolizma: 1.465 unigen (36.64%)

Organizma sistemleri: 123 unigen (3.07%)

Bu altı temel kategori ayrıca20 İkincil Sınıflandırma seviyeleri. Aralarında,Genetik bilgi işlemeen yüksek oranda vardı, ardındanMetabolizma. İçindeMetabolizmaKategori, en bol yollar:

Karbonhidrat metabolizması

Yağ asidi metabolizması

Flavonoid metabolizma

Şekil 3 Kegg Metabolik Yol Unigen'in Ek Açıklaması

 

2.5 Diferansiyel gen ekspresyonu ve zenginleştirme analiziCistanche Deserticolafarklı ana bilgisayarlardan

Transkriptom sekanslama verileri,Varsayılan Diferansiyel İfade Seçimi Kriterleri, tanımlanması ile sonuçlanır14.089 farklı şekilde eksprese edilmiş genler (DEGS):

6.576 gen yukarı regüle edildi

7.513 gen aşağı regüle edildi

A volkan arsaDEG'lerin genel dağılımını görselleştirmek için üretildi.

İçindeTop 30 GO Zenginleştirme Fonksiyonel SınıflandırmalarıDEG'lerin şu gözlemlendiği gözlendi:

NazaranBiyolojik Süreç (BP)VeHücresel Bileşen (CC)kategoriler,Moleküler Fonksiyon (MF)daha önemli bir derece zenginleştirme sergiledi.

En çok zenginleştirilmiş DEG'ler ile ilişkilendirildiGalaktoz metabolizmasında nükleik asit metabolizması, protein metabolizması ve anahtar enzimler.

Ayrıca, DEG'ler önemli ölçüde zenginleştirildiPolisakkarit metabolizmasıyla ilgili GO terimleri, içermek:

Nişasta metabolik süreci

Glikojen biyosentetik işlem

Sükroz Katabolik Süreç

Glukozidaz aktivitesi

UDP-L-Rhamnoz sentaz aktivitesi

Polisakkarit hidrolaz aktivitesi

Şekil 4 Farklı eksprese edilen genlerin volkanik haritası

 

DEG'lerin KEGG Yolu Zenginleştirme AnaliziCistanche Deserticolafarklı ana bilgisayarlardan

Daha fazla araştırmak içinfarklı şekilde ifade edilen genler (DEG'ler)içindeCistanche Deserticolafarklı konakçı bitkilerden,Kegg Yolu Zenginleştirme Analizigerçekleştirildi. Analiz şunları ortaya koydu:

DEG'ler 117 metabolik yolla eşleştirildi.

.En iyi 20 yolgösterişliÖnemli DEG zenginleştirmesi, aşağıdakiler de dahil olmak üzere en zenginleştirilmiş yollarla:

Yağ asidi metabolizması

-Sinolenik asit metabolizması

Galaktoz metabolizması

Lizin bozulması

Başka bir zenginleştirme analiziEn küçük Q-Değerleri ile En İyi 20 Metabolik KategoriDEG'lerin önemli ölçüde zenginleştirildiğini belirtti:

Organizma sistemleri

Metabolizma

Genetik bilgi işleme

Bu kategoriler arasında,"Metabolizma"En fazla zenginleştirilmiş DEGS'ye sahipti ve en önemli zenginleşmeyi gösterdi. Ayrıca, zenginleştirilmiş metabolik yollarda,Yukarı regüle ve aşağı regüle edilmiş unigen oranı neredeyse eşitti.

Bu bulgular şunu gösteriyorMetabolik yollar önemli bir rol oynardiferansiyel gen ekspresyonundaCistanche Deserticolafarklı ev sahibi bitkilerden, özellikleLipid, karbonhidrat ve amino asit metabolizması.