Lupus Nefritinde Kaspaz-1/Gasdermin D'nin İndüklediği Piroptozun İnhibisyonu Yoluyla Kombinasyon Tedavisinin Yeni Etkileri

Daha fazla bilgi için:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang ve Jin Lin

ÖZ

Amaç: Mikofenolat mofetil, takrolimus ve steroidlerle kombinasyon tedavisi, tam remisyon sağlanmasında etkilidir.lupus nefriti(LN). Kombinasyon tedavisi, gasdermin D'yi (GSDMD) parçalayabilen ve kısa süre öncepiroptozcellat. Bu nedenle, kombinasyon tedavisinin kaspaz-1/GSDMD aracılı baskılanmayı sağlayıp sağlamadığını araştırdık.piroptozLN'de (lupus nefriti).

Nefrit için cistanche Deserticola ma için tıklayın

Yöntemler: GSDMD'nin ekspresyonu ve aktivasyonu, LN'li insan ve farenin böbrek örneklerinde tespit edildi (lupus nefriti) immünohistokimyasal boyama ve immünoblotlama kullanılarak. MRLlpr farelerinden izole edilen birincil podositler, LPS artı ATP ile inkübe edildi ve monoterapi veya kombinasyon tedavisi ile ön işleme tabi tutuldu. Kaspaz-1/GSDMD kaynaklı inhibisyonpiroptozkombinasyon terapisi ile MRLlpr farelerinde ve insan numunelerinde değerlendirildi. Bir FAM kaspaz-1 kiti ve akış sitometrisi kullanılarak muayene edildim. arasındaki korelasyonpiroptozperiferik kanda ve sistemik lupus eritematozus hastalığı aktivite indeksi (SLEDAl) analiz edildi.

Sonuçlar: LN'den böbrek dokusu örnekleri (lupus nefriti) hastalar ve fareler, GSDMD'nin büyük ölçüde artmış ekspresyon seviyeleri ve bölünmesi sergilediler. Kültürlenmiş podositlerde, kombinasyon tedavisi NLRP3 ve kaspaz-1 aktivasyonunu önemli ölçüde bastırdı ve GSDMD N-terminal seviyelerini azalttı. Kombinasyon tedavisi, kaspaz-1/GSDMD aracılı inhibisyonu yoluyla hastalık ilerlemesini bastırdıpiroptozhem insanlarda hem de MRL/LPR farelerinde. Periferik kandaki kaspaz-1/PI pozitif hücre sayıları, SLE-DAl ile pozitif korelasyon gösterdi. LN (lupus nefriti) tam remisyon ve kısmi remisyona sahip hastalarda kaspaz-1/PI pozitif hücre sayıları başlangıca kıyasla önemli ölçüde azalmıştır. GSDMD'den türetilmiş bir inhibitör olan Ac-FLTD-CMK, LN gelişimini engelledi (lupus nefriti).

Sonuç: Kombinasyon tedavisi kaspazı baskıladı-1/GSDMD aracılıpiroptozin vitro ve in vivo ve azaltılmış hastalık ilerlemesi.

Anahtar Kelimeler:lupus nefriti, piroptoz, kaspaz-1, gasdermin D, terapi

Tedavi tedavisipiroptoz

GİRİİŞ

Lupus nefriti(LN), otoimmün hastalık sistemik lupus eritematozus(SLE) sonucu ortaya çıkan böbrek iltihabıdır.LN (lupus nefriti) SLE'den muzdarip hastalarda önemli bir tezahürdür. Hastaların yaklaşık yüzde 60'ı bu durumu geliştirir ve yaklaşık yüzde 20'si son dönem böbrek hastalığına (SDBY) (1) ilerler. Mikofenolat mofetil (MMF), kalsinörin inhibitörleri (CNI) ve steroidlerle kombinasyon tedavisi tamamlayıcı etkiler üretir ve ayrıca toksisiteyi en aza indirir (2). Bu terapi, LN için başlangıç ​​tedavisi olarak önerilmektedir (lupus nefriti) ve intravenöz siklofosfamid (IVCY) ve steroidlere (3-5) kıyasla daha iyi etkinlik ve daha eksiksiz remisyon sağlar.

Kombinasyon tedavisinin moleküler ve hücresel mekanizmalarını araştırmak için, bir murin LN modelinde kapsamlı transkriptomik analiz kullanıldı. (lupus nefriti). MRL/LPR farelerine monoterapi veya üçlü ilaç kombinasyonları olarak tek başına MMF, takrolimus veya prednizon verildi. LN'li farelerin böbreklerindeki genlerin ekspresyon profilleri (lupus nefriti)monoterapilere kıyasla kombinasyon tedavisinin ilave ve sinerjik etkilerini açıklayabilecek potansiyel mekanizmaları ortaya çıkardı. Kombinasyon tedavisi ile benzersiz bir şekilde modüle edilen 45 aşağı regüle edilmiş genden biri kaspazdır-1 (6). Entegre bir kaspaz afinite alanı ile NLRP3, pro-kaspaz-1 ve apoptozla ilişkili benek benzeri proteinden (ASC) oluşan multiprotein oligomerleri olan inflamatuarlar tarafından aktive edilir. NLRP3/ASC/kaspaz-1 enflamasyonu, LN patogenezine önemli bir katkıda bulunan olarak kabul edilmiştir. (lupus nefriti). NLRP3 inflamasyonu, kaspaz-1'ı aktive ederek otoinflamatuar bozuklukları harekete geçirir ve proinflamatuar sitokinlerin oluşumunu başlatır, örneğin LN'de(7-9) podosit fonksiyon bozukluğunu tetiklediği bilinen IL-1.

Aktif kaspaz-1, gasdermin D'yi(GSDMD) N- ve C-terminal alanlarının bağlantısı içinde parçalar. Daha sonra, N-terminal alanı hücre zarında gözenek oluşumunu kolaylaştırır, hücreyi uyarır.piroptozve sitokin IL-1 ve IL-18 üretimi(10). Gelişmekte olan çalışmalar, GSDMD'nin aracılık ettiğini göstermiştir.piroptozotoimmün ensefalomiyelit (11), multipl skleroz(12), alkolik hepatit(13) ve inflamatuar bağırsak hastalığı(14) dahil olmak üzere hastalıkların ilerlemesinde rol oynar.Ayrıca, kaspazın genetik veya farmakolojik inhibisyonu-1/GSDMD diyabetik böbrek hastalığının fare modellerinde(15, 16) ve ayrıca akut böbrek hasarından sonra(17-19) böbrekleri hasardan koruduğu gösterilmiştir. Yine de,piroptozLN'de (lupus nefriti)hala tam olarak tanımlanmamıştır(20). Kombinasyon tedavisinin LN'de faydalı etkiler sağladığını varsaydık. (lupus nefriti)) engelleyerekpiroptozkaspaz-1/GSDMD tarafından indüklenir.

Bu çalışmada, böbrek dokularında kaspaz-1 ve GSDMD'nin aktivasyonu ve kombinasyon tedavisinin kaspaz-1/GSDMD'ye bağlı üzerindeki etkileri araştırıldı.piroptozMRL/LPR farelerinde ve LN'li hastalarda inhibisyon (lupus nefriti). potansiyel korelasyonlarıpiroptozSLE hastalık aktivite indeksi (SLEDAI) ile ve tedavi yanıtları da değerlendirildi.

Tedavipiroptoz

MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Çalışma Nüfusu

Çalışma kohortu, biyopsi ile LN tanısı konan hastalardan oluşuyordu (lupusnefrit) Kayıttan en az 6 ay önce. Hastanın yaş aralığı 18-65 idi ve tümü Amerikan Romatoloji Koleji SLE (2l, 22) ve Uluslararası Nefroloji/Renal Patoloji Derneği (2003) sınıflandırma kriterlerini karşıladı. Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Nanjing Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden proteinürisi (1,5 g/d'ye eşit veya daha büyük) ve serum kreatinin konsantrasyonları 265,2 umol/L'ye eşit veya daha düşük olan hastalar alındı. Dışlama kriterleri şunları içeriyordu: bir hasta daha önce yüksek dozlarda metilprednizolon ile tedavi edilmişti; biyolojikler (spesifik patojenik molekülleri hedefleyen) veya kombinasyon tedavisi; mevcut plazmaferez veya taramadan sonraki 12 hafta içinde intravenöz globulin ile tedavi; anormal karaciğer fonksiyonları; mevcut aktif enfeksiyonlar; ve çalışmanın başlamasından sonraki 4 hafta içinde habis bir tümör. LN (lupusnefrit) hastalar, 0.5 g/d dozunda 3 gün boyunca metilprednizolon ile nabız tedavisi aldı. Metilprednizolon puls tedavisi tamamlandıktan sonra, prednizon (0.6 mg/kg/gün), MMF (0.5 g, iki doz/gün) ve takrolimus (2 mg, iki doz/d) toplam 4 hafta süreyle verildi. Daha sonra halen MMF(0.5 g, iki doz/gün) ve takrolimus(2 mg, iki doz/gün) ile kombine edilen prednizon dozları 2 haftada bir 5 mg/gün azaltıldı. 10 mg/gün idame dozuna ulaşıldı(4). Tam remisyon(CR), 24-saat idrar protein konsantrasyonu 0,4 g'dan az veya buna eşit, aktif idrar tortularının yokluğu, serum albümin konsantrasyonu 35 g/L'den büyük veya ona eşit ve normal kreatinin olarak alındı. (23) Kısmi remisyon (PR), 24-saat idrar protein konsantrasyonunda 3.5 g'dan az veya buna eşit yüzde 50'den büyük veya buna eşit bir düşüş, 30 g/'den büyük veya buna eşit bir serum albümin konsantrasyonu olarak alındı. L ve serum kreatinin konsantrasyonunda başlangıca göre normal veya yüzde 25'ten az veya buna eşit bir artış. Kurumsal İnceleme Kurulumuz çalışmayı onayladı (No. IIT20200410A) ve tüm hastalar kayıttan önce yazılı onay verdi.

Hayvan Modelleri

Dişi MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) fareleri SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Shanghai, China) tarafından sağlandı, tüm fareler rastgele sayı üreteci yardımıyla rastgele bölündü, her grupta ve her kafeste 5 fare . 8 haftalıkken oral olarak 00.5 mg/kg takrolimus (MCE HY-13756),50 mg/kg MMF(MCE HY-B0199) ve 1 mg/kg kombinasyonu ile tedavi edildiler. kg prednizon(MCE HY-B0214)veya daha önce tarif edildiği gibi toplam 8 hafta boyunca araç(6). Ac-FLTD-CMK, MCE tarafından sentezlendi ve günde 10 mg/kg ip olarak enjekte edildi. Tüm tedaviler, aşağıdaki tespitten sorumlu katılımcılara kör edildi. İdrar albümin-kreatinin oranı (UACR), Albuwell M ve Creatinin Companion (Excell, Phil, ABD) kullanılarak belirlendi. Böbrek örnekleri histolojik ve İmmünohistokimyasal boyamadan önce yüzde 4 paraformaldehit içinde sabitlendi ve immünoblotlama analizi için böbrek korteksleri çıkarıldı. Fare kullanımı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulumuz (No.2019-883) tarafından onaylanmıştır.

Fare Glomerül izolasyonu ve Podosit Kültürü

Glomerüller, 12-haftalık dişi C57 ve MRL/LPR farelerinin böbreklerinden daha önce anlatıldığı gibi saflaştırıldı(24). Anestezi uygulanmış fareler, 37 derece C önceden ısıtılmış manyetik boncuklarla perfüze edildi. Böbrekler çıkarıldı ve buz üzerinde 1 mm³ olacak şekilde kıyıldı. Daha sonra böbrek dokuları 37 derecede 1 mg/ml kollajenaz ve 100 U/ml DNase I ile 30 dakika sindirildi, ardından iki kez 100-um Falcon hücre süzgeçleri（431752, BD ile süzüldü). 4 derece HBSS solüsyonu (H1025, Solarbio) ile birkaç yıkamadan ve 200 g'de 5 dakika hafif santrifüjlemeden sonra manyetik stand (HY-K0200, MCE) kullanılarak glomerül içeren boncuklar toplandı ve üç kez HBSS solüsyonu ile yıkandı. İzole glomerüller, Jeffrey (25) tarafından tarif edilen yönteme göre, yüzde 5 CO2'de, tip I kollajen (C3867, Sigma-Aldrich) kaplı kültür kapları üzerinde 37 derecede kültürlendi. In vitro deneyde pasaj 2 podositleri kullanıldı.piroptozİndüksiyon, Sitotoksisite ve IL-1 Salgı Tespiti

MRL/LPR farelerinden alınan podositler, 4 saat boyunca Opti-MEM'de çözülen 1 mg/ml LPS (tell-pb5lps, InvivoGen) ile hazırlandı, ardından 5mM ATP(tlrlatpl, In Vivo gen)stimülasyonu takip edildi. C57 farelerinden alınan podositler, normal kontrol olarak kesildi. Takrolimus（10μM）, MMF（luM） ve prednizon（10μM） monoterapileri veya kombine tedavi, LPS hazırlamadan önce hücrelerle 1 saat önceden inkübe edildi. Stimülasyondan sonraki sitotoksisite, üreticinin talimatlarına göre bir sitotoksisite saptama kiti (11644793001, Roche) kullanılarak belirlendi. Stimülasyondan sonra süpernatan toplandı ve üreticinin talimatlarına göre IL-1 fare ELISA Kiti(BMS6002, Invitrogen) kullanılarak ölçüldü.

Antikorlar ve Reaktifler

Kaspaz-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre değerlendirildi.piroptozperiferik kanda akış sitometrisi ile FAM FLICAMCaspase-1 Kiti(Bio-Rad, ABD) kullanılarak ölçüldü.

İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler GraphPad Prism(vers. 8.0) kullanılarak yapıldı ve veriler ortalama ± SD olarak verildi. Student t-testi kullanılarak iki grup karşılaştırması ve Pearson korelasyonu kullanılarak korelasyon analizleri yapıldı. iki kuyruklu p<0.05 was="" considered="" statistically="">

Tedavipiroptozlupus nefriti (LN)

SONUÇLAR

GSDMD AracılıpiroptozLN'den Etkilenen Böbreklerde Aktive Edilir (lupusnefrit)

GSDMD'nin LN patogenezine katkıda bulunup bulunmadığını araştırmak için (lupusnefrit), önce LN'den alınan böbrek örneklerinde GSDMD'nin protein ekspresyon seviyesini test ettik (lupusnefrit) hastalar. İmmünohistokimyasal analiz, LN'den alınan böbrek biyopsi örneklerinde GSDMD'nin belirgin şekilde artan ekspresyon seviyelerini ortaya çıkardı (lupusnefrit) tip IV, V, I artı Vand IV artı V olan hastalar ve sağlıklı deneklerle karşılaştırıldığında. GSDMD evrensel olarak LN'deki glomerüler podositlerde, tübüler hücrelerde ve infiltre interstisyel hücrelerde eksprese edildi.lupusnefrit) hastalar. Pozitif (Kırmızı oklar) ve negatif boyama (Siyah oklar) olan alan büyütüldü(Şekil 1A). Böbrekteki GSDMD-pozitif alan yüzdesi daha sonra tahmin edildi(Şekil 1B). MRL/LPR farelerinin ve vahşi tip kontrollerin böbreklerinde de benzer sonuçlar bulundu. İmmünoblotlama analizi, MRL/LPR farelerinin böbrek örneklerinde GSDMD'nin ekspresyonunun ve bölünmesinin büyük ölçüde arttığını doğruladı (Şekil 1C). Glomerüler podositler, tübüler hücreler ve infiltre interstisyel hücrelerdeki GSDMD, kontrol farelerine kıyasla MRL/LPR farelerinde yükselmiştir (Şekil 1D). Bu veriler, GSDMD'nin aracılık ettiği LN'den etkilenen böbrek dokusunda aktive olduğunu gösterdi (lupusnefrit).

ŞEKİL 1|GSDMD, LN'den (lupus nefriti) etkilenen hastaların ve farelerin böbreklerinde güçlü bir şekilde yükselir ve bölünür.

(A) Sağlıklı deneklerden ve LN'den alınan böbrek örneklerinde GSDMD'nin immünokimyasal boyaması (lupusnefrit) hastalarda pozitif (Kırmızı oklar) ve negatif boyama (Siyah oklar) büyütüldü.

(B) GSDMD pozitif alanların niceliği tip III artı V, IV, IV artı V, V LN'de gösterilir (lupusnefrit) hastalar ve sağlıklı denekler.

(C) Üç çift kontrol ve MRL/LPR faresinden renal kortekste tam uzunlukta, bölünmüş N-terminal alanı ve C-terminali alanı GSDMD'nin immünoblot analizi.

(D) Kontrollerden ve MRL/LPR farelerinden alınan böbrek örneklerinde GSDMD'nin immünokimyasal boyaması.

*p < {0}}.05,="" **p="">< 0.01.="" ln="">lupusnefrit), lupusnefrit; FL, tam uzunlukta; NT, N-terminal alanı; CT, C-terminal alanı.

Kombinasyon Tedavisi GSDMD Aracılı BastırıyorpiroptozIn Vitro Primer Podositlerde Aktivasyon

Kombinasyon tedavisinin önleyici etkilerini araştırmakpiroptozindüklemek için LPS artı ATP stimülasyon yöntemini uyguladık.piroptozMRL/LPR farelerinden alınan podositlerde, normal kontrol olarak vahşi tip C57 farelerinden alınan podositler alınır. MRLlpr farelerinden alınan podositler, 4 saat süreyle LPS ile hazırlandı ve ardından 4 saat süreyle GSDMD aracılı için yaygın olarak kullanılan bir uyarıcı olan ATP ile tedavi edildi.piroptozaktivasyon(26). Normal kontrol ile karşılaştırıldığında, podositler daha sonra hücre şişmesi ve kabarcıklanma gibi piroptotik morfolojik özellikler sergiledi. Kombinasyon tedavisi ile ön tedavi, piroptotik morfolojik özellikleri ve sitotoksisiteyi önemli ölçüde iyileştirdi (Şekil 2A). LPS artı ATP kaynaklı podosit sitotoksisitesi. Karşılaştırmalı olarak, kombine terapi, LPS artı ATP uyarımı tarafından indüklenen süpernatanda sitotoksisite ve IL-1 salgısını önemli ölçüde azalttı (Şekil 2B, C). GSDMD aracılı aktivasyonun daha fazla doğrulamak içinpiroptoz, immünoblotlama kullanarak kanonik inflamatuarları ve GSDMD aktivasyonunu analiz ettik. Piroptotik morfolojik değişiklikler ve sitotoksisite ile uyumlu olarak, LPS artı ATP, podositlerde NLRP3'ü, kaspazı-1 ve parçalanmış GSDMD'yi önemli ölçüde aktive etti(Şekil 2D). Kombinasyon tedavisi, NLRP3 ve kaspaz-1 aktivasyonunu belirgin şekilde bastırdı ve GSDMD N-terminali seviyesini düşürdü. Özellikle, takrolimus, MMF veya prednizon ile monoterapiler LPS artı ATP'yi baskıladı, hücre sitotoksisitesini ve L-1 sekresyonunu uyardı, ancak kombinasyon tedavisi Kaspaz-1 ve GSDMD üzerinde daha önemli bir inhibitör etki gösterdi. Bu sonuçlar, kombinasyon tedavisinin GSDMD'nin aracılık ettiği durumu iyileştirdiği görüşünü destekleyen kanıtlar sağladı.piroptozNLRP3 ve kaspaz-1 aktivasyonunu bastırarak.

ŞEKİL 2|Kombinasyon tedavisi, in vitro olarak podositlerde piroptozu iyileştirir.

(A) LPS artı ATP ile inkübe edildikten ve kombinasyon tedavisi ile ön işleme tabi tutulduktan sonra kültürlenmiş birincil podositlerde piroptotik özellikler sergilendi. Oklar, piroptotik benzeri özellikler sergileyen hücreleri gösterdi.

(B) Tehdit edilen hücrelerden alınan süpernatanlar, LDH salgılaması ile ölçüldüğü gibi hücre ölümü için analiz edildi.

(C) Tehdit edilen hücrelerden alınan süpernatanlar, IL-1b salınımı için analiz edildi.

(D) NLRP3, kaspaz-1, GSDMD-NT ve ASC ifadesinin takrolimus, MMF, prednizon veya NLRP3 inflamatuar aktivasyonundan sonra kombinasyon tedavisinden sonra immünoblotlama analizi.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001;="" ****p="">< 0.0001.="" ldh,="" laktat="">

DSMO, Dimetil sülfoksit, FK506, takrolimus; MMF, mikofenolat mofetil; PNS, prednizon; COM, kombinasyon tedavisi; ASC, apoptozla ilişkili benek benzeri protein.

Kombinasyon Tedavisi Bastırılmış Kaspaz-1/GSDMD'nin İndüklediğipiroptozMRL/LPR Farelerde

Sekiz haftalık MRL/LPR farelerine MMF, takrolimus ve prednizon veya araç kontrolünün bir kombinasyonu verildi. Önceki bir çalışma (6) ile tutarlı olarak, 8 haftalık tedaviden sonra, araç ve kombinasyon tedavi grupları arasında mortalite veya vücut ağırlığında hiçbir fark bulunmadı. Araç grubunun aksine, kombinasyon tedavisi proteinüri, glomerüloskleroz ve renal interstisyel bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunu önlemede çok etkiliydi (Ek Şekil 1).

Daha sonra, kombinasyon tedavisi ve araç kontrol gruplarında kaspaz-1 ve GSDMD ekspresyon seviyelerini inceledik. İmmünohistokimyasal analiz, kombinasyon tedavisi grubunda glomerüler ve renal interstisyel kaspaz-1 ve GSDMD ekspresyonunun belirgin şekilde azaldığını ortaya koydu (Şekil 3A). İmmünoblotlama analizi ayrıca, kombinasyon tedavisi grubunun böbrek kortekslerinde kaspaz-1 ve GSDMD'nin azalmış bir ekspresyonu ve bölünmesini buldu(Şekil 3B). Ayrıca, akış sitometrisi kullanılarak kaspaz-1/propidium iyodür (PI) çift pozitif hücreler sayıldı vepiroptozFAM Kaspaz-1kiti. Sonuçlar, araçla tedavi edilen MRL/LPR farelerine kıyasla kombinasyon tedavisi alan MRL/LPR farelerinde kaspaz-1*/PI' periferik kan hücresi sayılarında belirgin bir azalma olduğunu ortaya koydu.(Şekil 3C,D). Ek olarak, kombinasyon tedavisi serum Ii konsantrasyonunu da önemli ölçüde azalttı (Şekil 3E). Böylece, kombinasyon tedavisinin kaspaz-1/GSDMD'nin neden olduğu baskıladığı sonucuna vardık.piroptozLN'nin böbreklerinde ve kan hücrelerinde (lupusnefrit) fareler.

ŞEKİL 3|MRL/LPR farelerinde kombinasyon tedavisi kaspaz-1/GSDMD aracılı piroptozu zayıflattı.

(A) MRL/LPR fare böbrek örneklerinde GSDMD ve kaspaz-1'ın immünokimyasal boyaması. Araç kontrolü ile karşılaştırıldığında, kombinasyon tedavi grubunda kaspaz-1 ve GSDMD ekspresyonu belirgin şekilde inhibe edildi.

(B) MRL/LPR farelerinin renal korteks örneklerinde tam uzunlukta ve parçalanmış GSDMD ve kaspaz-1'ın immünoblot analizi; araç ve kombinasyon tedavi gruplarından elde edilen sonuçların karşılaştırılması.

(C) Kombinasyon tedavisi verilen veya verilmeyen MRL/LPR farelerinden alınan periferik kandaki kaspaz-1/PI çift pozitif hücrelerinin FACS'si.

(D) Kombinasyon tedavisi verilen veya verilmeyen MRL/LPR farelerinin periferik kanındaki kaspaz-1/PI çift pozitif hücrelerinin miktar tayini.

(E) Kombinasyon tedavisi verilen veya verilmeyen MRL/LPR farelerinde serum IL{{0}}b konsantrasyonlarının miktar tayini. ####P < 0.0001.="" facs,="" floresanla="" aktive="" olan="" hücre="" sınıflandırması;="" bt,="" kombinasyon="">

Kombinasyon Tedavisi Bastırılmış Kaspaz-1/GSDMD'nin İndüklediğipiroptozLN'de (lupusnefrit) Hastalar

Ocak 2020 ile Haziran 2020 arasında, 47 LN hastası (lupusnefrit) kaydedildi ve 43 24-haftalık kombinasyon tedavisi tamamlandı. Kaydedilen kohortun temel hastalığı ve demografisi Ek Tablo 1'de listelenmiştir. Kaspaz-1/propidium iyodür miktarı (PI çift pozitif hücreler, LN'li hastalarda yürütülmüştür (lupusnefrit) tip III, IV, V, III artı V, IV artı V ve sağlıklı kontrollerdepiroptozFAM Caspase-1 kiti ve akış sitometrisi. Sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında, periferik kandaki kaspaz-1/PI çift pozitif hücre sayısı arttı (Şekil 4A, B). 24-haftalık tedaviden sonra ve başlangıçta kaspaz-1/PI çift pozitif hücreleri de inceledik. 24-haftalık indüksiyon tedavisinden sonra, CR ve PR insidansı sırasıyla yüzde 39,5 (17/43) ve yüzde 32,6 (14/43) olmuştur. CR ve PR hastalarının periferik kanındaki kaspaz-1/PI çift pozitif hücre sayıları, taban çizgisine kıyasla önemli ölçüde azaldı (Şekil 4C). Ayrıca kaspaz-1 ile indüklenen arasında bir korelasyon belirledik.piroptozve SLEDA; veriler, periferik kandaki kaspaz-1/PI pozitif oranının SLEDAI ile pozitif olarak ilişkili olduğunu açıkça gösterdi (Şekil 4D). GSDMD'den Türetilmiş Bir İnhibitör olan Ac-FLTD-CMK, LN Gelişimini Önledi (lupusnefrit).

ŞEKİL 4|Kombinasyon tedavisi, LN (lupus nefriti) hastalarında kaspaz-1-aracılı piroptozu zayıflattı.

(A) LN'nin periferik kanındaki kaspaz-1/PI çift pozitif hücrelerinin FACS'si (lupusnefrit) kombinasyon tedavisi uygulanan veya uygulanmayan hastalar.

(B) Tip III, IV, V, III artı V ve IV artı V LN periferik kandaki kaspaz-1/PI çift pozitif hücrelerinin miktar tayini (lupusnefrit) hastalar ve sağlıklı denekler.

(C) LN'nin periferik kanındaki kaspaz-1/PI çift pozitif hücrelerin miktar tayini (lupusnefrit) başlangıçtaki hastalar, CR, PR ve kombinasyon tedavisinden sonra remisyonda olmayan hastalar.

(D) SLE-DAI ile kaspaz-1/PI çift pozitif hücre oranlarının korelasyon analizi.

**p < 0.01.="" facs,="" floresanla="" aktive="" olan="" hücre="" sınıflandırması;="" ln="">lupusnefrit), lupusnefrit; CR, tam remisyon; PR, kısmi remisyon; SLE-DAI, sistemik lupus eritematozus hastalığı aktivite indeksi.

Yakın tarihli bir çalışma, GSDMDhmice'in imikimod ile indüklenen bir SLE modelinde renal C3 ve IgG birikiminde artış, daha şiddetli böbrek hasarı ve artmış mortalite geliştirdiğini bulmuştur.17 GSDMD'nin LN'deki rolünü daha da netleştirmek için (lupusnefrit), MRL/LPR fareleri, kontrole göre araçla 8-haftadan başlayarak Ac-FLTD-CMK21 ile tedavi edildi. 8-haftalık tedaviden sonra, araç ve Ac-FLTD-CMK ile tedavi edilen grup arasında ölüm oranı veya vücut ağırlığı açısından hiçbir fark bulunmadı. Araç kontrol fareleriyle karşılaştırıldığında, Ac-FLTD-CMK ile tedavi edilen MRL/LPR farelerinde daha düşük bir idrar albümin-kreatinin oranı (Şekil 5A), daha düşük bir serum kreatinin konsantrasyonu (Şekil 5B), azaltılmış glomerüloskleroz (Şekil 5C) ve CD3 vardı. , CD4 ve CD68 pozitif hücre infiltrasyonu (Şekil 5D). İmmünohistokimya sonuçları, GSDMD'nin ifadesinin azaldığını gösterdi(Şekil 5D) ve ELISA ile belirlenen serum IL-1 salgısını bastırdı(Şekil 5E). Toplu olarak, veriler Ac-FLTD-CMK'ninpiroptozLN'den etkilenen böbreklerde (lupusnefrit).

ŞEKİL 5|GSDMD'den türetilmiş bir inhibitör olan Ac-FLTD-CMK, LN (lupus nefriti) gelişimini engelledi.

(A) İdrar albümini-kreatinin oranı, bir GSDMD inhibitörü verilen veya verilmeyen MRL/LPR farelerinde hesaplandı.

(B) GSDMD inhibitörü verilen veya verilmeyen MRL/LPR farelerinde serum kreatinin.

(C) Periyodik asit-Schiff (PAS) ve kantifikasyon glomerüloskleroz yüzdesi ile boyanmış böbrek örneklerinin temsili görüntüleri.

(D) CD3, CD4, F4/80 ve GSDMD'nin immünokimyasal boyaması. (E) GSDMD inhibitörü verilen veya verilmeyen MRL/LPR farelerinde serum IL-1b konsantrasyonlarının miktar tayini.

Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. #p < {0}}.05,="" ##p=""><>

TARTIŞMA

Kombinasyon tedavisi, daha yüksek CR ve genel yanıt oranları, daha kısa remisyon süresi ve daha az yan etki nedeniyle umut verici bir stratejidir. Şimdiye kadar, kombinasyon tedavisinin altında yatan moleküler mekanizmalar bilinmiyordu. Yakın zamanda, Fu ve diğerleri(6) MRL/LPR farelerini monoterapiler veya kombinasyon terapisi ile tedavi etti ve tüm böbrekler üzerinde kapsamlı bir transkriptomik analiz gerçekleştirdi. İlginç bir şekilde, kaspaz-1 ifadesini özellikle ve benzersiz bir şekilde bastıran monoterapilerin değil, kombinasyon tedavisinin olduğunu buldular.

NLRP3/ASC/kaspaz-1 enflamasyonu artık LN'nin patogenezine önemli bir katkıda bulunan olarak kabul edilmektedir (lupusnefrit). Podositlerdeki NLRP3 inflamasyonları, lupus eğilimli farelerde ve ayrıca LN'li hastalarda aktive edilir (lupusnefrit). NLRP3 inflamasyonları bir kaspaz inhibitörü ile baskılandığında, proteinüri, renal histolojik lezyonlar ve podosit ayak prosesinin silinmesinin lupus eğilimli farelerde düzeldiği bulundu(8). Huang et al. (27) NLRP3'ün LN'nin tübüler hücrelerinde eksprese edildiğini bildirmiştir (lupusnefrit) sınıf IV ve NLRP3 aktivasyonunun, LN'li hastalar için aktivite indeks skoru ile pozitif korelasyon gösterdiği. Kaspaz-1'ın lupus ve vasküler disfonksiyonda hayati bir rol oynadığı kanıtlanmıştır ve bu nedenle yeni terapötik müdahaleler için potansiyel bir hedeftir(28). RIP3(29), P2X7 reseptör antagonistleri(30), GSK-3 inhibitörleri (31) ve bir Nrf2 agonisti (32) gibi ortaya çıkan deneysel ilaçlar, LN gelişimini engelledi (lupusnefrit) MRL/LPR farelerinde, NLRP3/ASC/kaspaz-1 inflamatuar aktivitesini modüle ederek, LN'deki NLRP3/ASC/kaspazın-1 inflamatuarının önemini ve kritikliğini vurgular. IL'nin yükselmiş serum konsantrasyonları-18, SLE hastalarında hastalık şiddeti ve böbrek hasarı/tutumu derecesi ile ilişkilidir(33). Bildiğimiz kadarıyla, gasdermin ailesinin gelişimi için gerekli olabileceği görülüyor.piroptoz, ancak SLE hastalarında GSDMD/GSDME'nin varlığına ilişkin kanıt eksikliği olmuştur.

Genel olarak, LN'den alınan böbrek biyopsi örneklerinde GSDMD'nin aktivasyonunu ve ekspresyonunu inceledik (lupusnefrit) hastalar ve MRL/LPR fareleri. GSDMD, glomerüler podositlerde ve tübüler hücrelerde ve infiltre interstisyel hücrelerde güçlü bir şekilde indüklendi ve bölündü. Daha sonra, MRL/LPR farelerine MMF, takrolimus ve prednizon veya aracın bir kombinasyonu verildi. Araç kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, kombinasyon tedavi grubunda kaspaz-1 ve GSDMD aktivasyonu azaldı. derecesipiroptozperiferik kanda da LN'de çok daha düşüktü (lupusnefrit) kombinasyon tedavisinin uygulanmasından sonra hastalar. Dahası,piroptozperiferik kanda SLEDAI ile pozitif korelasyon gösterdi, bu da şunu önerdi:piroptozperiferik kanda SLE aktivitesi için önemli bir belirteç olarak hareket edebilir. Bu nedenle, kombinasyon tedavisinin LN'de faydalı etkiler sağlayabileceğini varsaydık (lupusnefrit) engelleyerekpiroptozkaspaz-1/GSDMD tarafından indüklenir. Ac-FLTD-CMK ile bir komplekste kaspaz-1'ın önceki kristal yapısal çalışmaları, kaspaz-1 tarafından GSDMD'nin tanınmasını önleyen birçok enzim-inhibitör etkileşimini ortaya çıkardı. Bununla birlikte, GSDMD'den türetilmiş bir inhibitör olarak işlev gören Ac-FLTD-CMK'nin inhibe ettiğini bulduk.piroptozLN'de (lupusnefrit), farklı bir mekanizma tarafından indüklenebilir.

Son zamanlarda, SLE(34)'in TLR7-uyarılmış bir murin modelinde, GSDMD-/-fareler daha yüksek derecede böbrek hasarı ve artan ölüm oranı geliştirdi; bu, başlangıçta GSDMD silinmesinin koruyucu bir etkiye sahip olacağını ve aşağıdakilerle ilişkili olduğunu öne sürdü. sistemik inflamasyon ve ilişkili artan mortalite ile otoantikor üretimi. GSDMD eksikliği olan fareler, vahşi tip farelere kıyasla böbrek örneklerinde daha belirgin bir glomerüler bağışıklık kompleksi birikimi ve daha yüksek proteinüri geliştirir. GSDMD-/lenfositlerde hücre dışı HMGB1'in gelişmiş salgılanması da bulundu ve bu nekroz/piroptozGSDMD yokken meydana geldi.

Kaspaz-1 tetikleyicileripiroptozGSDMD bölünmesi ile. Buna karşılık, GSDMD-eksik veya GSDMD-düşük hücrelerde, kaspaz-1 apoptozu ve ardından GSDME'ye bağlı ikincil nekrozu tetikler vepiroptoz. Tedaviden sonra GSDMD aktivitesi olmadığında, GSDME kaspaz-3-aracılı apoptozu da değiştirebilir.piroptoz(35,36).Ayrıca, kaspaz-8 aktivasyonu, GSDMD eksikliği olan makrofajlarda çok arttı. TLR7- ile indüklenen GSDMD-eksik LN'de de kaspaz-8'ın önemli aktivasyonu bulundu (lupusnefrit) fareler(34). Bu nedenle, GSDMD'nin yokluğunda, kaspaz-1'ın kaspaz-8 ile işbirliği yaparak kaspaz-3-GSDME aracılı apoptozunpiroptozLN'de (lupusnefrit), daha fazla deneysel araştırma gerektiren bir hipotez.

Mevcut çalışmada çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, mevcut verilere dayanarak, kombinasyon tedavisinin baskılayabileceğini doğruladık.piroptozancak steroidler ve MMF, steroidler ve takrolimus veya anti-CD20 antikorunun ikili tedavisi gibi diğer tedavilerin de benzer etkileri olabilir. İkincisi, kombinasyon tedavisinin kaspaz-1 üzerindeki inhibisyon etkisinin kesin moleküler mekanizması iyi araştırılmamıştır. Son olarak, periferik kandaki kaspaz-1/PI çift pozitif hücrelerinin SLE-DAI ile ilişkisini ve retrospektif bir LN'de kombinasyon tedavisi tedavisi öncesi ve sonrası değişimi gözlemledik (lupusnefrit) hasta grubu. Hastalık aktivitesi ve tedavi yanıtı için kaspaz-1/PI çift pozitif hücrelerin klinik öngörücü değerinin daha geniş bir prospektif kohortta daha fazla araştırılması gerekir.

Genel olarak, kombinasyon tedavisinin yararlı etkilerini kaspaz-1/GSDMD'nin neden olduğu baskılayarak sağladığını belirledik.piroptozLN'de (lupusnefrit), ilgili hücresel mekanizmalara yeni bir bakış açısı sağladı. Gerçekten de, kombinasyon tedavisi kaspaz-1 ifadesini özel ve benzersiz bir şekilde bastırdı. NLRP3 ve kaspazın farmakolojik veya genetik inhibisyonu-1, LN'de böbrek fonksiyonunu iyileştirdi ve otoimmüniteyi bastırdı (lupusnefrit). LN'de kaspaz-1'ın patofizyolojik rolü (lupusnefrit) daha fazla çalışmaya ve LN'li hastalarda GSDMD'yi hedef alan tedavilere değerdir (lupusnefrit) çok dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir.

Tedavi yöntemipiroptoz

REFERANSLAR

1. Saxena R, Mahajan T, Mohan C.LupusNefrit: Güncel Güncelleme.Arthritis Res Ther (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Bireyselleştirme TerapisiLupusNefrit. Kidney Int Rep (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H,Liu ZH, Xie HL, Hu WX,Zhang HT,LiLS.Sınıf V artı IV'ün Başarılı TedavisiLupusNefritÇok Hedefli Terapi ile. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z, et al.LupusNefrit: Rastgele Bir Deneme, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C, et al.Multitarget Therapy for Maintenance Treatment ofLupusNefrit. J Am Soc Nephrol(2017)28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al.LupusNefrit. Böbrek Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Ummarino D.LupusNefrit: NLRP3 Inflammasome Podosit Disfonksiyonunu Ateşler. Nat Rev Rheumatol(2017)13:451.doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9