Yaşlanma Karşıtı Özellikler ve Mekanizmanın Karşılaştırmalı Bir Çalışması: Resveratrol ve Kalori Kısıtlaması Ⅱ

Yaşlanan sıçanların dokularında resveratrol ve CR'nin SIRT1, p53 ve Foxo3a'nın mRNA ifadeleri üzerindeki etkisi

Oksidatif stres koşullarıgenellikle SIRT1 ekspresyonunu ve aktivitesini indükler. SIRT1, p53 ve Foxo3a [9] dahil olmak üzere temel hayatta kalma faktörlerinin fonksiyonlarını modüle eder. Resveratrol ve CR'nin, D-Gal kaynaklı yaşlanan sıçanlarda SIRT1, p53 ve Foxo3a'nın mRNA seviyeleri üzerindeki etkisini belirlemek için kantitatif RT-PCR deneyleri yapıldı. Karşılık gelen negatif kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, SIRT1 ve Foxo3a mRNA ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde azaldı, ancak D-Gal grubunda p53 seviyesi önemli ölçüde arttı (P < 0.01; Şekil 9A ve 9B). Ayrıca, eş zamanlı tedavi resveratrol veya CR ile D-gal sıçanlarda SIRT1 ve Foxo3a mRNA ifadelerinde artışa neden olurken, model kontrol grubuyla karşılaştırıldığında p53 düzeylerinde düşüşe neden oldu (P < 0.05). Bununla birlikte, CR tedavisi ile karşılaştırıldığında, yüksek doz resveratrol artı D-gal grubunun karaciğerlerinde SIRT1 mRNA ekspresyon seviyesi önemli ölçüde artmış, p53 mRNA ekspresyon seviyesi, yüksek doz resveratrol artı D-gal karaciğerlerinde ve beyinlerinde önemli ölçüde azalmıştır. gal grubu (P < 0.05).

Cistanche Yaşlanma Karşıtı Takviyeler Almak İçin Buraya Tıklayın

Resveratrol ve CR'nin, yaşlanan farelerin beyin dokularında SIRT1-ilişkili ana proteinin ifadeleri üzerindeki etkisi

SIRT1 tarafından düzenlenen FOXO3a ve p53, SIRT1'in akış aşağı molekülleridir. Eşzamanlı olarak, SIRT1 aktivitesi yukarı akış molekülleri tarafından düzenlenir, örneğin DBC1 (KIAA1967 olarak da bilinir), AROS (RPS19BP1 olarak da bilinir) ve tümör baskılayıcı HuR (ELAVL1 olarak da bilinir) [9, 1{21}}] . Resveratrol ve CR'nin D-Gal kaynaklı yaşlanan sıçanlarda p53, FOXO3a, HuR, AROS ve DBC1 protein seviyeleri üzerindeki etkisini belirlemek için western blot deneyleri yapıldı. Karşılık gelen negatif kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, FOXO3a, AROS ve HuR protein ifadelerinin seviyeleri önemli ölçüde azaldı, ancak p53 ve DBC1 seviyeleri, D-gal grubunda önemli ölçüde arttı (P < 0.01) ; Şekil 10). Ayrıca, sıçanlarda eşzamanlı tedavi resveratrol veya CR ile D-gal, FOXO3a, AROS ve HuR protein ifadelerinde bir artışa neden oldu, ancak model kontrol grubuyla karşılaştırıldığında p53 ve DBC1 seviyelerini düşürdü (P < 0.05). Bununla birlikte, CR tedavisi ile karşılaştırıldığında, yüksek doz resveratrol artı D-gal grubunun beyinlerinde HuR protein ekspresyon seviyesi önemli ölçüde artmış ancak DBC1 seviyesi önemli ölçüde azalmıştır (P < 0.05). Resveratrol artı D-gal grubu ile CR artı D-gal grubu arasında p53, FOXO3a ve AROS protein ekspresyonu düzeylerinde fark yoktu (P > 0.05).

Beyin ve karaciğer dokularında FOXO3a ve p53 ifadeleri

FOXO3a ve p53'ün ekspresyon durumu, beyin ve karaciğer dokularında immünohistokimya ile belirlendi. FOXO3a ve p53'ün immünohistokimyasal analizi, beyin ve karaciğer dokularında FOXO3a ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığını ve negatif kontrol grubuyla karşılaştırıldığında D-Gal grubunda p53 ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını ortaya çıkardı (P < 0.{{13} }5, Şekil 11). Ayrıca, eş zamanlı tedavi resveratrol veya CR ile D-gal sıçanlarda FOXO3a ifadesinde bir artışa neden olurken, model kontrol grubuyla karşılaştırıldığında p53 ifadesinde azalmaya neden oldu (P < 0.05). Ancak resveratrol artı D-gal grubu ile CR artı D-gal grubu arasında p53 ve FOXO3a ifadelerinde fark yoktu (P > 0.05).

TARTIŞMA

Yaşlanmanın altında yatan temel kimyasal süreç ilk olarakserbest radikal yaşlanma teorisi[11] veoksidatif stresnormal yaşlanma sürecinde birincil faktör olduğuna inanılmaktadır.Serbest radikal başlatıcı AAPHalışkındıoksidatif strese neden olmakve bir oksidatif model oluşturmakstres kaynaklı hücresel yaşlanmainsan IMR-90 hücrelerinde [12, 13]. Bu yöntemin avantajları, AAPH'nin termal olarak ayrışmasıdır.radikaller oluşturmakbiyotransformasyonlar veya enzimler olmadan ve oranıradikal nesilbaşlatıcının konsantrasyonu ayarlanarak kolayca kontrol edilebilir [12]. AAPH bulunduinsan çoğalmasını engellemekIMR- 90 hücreleri, konsantrasyona ve zamana bağlı bir şekilde. Sonuçlar, AAPH (1 mM) ile 2 günlük inkübasyonun, SA-Gal pozitif oranı yüzdesini, apoptotik hücre popülasyonunu önemli ölçüde artırdığını, SIRT1'in mRNA ifadesini azalttığını ve genişlemiş ve düzleştirilmiş bir morfolojiyi indüklediğini gösterdi. Bunlar, AAPH'nin neden olduğu oksidatif stresin, IMR-90 hücrelerinin yaşlanmasına yol açtığını gösterdi. Bu hücresel yaşlanma modeline dayanarak, 10 uM resveratrol tedavisi, AAPH kaynaklı yaşlanmayı ve apoptozu CR tedavisinden daha etkili bir şekilde inhibe etti.

D-gal hayvan modeli, uluslararası kabul görmüş yaşlanan bir hayvan modelidir ve alanında yaygın olarak kullanılmaktadır.yaşlanma karşıtı ilaçlar. D-gal, hayvanlarda normalde D-galaktokinaz ve galaktoz-1-fosfat tarafından metabolize edilen fizyolojik bir besindir. Bununla birlikte, yukarıdaki enzimler tarafından metabolize edilmeyen ancak hücrelerde biriken aşırı D-gal arzı, oksidatif strese ve hücresel hasara yol açar [14]. Bu nedenle, uzun süreli D-gal uygulaması, hayvanlarda kısalmış yaşam süresi, bilişsel işlev bozukluğu, nörodejenerasyon, oksidatif stres, azalmış bağışıklık tepkileri ve gelişmiş glikasyon son ürünü (AGE) oluşumu gibi doğal yaşlanmaya benzer değişikliklere neden olur [15]. Bu çalışma, dikkate değer öğrenme ve hafıza bozukluğu, MDA üretimi, lipofusin birikimi, T-AOC ve SOD'de düşüş ve beyindeki telomeraz aktivitesinin aşağı regülasyonu ile kanıtlanan mimetik yaşlanma modelinin başarılı bir şekilde kurulduğunu gösterdi. Bu arada resveratrol veya CR tedavileri, antioksidan enzimlerin aktivitesini yükselterek, lipid peroksidasyon ürünlerinin seviyelerini düşürerek ve oksidatif ve antioksidatif sistemlerin dengesini koruyarak D-gal ile indüklenen sıçanları oksidatif strese karşı korumuştur. Davranışsal ve telomeraz aktivite testlerinde, resveratrol veya CR tedavisi, D-gal kaynaklı bilişsel bozukluğu ve telomeraz aktivitesini tersine çevirebilir. Ayrıca, yüksek dozlarda resveratrol ile tedavi edilen yaşlanan model fareler, davranış üzerinde CR ile tedavi edilenlere göre nispeten daha önemli etki göstermiştir.

Şekil 11: Yaşlanan sıçanların karaciğer (A, C) ve beyin (B, D) dokularında p53 (A, B) ve FOXO3a (C, D) ifadelerinin immünohistokimyasal analizi. Büyütme 20× idi. NG, negatif kontrol grubu; MG, model kontrol grubu; RESL, düşük doz resveratrol grubu; RESH, yüksek doz resveratrol grubu; CR, kalori kısıtlama grubu

Çalışmalar, besleyici bir diyet alımında yüzde 10-40'lık bir azalma olan CR'ninyaşlanmayı geciktirir ve ömrünü uzatır, dolayısıyla bu çalışmada CR grubu sıçanlarda yaygın olarak kullanılan bir CR seviyesi (gıda alımında yüzde 40 azalma) uygulandı. Bununla birlikte, bazı araştırmalar, CR'nin doğal olarak yaşlı primatlarda uzun ömür üzerinde yararlı bir etkisinin olmadığını ortaya koydu [16]. Benzer şekilde, resveratrol tedavisinin CR benzeri etkilere neden olduğu gösterilmiş olmasına rağmenenerji metabolizmasıve obez insanlarda metabolik profil [17], normal glukoz toleransı olan obez olmayan kadınlarda metabolik işlevi iyileştirmedi [18]. Bu çalışmalar arasındaki farkların nedeni açık değildir, ancak CR ve resveratrolün metabolik olarak tehlikeye girmiş bireylerde ve sağlıklı bireylerde daha az homeostazı geri getirmek için çalışıyor olması olabilir; bu, SIRT1'in hayvan çalışmalarında bilinen işlevleriyle tutarlı bir olasılıktır [19]. Bu nedenle, resveratrol veya CR'nin yaşlanma karşıtı aktivitelerini karşılaştırmak için doğal olarak yaşlanmış fare modeli yerine D-gal kaynaklı yaşlanan fare modelleri uygulandı.

(NAD plus ) bağımlı bir deasetilaz olan SIRT1, yaşam süresinin uzatılması, stres direnci ve apoptozu azaltmadaki çoklu rolleri nedeniyle çok dikkat çekmiştir [20, 21]. Biriken çalışmalar, SIRT1'in resveratrol ve CR'nin ana hedefi olduğunu kuvvetle ima etmiştir [22]. SIRT1 tarafından düzenlenen p53, Foxo1, Foxo3, Foxo4 ve E2F1 dahil olmak üzere SIRT1'in çok sayıda aşağı akış molekülü vardır. Eşzamanlı olarak SIRT1 aktivitesi, örneğin p53, HIC1, E2F1, DBC1, HuR ve AROS gibi yukarı akış molekülleri tarafından düzenlenir. Akut besin geri çekilmesi, Foxo3a ve p53 transkripsiyon faktörleri tarafından yönetilen SIRT1 promotöründe bir transkripsiyonel programı aktive eder. p53, SIRT1 gen ekspresyonunu baskıladığından, Foxo3a tarafından çıkarılması SIRT1 transkripsiyonunu aktive eder [23]. DBC1 ve AROS yakın zamanda sırasıyla SIRT1 aktivitesinin doğrudan negatif ve pozitif düzenleyicileri olarak tanımlanmıştır, HuR, yaşlı yaşlanmış hücrelerde SIRT1 ekspresyon seviyelerini düşürmenin etkisini göstermektedir [9, 10].

CRyaşlanmayı geciktirir ve medyan ve maksimal yaşam süresini uzatırsıçanlar, fareler, balıklar, sinekler, solucanlar ve mayalar dahil olmak üzere çeşitli türlerde. Bununla birlikte, serbest yaşayan kişilerde bu tür titiz diyet programları etik ve metodolojik sorunları gündeme getirmiştir [24]. Şu anda, sağlık süresini artırmak, yaşam süresini uzatmaktan daha önemli olabilir. Son araştırmalar, resveratrolün, tüm bitki polifenolleri [25] arasında SIR2 aktivitesinin en güçlü tetikleyicilerinden biri olduğunu ve kalori kısıtlamasında görülen benzer mekanizmalar yoluyla ömrü etkilediğini göstermektedir. Bu sonuçlar, CR ve resveratrolün, SIRT1 mRNA ekspresyon seviyelerini geri kazanma, FOXO3a, AROS ve HuR protein ekspresyonlarını artırma ve p53 ve DBC1 seviyelerini düşürme konusunda benzer aktivitelere sahip olduğunu gösterdi. Bu arada, çok sayıda ikna edici kanıt, resveratrolün nörolojik, hepatik ve kardiyovasküler sistemler üzerindeki yararlı etkilerini göstermektedir.

MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Hücre kültürü, stres ve tedaviler

İnsan diploid fibroblast suşu IMR-90, ATCC'den elde edildi. Hücreler, yüzde 5 C02 içinde 37 derecede yüzde 10 fetal sığır serumu (FBS) (Gibco) ile desteklenmiş minimum temel ortamda (MEM) (Gibco, UK) büyütüldü. Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, hücreler kuyucuklu kültür plakalarına 6- ekildi. Bir gün sonra hücreler, MEM artı yüzde 10 FBS içinde seyreltilmiş 1 mM 2,2'-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorür (AAPH) (Sigma, ABD) ile 48 saat muamele edildi. Serbest radikal başlatıcı AAPH ile 48 saatlik bir inkübasyon, oksidatif stres kaynaklı hücresel yaşlanma modeli oluşturur [12, 13]. Kontrol hücreleri, yalnızca kültür ortamında inkübe edildi. AAPH işleminden sonra IMR-90, soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 ile yıkandı ve taze kültür ortamı veya resveratrol (resveratrol grubu) içeren kültür ortamı veya yüzde 3 FBS (CR grubu) ile takviye edilmiş MEM ile bir süre kuluçkalandı. Hasattan önce ek 48 saat.

SA -gal boyama aktivitesi

Yaşlanma biyobelirteçlerinin görünümü tedaviden sonraki günden itibaren kontrol edildi (proliferatif potansiyelin azalması ve SA -gal boyamasında artış) [26]. Daha sonra hücreler, üreticinin SA-gal Staining Kit (CST, ABD) talimatı izlenerek boyandı. Boyamadan sonra, çeşitli alanlarda en az 300 hücre incelendi ve SA -gal pozitif hücreler sayıldı. Bu deneyler üç kez tekrarlandı ve sonuçlar standart sapmalarla (SD) ortalama değerler olarak sunuldu. Muhtemelen hücre birleşmesi nedeniyle spesifik olmayan boyamayı önlemek için, alt birleşen hücrelerle SA-gal histokimyasal boyama yapıldı.

Taramalı elektron mikroskobu analizi

Hücreler, yukarıda açıklandığı gibi 6-kuyu kültür plakalarında lamellerde büyütüldü. Resveratrol ve CR işlendikten sonra lamel plakalardan çıkarıldı, ardından hücreler yüzde 2.5 fosfat tamponlu glutaraldehit içinde sabitlendi ve yüzde 1 tamponlu osmiyum tetroksit içinde sonradan sabitlendi. Sabit numuneler, kademeli bir etanol serisinden dehidrasyondan sonra t-bütil alkole daldırıldı. Numuneler, t-bütil alkolden dondurularak kurutuldu, ardından otomatik ince kaplayıcı (JFC-1600, JEOC, Japonya) kullanılarak altınla buharlaştırılarak kaplandı ve taramalı elektron mikroskobu (JEOL, JSM{{11}) kullanılarak incelendi. }LV, Japonya).

Apoptotik analiz

Resveratrol veya CR inkübasyonundan sonra tüm hücreler, tripsin ile toplandı ve iki kez PBS ile yıkandı, ardından 400 uL Annexin V bağlama tamponunda yeniden süspanse edildi. Daha sonra hücreler, üreticinin Annexin V-FITC hücre apoptoz saptama kiti (BestBio, Çin) talimatı izlenerek boyandı. Flüoresanı tespit etmek için bir FACSCalibur akış sitometresi (Becton-Dickinson, San Jose, CA) kullanıldı ve apoptotik hücrelerin yüzdesi, FACSCalibur'un dahili yazılım sistemi tarafından hesaplandı. Her iz için yaklaşık 104 hücre analiz edildi.

Hayvan prosedürleri

Yaklaşık 200 ± 10 g ağırlığındaki erkek albino Wistar fareleri, Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Tongji Tıp Fakültesi Deneysel Hayvan Merkezinden (SCXK 2010-0009) alındı. Hayvanlar, Çin Tıbbı Hubei Üniversitesi'nin Deneysel Hayvan Merkezinde dozlamadan önce 2 hafta süreyle ortama alıştırıldı ve bu süre zarfında istedikleri kadar yiyecek ve suya ücretsiz erişimleri oldu. Uyum sağlandıktan sonra 50 sıçan seçildi ve onarlı beş gruba ayrıldı. Hayvanlar, Kurumsal Hayvan Etik Komitesi (IAEC) tarafından onaylanan ulusal kılavuzlara ve protokollere göre tutuldu.

Grup I (Negatif kontrol grubu) sıçanları, 6 hafta boyunca tek başına aracı (1 mL/kg vücut ağırlığı, 0,9 yüzde salin) aldı. Grup II (Model kontrol grubu) sıçanlara 6 hafta boyunca D-gal (200 mg/kg vücut ağırlığı, Sigma Chemical, St. Louis, MO) verildi. Grup III (Düşük doz resveratrol grubu) sıçanlara 6 hafta boyunca D-gal ve yüzde 5 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülmüş resveratrol (50 mg/kg vücut ağırlığı) verildi. Grup IV (Yüksek doz resveratrol grubu) sıçanlara D-gal ve resveratrol (100 mg/kg vücut ağırlığı) verildi. Grup V (CR grubu) fareler, 6 hafta boyunca D-gal ve CR aldı (ad libitum ile beslenen farelere [27] göre kalorisi yüzde 40 daha düşük olan bir diyetle beslendi). D-gal intraperitoneal olarak verilirken resveratrol, deneyin tüm süresi boyunca oral olarak verildi. Sıçanlar tedavinin son gününde sakrifiye edildi, ardından kan, serum ve organlar hemen bioassay için toplandı veya daha sonra kullanılmak üzere -80 derecede saklandı.

davranış testleri

Morris su labirenti testi, yaralanmadan 6 hafta sonra sıçanların uzamsal öğrenme ve hafıza kapasitelerini değerlendirmek için tasarlanmıştır [28]. Morris su labirenti testi, 4-günlük öğrenme ve hafıza eğitiminden ve 5. günde bir sonda denemesinden oluşuyordu. Hayvanlar, görsel ipuçlarıyla dairesel bir havuzda (155 cm çapında) eğitildi. Bir kaçış platformu (9.0 cm çapında), 25 ± 2 derecede tutulan havuz suyu yüzeyinin 1.0 cm altına daldırıldı. Platformun konumu, 4-günlük eğitim süresi boyunca kuzeybatı çeyreğinin merkezinde kaldı. Her gün, sıçanlar bir sabah bloğu ve bir öğleden sonra bloğu için eğitildi. Sıçan, 120 saniye içinde platformu bulana kadar serbestçe yüzdü. Başarısız olursa, 10 saniye boyunca platforma yerleştirildi. Kaçış gecikmesi (batık kaçış platformunu bulma) ve yüzme hızı kaydedildi. Prob denemesi, platformun kaldırılması ve her bir sıçanın havuz içerisinde 120 saniye boyunca serbestçe yüzmesine izin verilmesi ile yapılmıştır. Eğitilen kadrandaki (platformun kaldırıldığı yer) platform geçişlerinin sayısı bilgisayarlı bir video sistemi ile kaydedildi. Su labirentinin görünür platform versiyonu, D-gal ve araçla tedavi edilen sıçanlar arasında yüzme hızında önemli bir fark gözlemlendikten sonra gerçekleştirilmedi.

Oksidatif stresle ilişkili biyolojik göstergelerin tespiti

Kan ve dokulardaki MDA, SOD ve T-AOC seviyeleri, ticari olarak temin edilebilen enzimatik test kitleri (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing City, PR China) kullanılarak üreticinin protokolüne uygun olarak fotometrik olarak belirlendi. Bu bölümde açıklanan tüm deneyler, ortalamaları ve SD'yi elde etmek için üç kopya halinde gerçekleştirildi.

Lipofuscin düzeyi Sohal yöntemiyle belirlendi [29]. Kısaca, 200 mg serebral korteksi tarttık, 2 ml kloroform-metanol (2:1) özü ekledik, homojenleştirdik ve süzdük, sonra kalıntıyı özle yıkadık, süzüntüleri birleştirdik, özü 5'e ekledik ml ve bir flüoresans spektrometresi üzerinde flüoresan yoğunluğunu ölçtü. Emisyon dalga boyu 435 nm ve uyarma dalga boyu 365 nm idi. Spektroflorometre, 0.1 M H2S04 içindeki 1 ug/ml'lik bir kinin bisülfat çözeltisi ile yukarıdaki dalga boylarında 50'lik bir sapma verecek şekilde standardize edildi. Sonuçlar nispi flüoresan birimleri/ml kloroform/g ıslak doku ağırlığı olarak ifade edildi.

TE aktivitesinin tespiti

Telomeraz ekstraksiyonu için yaklaşık 30 mg doku, buz gibi soğuk PBS içinde iki kez yıkandı ve son olarak yaklaşık 150 ml PBS içinde homojenleştirildi. TE aktivitesi, üreticinin talimatlarına göre bir TE ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü (Nanjing Sen Beijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Çin). Testlerin hassasiyet limitleri TE için 0,8 IU/L idi.

RT-PCR analizi

SIRT1, Foxo3 ve p53'ün karaciğer ve beyin dokularındaki mRNA ekspresyon seviyeleri, RT PCR analizi kullanılarak analiz edildi. Toplam RNA, Trizol kullanılarak ekstre edildi ve bunların miktarı ve saflığı, 260 ve 280 nm'de absorbans ölçümüne dayalı olarak bir ultra mikrospektrofotometre (Thermo Fisher Scientific, ABD) ile değerlendirildi. Ölçümden sonra, üreticinin talimatlarına göre bir FastQuant RT kiti (Tiangen Biotech, Pekin, Çin) kullanılarak cDNA sentezlendi. SIRT1, Foxo3, p53 mRNA ekspresyon seviyeleri, spesifik primerlerle TIAGEN SuperReal PreMix Plus (Tiangen Biotech, Pekin, Çin) kullanılarak RT-PCR ile ölçüldü (Tablo 2). Kantitatif gerçek zamanlı PCR, her reaksiyonun toplam hacmi olarak 20 uL kullanılarak bir LightCycler 480 derece PCR sistemi (Roche, Basel, İsviçre) ile gerçekleştirildi. PCR amplifikasyonu, 95 derecede 15 dakikalık denatürasyon ile başlatıldı ve ardından 10 sn için 95 derece, 20 sn için 59-63 derece (tavlama sıcaklığı) ve 30 sn için 72 derece ve 72 °C'de son inkübasyondan oluşan 40 döngü izledi. derece 5 dk. Her bir genin elde edilen döngü eşik sayısı (Ct değeri), 2-∆∆CT yönteminin [30] denklemine göre bağıl değişikliklerin katına normalize edildi.

Tablo 2: Primer listesi

Western blot analizi

Beyin dokularında p53, FOXO3a, HuR, RPS19BP1 ve DBC1'in protein ekspresyon seviyeleri western blot analizi kullanılarak analiz edildi. Beyin dokularının toplam proteini, üreticinin talimatlarına göre RIPA Lizis Tamponu (Beyotime, Çin) kullanılarak ekstre edildi. Protein konsantrasyonları, BCA Protein Tahlil Kiti (Beyotime, Çin) kullanılarak belirlendi. 5 mg protein, yüzde 12 SDS-poliakrilamid jelleri kullanılarak ayrıldı ve bir PVDF zarına (0.45 um, Millipore, ABD) aktarıldı. Lekeler, TBS içinde yüzde 5 yağsız sütle bloke edildi, ardından birincil antikorların uygun seyreltilmesiyle gece boyunca 4 derecede inkübe edildi: anti-p53 (SC- 6243, Santa Cruz Biotechnology), anti-FOXO3a (#12829, Hücre Sinyal Teknolojisi), anti-HuR (#12582, Hücre Sinyal Teknolojisi), anti-AROS (Ab201091, abcam), anti-DBC1 (#5857, Hücre Sinyal Teknolojisi), anti- - eylem (AC004, ABlonal Teknolojisi) . Fazla birincil antikorları çıkarmak için zarlar yıkandıktan sonra, zarlar 1:2000-1:5000 (AC004 veya AS003, ABklonal Teknoloji) seyreltisinde uygun ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi. Zarlar 3 kez yıkandı ve ardından Pierce ECL Western Blot Substratı (Thermo Scientific) kullanılarak görüntülendi. -aksiyon dahili kontrol olarak kullanıldı.

İmmünohistokimya

Doku numuneleri, cerrahi olarak çıkarıldıktan ve standart prosedürler kullanılarak parafine gömüldükten sonra 1 saat içinde yüzde 10 nötr tamponlu formalinde sabitlendi. Daha sonra, sabitlenmiş parafine gömülmüş numuneler 5-μm kalınlığında kesitler halinde kesildi; bunlar, ksilen içinde parafinize edildi, etanol içinde yeniden hidratlandı ve antijen elde edilmesi için mikrodalga ile işlendi. Uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor, anti-p53 (SC-6243, Santa Cruz Biotechnology) ve anti-FOXO3a (#12829, Hücre Sinyal Teknolojisi), bir nem odasında oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edildi. Slaytlar daha sonra PBS'de durulandı ve ardından anti-tavşan antikoruna karşı ikincil antikorla ve HRP'nin görselleştirilmesiyle (konsantrasyon 1:300, #074-1506, KPL) inkübe edildi. Daha sonra lamlar yıkandı ve kesitler enzim-substrat diaminobenzidin (DAB, Sigma) solüsyonunda geliştirildi. İmmünohistokimyasal olarak boyanmış bölümlerin görüntüleri, Olympus dijital mikroskobu (IX-73P1F, Olympus, Japonya) tarafından alınmıştır.

istatistiksel analiz

Sonuçlar, en az üç bağımsız deney için ortalama ± SD olarak ifade edildi ve SPSS 18.0 yazılımı kullanılarak analiz edildi. Morris su labirenti eğitim görevindeki kaçış gecikmesi ve yüzme hızındaki grup farklılıkları, tedavi ve eğitim günü faktörleri olmak üzere tekrarlanan ölçümlerle iki yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edildi. Diğer veriler, tek yönlü ANOVA ve ardından bir post-hoc Tukey testi ile analiz edildi. 0.05'ten küçük P değeri anlamlı kabul edildi.

SONUÇLAR

Resveratrol ve CR, AAPH kaynaklı yaşlanmayı ve apoptozu inhibe etme ve D-gal uygulamasının neden olduğu yaşla ilişkili bilişsel bozukluğu geri getirme yetenekleriyle kanıtlandığı gibi, hem in vitro hem de in vivo benzer yaşlanma karşıtı aktiviteler sergiledi. Yaşlanma karşıtı mekanizmaları arasında TE aktivitesinin düzenlenmesi, oksidatif hasarın azaltılması ve SIRT1 yolunun düzenlenmesi yer alıyordu. Genel olarak, in vitro 10 uM resveratrol ve in vivo yüksek doz resveratrol, nispeten daha güçlü yaşlanma karşıtı aktiviteler ve uyarıcı SIRT1 seviyeleri sergiledi. Bu sonuçlar, resveratrolün bir CR mimetiği olarak potansiyelini gösterdi.

Kısaltmalar

AAPH, 2,2'-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorür; AMPK, adenosin monofosfatla aktive olan protein kinaz; ANOVA, varyans analizi; AROS, SIRT1'in aktif düzenleyicisi; CR, kalori kısıtlaması; meme kanseri 1'de silinen DBC1; D-gal, D-galaktoz; FBS, fetal sığır serumu; Foxo3a, çatallı kutu 3a; HuR, Hu antijeni R; MEM, minimum temel ortam; PBS, fosfat tamponlu salin; PGC-1 , peroksizom proliferatörü ile aktive olan reseptör G koaktivatörü-1 ; RES, resveratrol; SA -gal, yaşlanmayla ilişkili -galaktosidaz; SD, standart sapmalar; SIRT1, susturucu bilgi regülatörü; TE, telomeraz.

Yazar Katkıları

Araştırmanın konsepti ve tasarımı: Gang Chen; verilerin elde edilmesi, analizi ve yorumlanması: Juan Li, Xia Chun Zhang, Yi-Mei Liu; entelektüel içerik için el yazmasının finansmanını ve kritik revizyonunu sağlamak: Gang Chen, Ke-Li Chen; taslağı yazan: Juan Li. Tüm yazarlar bu yazının yayınlanmasını okumuş ve onaylamıştır. TEŞEKKÜR VE FİNANSMAN

Bu çalışma Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2016M601237), Doğa Bilimleri Vakfı projesi (81373704, 30873292) tarafından finanse edilmiştir.

ÇIKAR ÇATIŞMALARI

Katılan tüm yazarlardan çıkar çatışması yoktur.

REFERANSLAR

1. Ramis MR, Esteban S, Miralles A, Tan DX, Reiter RJ. Kalkorik kısıtlama, resveratrol ve melatonin: SIRT1'in rolü ve yaşlanma ve ilgili hastalıklar üzerindeki etkileri. Mech Yaşlanma Dev. 2015; 146–148:28–41.

2. Colman RJ, Beasley TM, Kemnitz JW, Johnson SC, Weindruch R, Anderson RM. Kalori kısıtlaması, rhesus maymunlarında yaşa bağlı ve tüm nedenlere bağlı ölümleri azaltır. Nat Komün. 2014; 5:3557.

3. Sohal RS, Weindruch R. Oksidatif stres, kalori kısıtlaması ve yaşlanma. Bilim. 1996; 273:59–63.

4. Testa G, Biasi F, Poli G, Chiarpotto E. Kalori kısıtlaması ve diyet kısıtlaması taklidi: sağlıklı yaşlanmayı ve yaşam süresini uzatmak için bir strateji. Curr Ecz. Des. 2014; 20:2950–77.

5. Lane MA, Roth GS, Ingram DK. Kalori kısıtlama taklitleri: biyogerontoloji için yeni bir yaklaşım. Yöntemler Mol Biol. 2007; 371:143–9.

6. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG, et al. Resveratrol, yüksek kalorili bir diyetle farelerin sağlığını ve hayatta kalmasını iyileştirir. Doğa. 2006; 444:337–42.

7. Lagouge M, Argmann C, Gerhart-Hines Z, Meziane H, Lerin C, Daussin F, Messadeq N, Milne J, Lambert P, Elliott P, Geny B, Laakso M, Puigserver P, et al. Resveratrol, SIRT1 ve PGC-1alfayı aktive ederek mitokondriyal işlevi iyileştirir ve metabolik hastalığa karşı korur. Hücre. 2006; 127:1109–22.

8. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin RE, Chung P, Kisielewski A, Zhang LL, Scherer B, Sinclair DA. Sirtuinlerin küçük molekül aktivatörleri, Saccharomyces cerevisiae ömrünü uzatır. Doğa. 2003; 425:191–6.

9. Kwon HS, Ott M. SIRT1'in iniş çıkışları. Trendler Biochem Sci. 2008; 33:517–25.

10. Brooks CL, Gu W. SIRT1 metabolizmayı, yaşlanmayı ve kanseri nasıl etkiler? Nat Rev Kanser. 2009; 9:123–8.

11. Harman D. Serbest radikal yaşlanma teorisi. Mutat Re. 1992; 275:257–66.

12. Mayo JC, Tan DX, Sainz RM, Lopez-Burillo S, Reiter RJ. Peroksil radikallerinin neden olduğu katalaza oksidatif hasar: melatonin ve diğer antioksidanlar tarafından fonksiyonel koruma. Serbest Radik Çöz. 2003; 37:543–53.

13. Hubackova S, Krejcikova K, Bartek J, Hodny Z. IL1- ve TGF -Nox4 sinyali, oksidatif stres ve DNA hasar tepkisi, replikatif, onkogen kaynaklı ve ilaca bağlı parakrin 'Bystander yaşlanmasının ortak özellikleridir '. Yaşlanma (Albany NY). 2012; 4:932–51. https://doi.org/10.18632/aging.100520.

14. Cui X, Zuo P, Zhang Q, Li X, Hu Y, Long J, Packer L, Liu J. Kronik sistemik D-galaktoza maruz kalma, farelerde hafıza kaybına, nörodejenerasyona ve oksidatif hasara neden olur: Koruyucu etkiler R{{ 2}}lipoik asit. J Neurosci Res. 2006; 84:647–54.

Daha fazlasını iste:

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: artı 86 15292862950